利用氨基酸分析儀對(duì)醬油中皮革水解蛋白標(biāo)志物羥脯氨酸的鑒定

彭碧寧 曾川 鐘藝園 潘亮 蔡德玲

摘要 [目的]建立一種利用氨基酸分析儀分析鑒定醬油中皮革水解蛋白標(biāo)志物羥脯氨酸的方法。[方法]選用 4-羥基-α-吡咯甲酸為參考物質(zhì)，利用氨基酸自動(dòng)分析儀法和紫外分光光度計(jì)法對(duì)醬油中L-羥脯氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定，比較這2種檢測(cè)方法測(cè)定羥脯氨酸的優(yōu)劣點(diǎn)。[結(jié)果]紫外分光光度法在羥脯氨酸的質(zhì)量濃度為1～6 mg/L與吸光度之間線性關(guān)系良好（R2=0.998 0），RSD為0.91%，分別添加 0.5、2.0、6.0 mg/L羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收率為90.0%～93.8%。氨基酸分析儀法在羥脯氨酸質(zhì)量濃度為0.5～30.0 mg/L與峰面積之間線性關(guān)系良好（R2=0.999 3），RSD為 0.75%，分別添加 0.5、10.0、20.0 mg/L羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收率為96.8%～99.7%。[結(jié)論]氨基酸分析儀法自動(dòng)化程度好，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好，適用于醬油中是否添加動(dòng)物皮革水解蛋白的鑒定和檢測(cè)，為食品安全監(jiān)管提供可靠的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 氨基酸分析儀法;皮革水解蛋白標(biāo)志物;羥脯氨酸;醬油摻假;紫外分光光度法

中圖分類號(hào) TS 264.2+1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）21-0202-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.052

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Identification of Hydrolyzed Protein Reagent Protein-Hydroxyproline in Soy Sauce Using Amino Acid Analyzer

PENG Bi-ning? ZENG Chuan? ZHONG Yi-yuan2 et al

（1. Technical Center of Gongbei Customs District P.R. China， Zhuhai，Guangdong? 519000;2.Lishui Branch of Nanhai Market Supervision Administration， Foshan，Guangdong 528200）

Abstract [Objective]To set a method for the identification of the hydrolyzed protein marker-hydroxyproline in soy sauce using an amino acid analyzer. [Method]Using 4-hydroxy-α-pyrrolecarboxylic acid as the reference substance，the content of L-hydroxyproline in soy sauce was determined by the automatic amino acid analyzer method and the ultraviolet spectrophotometer method，and the advantages and disadvantages of the two detection methods for the determination of hydroxyproline were compared.[Result]The UV spectrophotometry showed a good linear relationship between the mass concentration of hydroxyproline 1-6 mg/L and the absorbance （R2=0.998 0）， the RSD was 0.91%，and the recoveries of standard addition of 0.5， 2.0， 6.0 mg/L hydroxyproline standard solution were 90.0%-93.8%.Amino acid analyzer method had a good linear relationship between the mass concentration of hydroxyproline 0.5-30.0 mg/L and the peak area （R2=0.999 3）， the RSD was 0.75%，the spiked recovery rates of 0.5， 10.0， and 20.0 mg/L hydroxyproline standard solutions were 96.8%-99.7%.[Conclusion] The amino acid analyzer method has good automation， good reproducibility and accuracy. It is suitable for the identification and detection of whether to add animal leather hydrolyzed protein in soy sauce， and provides reliable technical support for food safety supervision.

Key words Amino acid analyzer method;Leather hydrolyzed protein marker;Hydroxyproline;Soy sauce adulteration;UV spectrophotometry

作者簡(jiǎn)介 彭碧寧（1983—），女，廣東佛山人，工程師，在讀碩士，從事食品安全研究。

收稿日期 2021-01-11

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，因其用途廣泛，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，廣受人們的喜愛(ài)。醬油調(diào)味品出現(xiàn)方興未艾的增長(zhǎng)勢(shì)頭，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)也日趨激烈。醬油的主要原料經(jīng)過(guò)曲霉、酵母和氨基酸多種微生物的降解作用，產(chǎn)生一系列的生化反應(yīng)，構(gòu)成了營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的醬油制品，這種便稱為釀造醬油。而配制醬油是以釀造醬油為主體，允許在一定的范圍內(nèi)添加酸水解植物蛋白的液體調(diào)味品。

醬油的釀造成本并不會(huì)很高，但由于許多非法企業(yè)希望獲得更大的經(jīng)濟(jì)收益，便利用摻假醬油（在醬油中偷偷摻入動(dòng)物水解蛋白）代替高品質(zhì)的釀造醬油。非法商販?zhǔn)褂脛?dòng)物蛋白質(zhì)如動(dòng)物內(nèi)臟和殘羹剩飯生產(chǎn)水解蛋白質(zhì)來(lái)制造摻假醬油，甚至發(fā)酵垃圾、頭發(fā)、皮鞋的下腳料以產(chǎn)生氨基酸，表面上達(dá)到釀造醬油的蛋白質(zhì)質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。事實(shí)上，產(chǎn)生的氯丙醇將對(duì)人們?cè)斐蓢?yán)重傷害[1]。為保證醬油相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，如何檢測(cè)醬油是否添加了動(dòng)物水解蛋白迫在眉睫。

目前檢測(cè)羥脯氨酸基本使用紫外分光光度計(jì)法[2-6]。國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn) GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》也是利用紫外分光光度計(jì)法[7]。而氨基酸分析儀法大多用來(lái)檢測(cè)乳及乳制品是否添加動(dòng)物水解蛋白的鑒定[8-11]。氨基酸自動(dòng)分析儀尚未有較大普及范圍，其費(fèi)用較高，而且存在需要較多緩沖液，普通實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)，比較局限于精密檢測(cè)研究的實(shí)驗(yàn)室。而且目前針對(duì)研究利用氨基酸分析儀法鑒定醬油制品的羥脯氨酸的文獻(xiàn)和科學(xué)試驗(yàn)非常少。筆者選用 4-羥基-α-吡咯甲酸為參考物質(zhì)，采用氨基酸自動(dòng)分析儀法和紫外分光光度計(jì)法2種檢測(cè)方法對(duì)醬油中L-羥脯氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定，并研究這2種方法的精密度、加標(biāo)回收率、優(yōu)劣點(diǎn)、異同點(diǎn)等，探討對(duì)羥脯氨酸的鑒定在區(qū)分摻假醬油中的應(yīng)用價(jià)值[12]。

1 氨基酸分析儀法試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)原理 醬油中的蛋白質(zhì)被鹽酸水解成游離氨基酸，經(jīng)離子交換柱分離后，與茚三酮溶液反應(yīng)生成顯色反應(yīng)，然后用氨基酸分析儀測(cè)定游離氨基酸含量。羥脯氨酸是肌肉膠原蛋白（動(dòng)物氨基酸）的主要成分之一，其含量為正常膠原蛋白的13.4%，在彈性蛋白中含量較低。L-羥脯氨酸不存在于其他蛋白質(zhì)中，包括植物水解蛋白質(zhì);它被認(rèn)為是膠原蛋白中的特征性氨基酸。羥脯氨酸有L-羥脯氨酸和 D-羥脯氨酸2種，但D-羥脯氨酸在自然界中不存在。因此，L-羥脯氨酸含量的檢測(cè)已成為衡量動(dòng)物氨基酸存在的重要指標(biāo)。所以，一旦在醬油中檢測(cè)出羥脯氨酸，就可以認(rèn)為醬油添加了動(dòng)物水解蛋白。

1.2 儀器

高速氨基酸自動(dòng)分析儀（L-8900，日本日立公司）;全自動(dòng)氮吹濃縮儀（TurboVapⅡ，美國(guó)Caliper公司）;電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;分析天平（Sartorius BT224S型，德國(guó)賽多利斯公司）;安瓿瓶（山西宏光醫(yī)藥公司）;酒精噴燈（福州北玻實(shí)驗(yàn)儀器公司）;高純氮?dú)馄浚ㄉ綎|天海有限公司）。

1.3 試劑

羥脯氨酸（4-羥基-α-吡咯甲酸），北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司;茚三酮溶液，日本和光純藥工業(yè)公司;MCIL-8500 緩沖溶液（L-8500-PH-KIT 和 L-8500-PF-KIT），三菱化學(xué)公司;鹽酸、乙醇均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。樣品稀釋液：1∶600 HCL溶液。5%乙醇溶液：在1 L的容量瓶中加入900 mL的蒸餾水，再加入50 mL的乙醇，充分混勻。所用水為超純水。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 稱樣。稱取一定量的醬油（精確至0.000 1 g）于潔凈安瓿瓶中或者使用200 μL的移液槍吸取醬油于安瓿瓶中。

1.4.2 水解。稱取樣品后，加入6 mol/L的鹽酸溶液至安瓿瓶的2/3處，將安瓿瓶口置于酒精噴燈最高溫處灼燒封口。隨后將其放入110 ℃的電熱恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h，取出，冷卻室溫。

1.4.3 稀釋。利用磨砂片將水解好的安瓿瓶打開(kāi)，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的比色管中，并用純凈水定容至50 mL，混勻。

1.4.4

濃縮。取 1 mL上述樣品稀釋液至氮吹管中，置于自動(dòng)氮吹濃縮儀中吹干。氮吹儀的溫度設(shè)置為 60 ℃。氮吹是為了將6 mol/L的鹽酸吹干，因?yàn)榘被岱治鰞x有不同pH的梯度洗脫流程，水解時(shí)所加的 6 mol/L鹽酸濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致分析出來(lái)的數(shù)據(jù)有較大誤差，并且氮吹的過(guò)程可以將氨基酸進(jìn)行濃縮。

1.4.5

上機(jī)分析。加入2 mL的樣品稀釋液，將其調(diào)至與緩沖溶液接近的pH。經(jīng) 0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，備用上機(jī)分析。

1.5 儀器條件

色譜柱為4.6 mm×60 mm填充柱，陽(yáng)離子樹(shù)脂填充;色譜柱溫度57 ℃;反應(yīng)器溫度135 ℃;第1通道檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm;第2通道檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm;進(jìn)樣體積20 μL;分析時(shí)間53 min。

該試驗(yàn)改進(jìn)的分析程序見(jiàn)表1。使用53 min分析程序，這樣較充分地完成對(duì)分離柱的洗脫、再生、平衡效果，也較好地保證了對(duì)氨基酸的分離效果，又大量地節(jié)省了價(jià)格昂貴的茚三酮試劑，僅使用原用量的1/10。壓力泵1和泵2色譜圖見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理及儀器條件的優(yōu)化

按照 GB 5009.124—2016標(biāo)準(zhǔn)方法中鹽酸水解的試驗(yàn)步驟是用水解管冷凍后充氮?dú)夥饪冢?10 ℃水解22 h。但在實(shí)際操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用上述方法密封性不好，甚至在水解的過(guò)程中，水解管中的液體極易泄露出來(lái)，造成鹽酸的揮發(fā)和烘箱的腐蝕。于是該試驗(yàn)優(yōu)化水解的試驗(yàn)步驟，利用酒精噴燈在高溫灼燒時(shí)對(duì)安瓿瓶進(jìn)行密封封口。

氨基酸分析儀的分析程序設(shè)置和緩沖液的配制是試驗(yàn)的關(guān)鍵之一，該試驗(yàn)受緩沖液的pH影響較大，pH的不同可能會(huì)導(dǎo)致最后的分析色譜圖的差異。將緩沖液按說(shuō)明書中的配方配制好后，應(yīng)用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，以免緩沖液中的雜質(zhì)堵塞氨基酸分析儀的細(xì)小管路。日立L-8900原來(lái)的分析程序并不能把每種氨基酸完全分離，所以必須進(jìn)行優(yōu)化B1、B2、B3、B4的切換時(shí)間。通過(guò)一系列的微調(diào)程序，調(diào)整出最適宜的分析程序。

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取100 mg羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL容量瓶中，加超純水定容，搖勻待用。吸取上述配制好的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，加超純水定容，待上儀器分析。以羥脯氨酸濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2可知，羥脯氨酸線性回歸方程為y=33 247x+3 645.8（R2=0.999 3），在羥脯氨酸質(zhì)量濃度為0.5～30.0 mg/L時(shí)與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖3。

2.3 精密度分析

使用配制好的1 mg/mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取1.5 mL于100 mL容量瓶中，稀釋搖勻。分別取2 mL上述配制好的15 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液于6個(gè)進(jìn)樣瓶中。平行測(cè)定6個(gè)進(jìn)樣瓶。分析得出峰面積RSD為0.75%，表明氨基酸分析儀試驗(yàn)方法的精密度良好。

2.4 加標(biāo)回收率 分別取3種不同品牌的醬油樣品，根據(jù)“1.4”試驗(yàn)步驟，分別測(cè)定樣品中羥脯氨酸含量。再在測(cè)定完成后的樣品中分別在樣品1、2、3中添加1 mg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液250.00、0.50、1.00 mL，樣品加標(biāo)后再稀釋10倍。最后使加標(biāo)樣品溶液的濃度分別為0.5、10.0、20.0 mg/L。依次進(jìn)行上機(jī)分析測(cè)定，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 加標(biāo)回收率為96.8%～99.7%，平均加標(biāo)回收率為98.4%。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

分別取市售不同品牌的醬油樣品，按“1.4”方法進(jìn)行處理后上機(jī)分析，分別用該試驗(yàn)的氨基酸分析儀法和參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》紫外分光光度計(jì)法測(cè)定醬油樣品中羥脯氨酸含量，得到的數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。1號(hào)醬油樣品和2號(hào)醬油樣品色譜圖見(jiàn)圖4。

為了更準(zhǔn)確判斷氨基酸自動(dòng)分析儀法數(shù)據(jù)和紫外分光光度計(jì)法數(shù)據(jù)的差異性，選擇了羥脯氨酸含量較高的魚膠原蛋白肽粉進(jìn)行2種方法的測(cè)定。結(jié)果顯示，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定魚膠原蛋白肽粉中羥脯氨酸含量為13.588 μg/mL，使用氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定魚膠原蛋白肽粉中羥脯氨酸含量為15.681 μg/mL。從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，無(wú)論是羥脯氨酸含量高低，相同樣品使用氨基酸分析儀檢測(cè)值高于紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)值。氨基酸分析儀的精密度和加標(biāo)率均比紫外分光光度計(jì)好，其測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。魚膠原蛋白肽粉 VIS2 整體色譜圖見(jiàn)5。

2.6 輔助鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，釀造醬油和配制醬油在氨基酸組成成分上有明顯的差異，所以利用氨基酸自動(dòng)分析儀確定氨基酸組分的比例關(guān)系，不僅可以檢測(cè)其中是否含有羥脯氨酸，還可以作為區(qū)分釀造醬油和非釀造醬油鑒別體系的方法之一，有效打擊市場(chǎng)以次充好的現(xiàn)象。

以2號(hào)醬油樣品為例，利用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)出16種氨基酸數(shù)據(jù)見(jiàn)表 這16種氨基酸均在第1通道檢出。由表4可知，醬油中谷氨酸的含量較高，而半胱氨酸最低，天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸含量在谷氨酸和半胱氨酸之間。與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的相符，這些氨基酸特征指標(biāo)及比例關(guān)系可輔助判別醬油中是否含有皮革水解蛋白標(biāo)志物——羥脯氨酸。2號(hào)醬油樣品VIS1整體色譜圖見(jiàn)圖6。

3 結(jié)論與討論

該研究建立了一種利用氨基酸自動(dòng)分析儀分析鑒定醬油中皮革水解蛋白標(biāo)志物羥脯氨酸的方法。通過(guò)改進(jìn)食品標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定氨基酸的前處理水解試驗(yàn)步驟以及優(yōu)化儀器條件，設(shè)計(jì)了醬油中羥脯氨酸檢測(cè)的試驗(yàn)流程。同時(shí)通過(guò)紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行驗(yàn)證，確定氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定的數(shù)據(jù)是有效可信的。

氨基酸自動(dòng)分析儀可實(shí)現(xiàn)羥脯氨酸與其他氨基酸完全洗脫分離，保留時(shí)間與醬油中的其他氨基酸不重疊，同時(shí)也能測(cè)定和分析醬油中其他水解氨基酸。該方法準(zhǔn)確，對(duì)比其他方法前處理過(guò)程更為簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，無(wú)須專人觀察儀器的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，靈敏度高，精確度高，變異系數(shù)小，能避免氨基酸衍生物的多樣性，能夠快速地測(cè)定羥脯氨酸的含量。該方法具有良好的線性關(guān)系、精密度以及回收率。但是氨基酸自動(dòng)分析儀成本較高，維護(hù)費(fèi)用較為昂貴，會(huì)限制中小型企業(yè)和基層實(shí)驗(yàn)室的使用。

在醬油的生產(chǎn)過(guò)程中，如嚴(yán)格按照強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 2717—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[15] 和 GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[16]的規(guī)定執(zhí)行，則不存在食品超標(biāo)、微生物污染等的安全性問(wèn)題。但是非法商販會(huì)使用水解蛋白制造醬油，所以對(duì)此類醬油的鑒別是十分必要的。目前市面上的醬油僅從檢測(cè)氨基酸態(tài)氮是否達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量醬油的品質(zhì)，要對(duì)其來(lái)源進(jìn)行鑒定，可以對(duì)醬油的氨基酸組分進(jìn)行分析，進(jìn)一步地確定醬油是否摻假。

在檢測(cè)摻假的過(guò)程中不能單一用羥脯氨酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，這樣不具有可靠性。而是需要結(jié)合醬油中含氯化合物、氨基酸組成成分分析、羥脯氨酸含量、香味成分指紋圖譜、銨鹽含量分析、過(guò)氧化值等方面的分析，形成一個(gè)聯(lián)合特征指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的鑒別體系。同時(shí)要打擊醬油摻偽日益嚴(yán)重的現(xiàn)象，不僅需要有關(guān)檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)，還需有關(guān)政府部門加大執(zhí)法力度，加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)廠家的監(jiān)管，嚴(yán)懲不法商販，才能有效地解決人為添加皮革水解物造成的醬油安全性問(wèn)題[17]。

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