酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)除草劑異丙甲草胺

張熾堅(jiān)，王 強(qiáng)，唐秋實(shí)，劉英菊，孫遠(yuǎn)明，唐允健，雷紅濤,*

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

近年來，除草劑在我國用量逐漸增加，極大地提高了勞動(dòng)效率和勞動(dòng)產(chǎn)量，但部分除草劑在環(huán)境中穩(wěn)定性強(qiáng)，殘留時(shí)間久，對(duì)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全產(chǎn)生危害或風(fēng)險(xiǎn)，逐漸引起人們關(guān)注[1]。異丙甲草胺(metolachlor)化學(xué)名稱為N-2-乙基-6-甲基苯基-N-(1-甲基-2甲氧基乙基)氯乙酰苯胺，是我國目前生產(chǎn)和使用量最大的除草劑品種之一，其殘留可通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體或人體[2]，雖未有現(xiàn)實(shí)例子證明其致癌性[3]，但美國環(huán)境保護(hù)局將其歸類為潛在致癌性物質(zhì)。國標(biāo)GB/T 5009.174—2003《花生、大豆中異丙甲草胺殘留量的測(cè)定》規(guī)定異丙甲草胺在花生和大豆中的最高殘留限量為0.5mg/kg，農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 775—2004《玉米中烯唑醇、甲草胺、溴苯腈、氰草津、麥草畏、二甲戊樂靈、氟樂靈、克百威、順式氰戊菊酯、噻酚磺隆及異丙甲草胺最大殘留限量》則規(guī)定異丙甲草胺在玉米籽粒中的最高殘留限量為0.1mg/kg。目前，針對(duì)異丙甲草胺的分析方法主要有薄層色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]等。薄層色譜法的靈敏度比較低；高效液相色譜法和氣相色譜法靈敏度高、測(cè)定準(zhǔn)確，是目前測(cè)定異丙甲草胺的主要方法，但儀器設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)技能要求高。

免疫分析法以其靈敏、準(zhǔn)確、前處理簡單、高通量等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)[7]。但是，除草劑作為小分子半抗原物質(zhì)，不具有免疫原性，需要化學(xué)衍生或重頭合成合適的半抗原，然后還需化學(xué)偶聯(lián)制備出人工抗原才能免疫動(dòng)物，除草劑抗體的制備過程較大分子全抗原物質(zhì)的抗體制備步驟更為繁復(fù)，其中半抗原的設(shè)計(jì)、合成及人工全抗原的制備成為影響除草劑抗體制備、免疫分析方法建立的關(guān)鍵。Schlaeppi等[8]采用重頭合成法，經(jīng)過六步化學(xué)反應(yīng)，獲得苯環(huán)上帶一個(gè)羧基的異丙甲草胺半抗原，盡管制備出了抗體，但半抗原合成步驟過于復(fù)雜，對(duì)生物分析工作者難度較大，不易實(shí)施；Feng等[9]亦建立了異丙甲草胺的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)限只有10ng/mL，但沒有進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)；而國內(nèi)尚未見關(guān)于異丙甲草胺免疫檢測(cè)方法的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以異丙甲草胺為對(duì)象，使用3-巰基丙酸(3-MPA)為衍生劑，用一步法合成含羧基的異丙甲草胺半抗原(MMPA)，可大大簡化半抗原的制備步驟，隨后將半抗原偶聯(lián)載體蛋白后免疫動(dòng)物以獲得異丙甲草胺多克隆抗體，進(jìn)而建立異丙甲草胺間接競爭酶聯(lián)免疫吸附(indirective competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)分析方法，并將該方法應(yīng)用于環(huán)境水樣品中異丙甲草胺的檢測(cè)，以期為異丙甲草胺的快速檢測(cè)提供一種新的生物分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙甲草胺(97.7%) 山東濱州農(nóng)藥廠；牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 上海伯奧生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體 武漢博士德生物工程有限公司；二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、3-巰基丙酸(3-MPA)、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DRX-400/600核磁共振儀 德國Burker公司；UV2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；MK3多功能酶標(biāo)儀、Wellwash MK2洗板機(jī) 美國Thermo公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 江蘇海門市三和通明玻璃儀器總廠；6K-15高速冷凍離心機(jī) 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的合成與鑒定

1.3.1.1 異丙甲草胺半抗原的合成

將170 mg ( 0 . 599 mmol ) 異丙甲草胺、62mg(0.0593mmol)3-MPA、110mg(1.964mmol)KOH依次加入10mL乙醇溶液中，攪拌狀態(tài)下回流4h，過濾、減壓脫溶得到異丙甲草胺半抗原(MMPA)粗品，用8mL 5%的NaHCO3溶液溶解粗品，然后用6mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至3.0，乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合并有機(jī)相，冰水洗(20mL×3)，有機(jī)相用無水Mg2SO4干燥，最后硅膠層析純化(展開劑為苯-1,4-二氧六環(huán)-冰乙酸(90：10：1，V/V))，得MMPA純品150.3mg，得率為71%。1H-NMR (600MHz，Methanol-d4，TMS)：δ 1.23(d，J=7.8Hz，3H)，1.25(t，J=7.2Hz，3H)，2.20(s，3H)，2.59(t，J=6.6Hz，2H)，2.63(m，2H)，2.79(t，J=7.8Hz，2H)，3.31(s，3H)，3.47(m，1H)，3.66(dd，J1=10.2Hz, J2=6.0Hz，1H)，3.83(s，2H)，4.45(m，1H)，7.16(d，J=7.8Hz，1H)，7.23(d，J=7.2Hz，1H)，7.28(dd，J=7.8Hz，J=7.2Hz，1H)。

圖 1 異丙甲草胺半抗原的合成路線Fig.1 Synthesis of metolachlor hapten MMPA

1.3.1.2 異丙甲草胺人工抗原的制備與鑒定

采用活潑酯法[10]將異丙甲草胺半抗原與BSA偶聯(lián)制備出免疫抗原MMPA-BSA，與OVA偶聯(lián)制備包被抗原MMPA-OVA，產(chǎn)物用0.9%生理鹽水在4℃條件下透析3d以除掉未反應(yīng)的半抗原，之后紫外光譜法鑒定半抗原與載體蛋白是否有效偶聯(lián)[11]，分裝并于-20℃保存。

1.3.2 異丙甲草胺抗體的制備

選用2kg左右新西蘭大白兔，初次免疫時(shí)將500μg免疫原與弗氏完全佐劑等體積乳化后，進(jìn)行背部多點(diǎn)注射。每隔4周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫的乳化劑選擇不完全佐劑。4次免疫后8d取全血，1mL分裝后于－20℃保存。

1.3.3 間接競爭ELISA的建立

用棋盤滴定法確定最佳包被原質(zhì)量濃度和抗體工作質(zhì)量濃度[12]，抗原抗體用量少的實(shí)驗(yàn)組合為最佳工作條件，建立間接ELISA檢測(cè)方法[13-14]。每孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度梯度的異丙甲草胺和優(yōu)化好的一定質(zhì)量濃度的抗體，采用Origin 7.5軟件的四參數(shù)Logistic模型擬合，異丙甲草胺的半抑制濃度定義為50%抑制濃度(IC50)、檢出限(limit of detection，LOD)定義為10%的抑制濃度(IC10)，檢測(cè)范圍定義為20%～80%抑制濃度(IC20～I(xiàn)C80)[15]。

1.3.4 特異性評(píng)價(jià)

以結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率來評(píng)價(jià)抗體特異性[16]。采用間接競爭ELISA程序在同等條件下依次建立異丙甲草胺結(jié)構(gòu)類似物的ELISA曲線，求出各自的抑制率為50%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，用IC50表示。計(jì)算交叉反應(yīng)率：

CR/%= [IC50(異丙甲草胺)/IC50(結(jié)構(gòu)類似物)] ×100。

1.3.5 水樣采集、分析和添加回收實(shí)驗(yàn)

水樣采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄱陽湖，添加異丙甲草胺質(zhì)量濃度為20、40、60、80ng/mL，經(jīng)過濾紙過濾后，用所建立的icELISA方法對(duì)水樣中的異丙甲草胺進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 異丙甲草胺抗原合成

異丙甲草胺分子質(zhì)量只有283.8D，本身不具備免疫原性，屬于半抗原物質(zhì)，不能直接用于動(dòng)物免疫。對(duì)于半抗原物質(zhì)制備抗體，首先需要將其與載體蛋白連接，制備出人工完全抗原[17]。由于異丙甲草胺分子上沒有合適的活性基團(tuán)，很難直接與蛋白偶聯(lián)，因此需要通過一定長度的手臂結(jié)構(gòu)進(jìn)行蛋白與半抗原的連接，以便半抗原更好暴露給免疫細(xì)胞識(shí)別；為了盡可能保留異丙甲草胺大部分立體特征和電子特性，偶聯(lián)所需的含羧基空間手臂除了從氯原子處衍生外，也可從N-乙氧丁基處衍生。但后者衍生方法會(huì)導(dǎo)致側(cè)鏈上減少一個(gè)強(qiáng)吸電子的氧原子，可能導(dǎo)致半抗原的電荷分布狀態(tài)發(fā)生變化，與異丙甲草胺的電性相似性降低，而且合成路線復(fù)雜，故本實(shí)驗(yàn)未采用?本實(shí)驗(yàn)選擇碳鏈較短的廉價(jià)3-MPA作為衍生劑，一步反應(yīng)即可完成，半抗原的合成路線非常簡便，且是母化合物的Cl原子被替換成O原子，Cl和O電負(fù)性接近，較好的保持了目標(biāo)分子原有特征[18-19]。經(jīng)核磁鑒定表明半抗原合成成功。

將半抗原與BSA共價(jià)結(jié)合制備免疫原，經(jīng)紫外掃描鑒定(圖2)，半抗原在波長250～260nm處有較強(qiáng)吸收，BSA在250nm波長處幾乎無吸收，而MMPA-BSA在250nm波長處表現(xiàn)出一定吸收；此外半抗原在230nm波長處有強(qiáng)吸收峰，BSA在210nm波長處左右有強(qiáng)吸收峰，而MMPA-BSA的強(qiáng)吸收峰處于波長210nm～230nm之間，其吸收曲線既不同于BSA也不同于半抗原的吸收曲線，是一種BSA和半抗原的累加吸收特征曲線。因?yàn)橥肝龊蟛淮嬖谟坞x的異丙甲草胺半抗原，所以這種累加的吸收特征為MMPA-BSA偶合物所貢獻(xiàn)出，而非游離異丙甲草胺半抗原和BSA累加貢獻(xiàn)，說明人工抗原MMPA-BSA合成成功[16]。同理推斷包被抗原MMPA-OVA也合成成功(圖3)。

圖 2 MMPA、BSA、BSA-MMPA的紫外吸收曲線Fig.2 UV spectrum of MMPA, BSA, BSA-MMPA

圖 3 MMPA、OVA、MMPA-OVA的紫外吸收曲線Fig.3 UV spectrum of MMPA, OVA, OVA-MMPA

2.2 間接競爭ELSIA法的建立

2.2.1 抗體效價(jià)及工作質(zhì)量濃度

[12]及棋盤滴定法測(cè)定抗體效價(jià)與工作質(zhì)量濃度。本次實(shí)驗(yàn)免疫了兩只兔子，其中一只兔的效價(jià)很高，達(dá)到1/10000，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)工作均用此高效價(jià)兔血清。棋盤滴定確定包被抗原的工作質(zhì)量濃度為0.05μg/mL，抗血清稀釋倍數(shù)為10000倍。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

確定好包被抗原工作質(zhì)量濃度、抗血清稀釋倍數(shù)后，制作異丙甲草胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其IC50為34.3ng/mL，最低檢測(cè)限IC10為6.3ng/mL，檢測(cè)范圍(IC20～I(xiàn)C80)為12.3～99.2ng/mL，并且在檢測(cè)范圍內(nèi)，線性方程為y=－0.8079x＋2.0712，R2為0.996。該靈敏度和檢測(cè)范圍可以滿足GB/T 5009.174—2003及NY 775—2004對(duì)異丙甲草胺最高殘留限量的檢測(cè)要求。

2.2.3 特異性評(píng)價(jià)

抗體特異性用交叉反應(yīng)率來表示(表1)，交叉反應(yīng)率越低，抗體特異性越強(qiáng)?？贵w分別與S-(-)-異丙甲草胺、丁草胺、丙草胺、乙草胺、異丙草胺、甲磺隆、莠去津進(jìn)行icELISA檢測(cè)。抗體與丁草胺、丙草胺、乙草胺的交叉反應(yīng)率為0.5%，與異丙草胺、甲磺隆、莠去津等幾乎無交叉反應(yīng)，特異性很好。

表1 抗體與異丙甲草胺結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of metolachlor antibody towards other related compounds

2.2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

在水樣中添加質(zhì)量濃度為20、40、60、80ng/mL水平下，異丙甲草胺的平均回收率為89.5%～107.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.2%～14.5%(表2)，表明該法準(zhǔn)確度和精密度都較高。

表2 異丙甲草胺在水樣中的添加回收實(shí)驗(yàn)(n=8)Table 2 Recovery of metolachlor in water samples (n=8)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用一步法合成異丙甲草胺半抗原，大大簡化了半抗原的制備方法，成功制備出特異性、靈敏度較好的異丙甲草胺抗體。利用所獲抗體，建立了一種特異性檢測(cè)除草劑異丙甲草胺的icELISA方法，將該法用于添加水樣檢測(cè)，結(jié)果可靠、靈敏、簡便，可用于環(huán)境水樣中異丙甲草胺的分析與檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 屠海云, 姜荷, 李瑋. 氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定糧谷中5種除草劑殘留[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(16)： 217-219.

[2] 梅梅, 杜振霞, 陳蕓. QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定土壤中5種常用除草劑[J]. 分析化學(xué), 2011(11)： 1659-1664.

[3] LAWRUK T S, LACHMAN C E, JOURDAN S W, et al. Determination of metolachlor in water and soil by a rapid magnetic particle-based ELISA[J]. J Agr Food Chem, 1993, 41(9)： 1426-1431.

[4] QUEIROZ M E C, LANCAS F M. Analytical methods for the determination of alachlor, metolachlor, simazine and atrazine mobility in soils[J]. Journal of Environmental Science and Health： Part B, 2000, 35(4)： 467-476.

[5] VRYZAS Z, TSABOULA A, MOURKIDOU E P. Determination of alachlor, metolachlor, and their acidic metabolites in soils by microwave-assisted extraction (MAE) combined with solid phase extraction (SPE) coupled with GC-MS and HPLC-UV analysis[J]. Journal of Separation Science, 2007, 30(15)： 2529-2538.

[6] GAYNOR J D, MACTAVISH D C, HAMILL A S. A GC/MSD method for the analysis of metolachlor in cabbage, broccoli, and tomato[J]. Commun Soil Sci Plan, 1992, 23(13/14)： 1549-1558.

[7] WANG Yuzhen, YANG Hong, WANG Bin, et al. A sensitive and selective direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for fast detection of SudanⅠin food samples[J]. J Sci Food Agr, 2011, 91(10)： 1836-1842.

[8] SCHLAEPPI J M, MOSER H, RAMSTEINER K. Determination of metolachlor by competitive enzyme immunoassay using a specific monoclonal antibody[J]. J Agr Food Chem, 1991, 39(8)： 1533-1536.

[9] FENG P C C, HORTON S R, SHARP C R. A general method for developing immunoassays to chloroacetanilide herbicides[J]. J Agr Food Chem, 1992, 40(2)： 211-214.

[10] WANG Lili, SANG Yaxin, WANG Xianghong. Enzyme-linked immunosorbent assay for okadaic acid： investigation of analytical conditions and sample matrix on assay performance[J]. J Aoac Int, 2011, 94(5)： 1531-1536.

[11] GUO Ming, PANG Shuoquan. Synthesis characterization and immunoassay of the artificial antigen for cadmium(II)[J]. Asian J Chem, 2009, 21(7)： 5621-5631.

[12] WANG Junping, YU Guichun, SHENG Wei, et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based a monoclonal antibody for the detection of pyrethroids with phenoxybenzene multiresidue in river water[J]. J Agr Food Chem, 2011, 59(7)： 2997-3003.

[13] ZHAO Jing, LI Gang, YI Guoxiang, et al. Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) and simplified icELISA for small molecules[J]. Anal Chim Acta, 2006, 571(1)： 79-85.

[14] SHENG Jianwu, HE Miao, SHI Hanchang. A highly specific immunoassay for microcystin-LR detection based on a monoclonal antibody[J]. Anal Chim Acta, 2007, 603(1)： 111-118.

[15] LEI Hongtao, SHEN Yudong, SONG Lijun, et al. Hapten synthesis and antibody production for the development of a melamine immunoassay[J]. Anal Chim Acta, 2010, 665(1)： 84-90.

[16] LEI Hongtao, LIU Jin, SONG Lijun, et al. Development of a highly sensitive and specific immunoassay for determining chrysoidine, a banned dye, in soybean milk film[J]. Molecules, 2011, 16(8)： 7043-7057.

[17] PARRA J, MERCADER J V, AGULLO C, et al. Generation of anti-azoxystrobin monoclonal antibodies from regioisomeric haptens functionalized at selected sites and development of indirect competitive immunoassays[J]. Anal Chim Acta, 2012, 715： 105-112.

[18] YE Jiangqiang, SHAO Hongxia, MA Dingyuan, et al. A monoclonalantibody-based ELISA for the detection of human FADD (fasassociated death domain)[J]. Biotechnol Appl Bioc, 2008, 50(3/4)： 143-146.

[19] KIM Y J, CHO Y A, LEE H S, et al. Investigation of the effect of hapten heterology on immunoassay sensitivity and development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the organophosphorus insecticide fenthion[J]. Anal Chim Acta, 2003, 494(1/2)： 29-40.