染菌培養(yǎng)干辣椒揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析及變化特征

丁筑紅，劉 海，鄭文宇，王知松

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

我國(guó)辣椒產(chǎn)量居全球之首，產(chǎn)值在全國(guó)各類(lèi)蔬菜中居于首位[1]。干辣椒是成熟紅辣椒經(jīng)自然或人工干制后的產(chǎn)品，是日常餐桌食品、風(fēng)味食品、調(diào)味品生產(chǎn)中的主要原料，目前生產(chǎn)主要采用自然干制和簡(jiǎn)易烘房干制技術(shù)，包裝貯藏措施簡(jiǎn)單粗放，極易染菌，導(dǎo)致在貯藏期出現(xiàn)大量變質(zhì)椒和變色“花殼”椒[2]，其中細(xì)菌主要以桿菌為主，真菌主要是曲霉屬和根霉屬，其中黑曲霉最易污染[3]。目前，國(guó)內(nèi)外在辣椒及辣椒加工中進(jìn)行風(fēng)味品質(zhì)研究報(bào)道不多[4]，主要針對(duì)鮮椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取方法、風(fēng)味化合物組成、風(fēng)味描述進(jìn)行相關(guān)研究，而干制辣椒風(fēng)味化合物分析報(bào)道則主要涉及不同處理干辣椒產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)提取方法、風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成及風(fēng)味特征研究[5-11]。生產(chǎn)中干辣椒原料帶菌量大，而微生物對(duì)干辣椒風(fēng)味品質(zhì)影響方面缺乏關(guān)注和研究。電子鼻是根據(jù)仿生學(xué)原理，由傳感器陣列和自動(dòng)化模式識(shí)別系統(tǒng)所組成。它是一種新穎的分析、識(shí)別和檢測(cè)復(fù)雜氣味和大多數(shù)揮發(fā)性成分的儀器。在食品生產(chǎn)中，可應(yīng)用于乳品和肉制品品質(zhì)監(jiān)控[12-13]。然而，采用電子鼻檢測(cè)辣椒風(fēng)味的相關(guān)報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用(headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)風(fēng)味化合物分析技術(shù)，結(jié)合電子鼻檢測(cè)技術(shù)，探討主要污染菌對(duì)干辣椒接種培養(yǎng)后干椒揮發(fā)性風(fēng)味化合物構(gòu)成及風(fēng)味品質(zhì)的變化特征，全面把握干椒染菌前后以及各菌株染菌樣品間風(fēng)味差異性，有利于全面評(píng)價(jià)干椒品質(zhì)，并為辣椒生產(chǎn)加工中品質(zhì)控制提供更多有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

貴陽(yáng)市花溪區(qū)黨武鄉(xiāng)新鮮成熟紅辣椒，清洗瀝干，60℃電熱烘干至質(zhì)量恒定后，粉碎至1～2mm大小，得辣椒粉備用。

1.1.2 菌種

選用自然干制辣椒優(yōu)勢(shì)易染菌，均由本實(shí)驗(yàn)室提供，從自然干制辣椒樣品中分離純化，4～6℃冰箱保存試管菌種。I號(hào)：唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，II號(hào)：反芻真桿菌(Eubacterium ruminantium)；III號(hào)：黑曲霉(Aspergillus niger)。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、75μm CAR/PDMS萃取頭(100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭) 美國(guó)Supelco公司；HP6890/5975C型GC/MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；FOX4000型電子鼻、自動(dòng)進(jìn)樣器HS100、αSOFTV12軟件 法國(guó)Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取100g辣椒粉平鋪于白瓷盤(pán)上，料層厚度1.5cm，潤(rùn)水30%，置于功率為7.7kW微波爐焙烤殺菌，時(shí)間4min[14]。將唾液乳桿菌和反芻真桿菌分別接種于50mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h，并將黑曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖水中擴(kuò)大培養(yǎng)36h，制作菌懸液。將上述焙烤后辣椒粉稱取10g于培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌操作接種5mL上述單一菌懸液，同時(shí)注入5mL滅菌蒸餾水，接種唾液乳桿菌和反芻真桿菌的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種黑曲霉的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其間補(bǔ)充水分，培養(yǎng)15d。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)

1.3.2.1 樣品風(fēng)味物質(zhì)提取

采用固相微萃取法，參照朱曉蘭的方法[15]將樣品于60℃條件下恒溫10min后，插入固相微萃取頭，保持60℃頂空吸附30min后，取出插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸5min。

1.3.2.2 GC-MS條件

色譜柱H P - 5 M S 5 % P h e n y l M e t h y l Siloxane(30m×0.25mm，0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃(保留0.5min)，以5℃/min升溫至290℃，保持2min；汽化室溫度250℃；載氣為高純(99.999%)He；柱前壓7.62psi，載氣流量1.0mL/min；分流比20:1。質(zhì)譜條件：離子源為電子電離(electron ionization，EI)源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃。

1.3.3 辣椒粉品質(zhì)電子鼻檢測(cè)

載氣：合成干燥空氣，流速：150mL/min；小瓶中樣品體積10mL，樣品質(zhì)量0.4g；頂空產(chǎn)生時(shí)間900s，產(chǎn)生溫度60℃，攪動(dòng)速度500r/min；頂空注射體積0.7mL，注射針總體積5.0mL，注射速度0.7mL/s，注射針溫度70℃；參數(shù)獲取時(shí)間120s；延滯時(shí)間360s。

2 結(jié)果與分析

2.1 染菌干辣椒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS結(jié)果分析

干辣椒經(jīng)接種菌種并培養(yǎng)后，比較其揮發(fā)性成分的變化情況，結(jié)果如圖1、表2所示。

由圖1可以看出，各樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的出峰時(shí)間主要集中在30min之前，對(duì)照組與唾液乳桿菌、反芻真桿菌、黑曲霉組比較，分別于1.82、2.52、3.57、2.52min開(kāi)始出峰，對(duì)照樣品出峰時(shí)間較處理組早，在10min以前分別檢出14、6、5、6種風(fēng)味化合物，檢出物相對(duì)含量分別為27.090%、2.009%、1.230%、0.814%。10～20min出峰期分別檢出21、15、20、13種風(fēng)味化合物，相對(duì)含量分別為35.664%、11.187%、15.738%、3.797%，可見(jiàn)對(duì)照組低分子揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)較處理組多，相對(duì)含量較高。20min后各樣品檢出22、29、30、34種，相對(duì)含量分別為35.029%、86.803%、83.033%、95.370%。可見(jiàn)，經(jīng)受試菌處理的樣品出峰時(shí)間基本向后遷移，出峰集中在20min后，其間大分子物質(zhì)檢出較多。對(duì)辣椒呈味貢獻(xiàn)較少，因而使辣椒原有風(fēng)味特征變化、風(fēng)味品質(zhì)改變明顯。

圖 1 染菌干辣椒揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in chili pepper samples

表 1 染菌干辣椒主要揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量 Table 1 Relative contents of main volatile compounds in chili pepper samples%

通過(guò)比較干辣椒中對(duì)風(fēng)味品質(zhì)有積極貢獻(xiàn)的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物[16]，從表1可以發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組原料鑒定結(jié)果的主要13種類(lèi)揮發(fā)性成分中，染菌組僅檢出2～4種，相對(duì)含量也由對(duì)照組42.452%降至染菌組的0.811%～5.798%，從而基本上喪失了原料風(fēng)味特征，產(chǎn)生其他類(lèi)型產(chǎn)物。

對(duì)各處理樣品質(zhì)譜檢測(cè)解譜后干椒揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類(lèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較，結(jié)果如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、以及經(jīng)唾液乳桿菌、反芻真桿菌、黑曲霉接種培養(yǎng)干辣椒粉進(jìn)行可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分離檢測(cè)，分離定性的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為57、50、55、53種，染菌后干椒揮發(fā)性風(fēng)味化合物較對(duì)照組有所減少。分離和定性的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，處理組與對(duì)照組相比，烷烴類(lèi)化合物組含量增加突出，檢出物由9種增加到17～21種，相對(duì)含量由17.862%上升到56.704～70.81%，從質(zhì)譜圖譜結(jié)果看出，烷烴類(lèi)化合物集中出現(xiàn)在20min后，主要為大分子烷烴，而大分子烷烴類(lèi)有呈香特性較弱[16]，從而對(duì)辣椒風(fēng)味貢獻(xiàn)意義不大。

表 2 樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分種類(lèi)及相對(duì)含量Table 2 Kind and contents of volatile flavor compounds in dried chili peppers

處理組與對(duì)照組相比，醛類(lèi)、相對(duì)含量從18.044%、減少到0.569%～3.828%；酮類(lèi)化合物由15.452%減少到5.077%～9.322%；脂類(lèi)化合物由2.812%，減少到0.301%～0.793%；具有焙烤香氣特性的氮雜環(huán)化合物、吡嗪類(lèi)以及萜烯類(lèi)化合物[17]經(jīng)染菌培養(yǎng)后均有所降低，含氮雜環(huán)化合物由原有的12種，減少到2～4種，相對(duì)含量由10.708%減少到0.712%～1.305%，萜烯類(lèi)化合物由22.892%減少至5.549%～15.417%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物染菌培養(yǎng)后，醇類(lèi)含量有所增加，醇類(lèi)化合物種類(lèi)由對(duì)照的1種增加到3～7種，相對(duì)含量由對(duì)照組的0.380%增加到1.933%～10.064%，可能與微生物存在的發(fā)酵作用有關(guān)，醇類(lèi)化合物中，C10以上的高碳飽和醇，從其呈味特征來(lái)看，氣味一般很弱或無(wú)嗅感[19]，而具有良好風(fēng)味的醇類(lèi)相對(duì)含量不高，其中苯乙醇的相對(duì)含量占0.12%～0.95%，3-甲基-戊醇的相對(duì)含量占0.238%、2-乙基-1-己醇0.203%、沉香醇0.552%、葉綠醇2.552%～2.736%?？梢?jiàn)，辣椒粉經(jīng)微生物作用后多數(shù)具有芳香性化合物的相對(duì)含量都急劇減少，種類(lèi)減少也比較明顯。醇類(lèi)含量有所增加，可能與微生物發(fā)酵作用有關(guān)，但因在整體風(fēng)味化合物中含量有限，其積極的作用難以體現(xiàn)。同時(shí)，對(duì)香味貢獻(xiàn)不大的烷烴類(lèi)化合物種類(lèi)相對(duì)含量急劇增加，削弱了辣椒的整體良好風(fēng)味。Cremer等[18]采用頂HS-GS以及SPME提取，GC-MS檢測(cè)，分析加熱后辣椒風(fēng)味形成動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)熱處理后辣椒烷烴類(lèi)迅速增加，而本實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，微生物污染導(dǎo)致辣椒烷烴類(lèi)成分較單一熱處理的對(duì)照大幅度增加。

2.2 電子鼻傳感器對(duì)辣椒粉揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)結(jié)果

為驗(yàn)證電子鼻傳感器對(duì)干辣椒樣品檢測(cè)的重復(fù)性，不同實(shí)驗(yàn)樣品在優(yōu)選傳感器的檢測(cè)值(峰高)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表3所示，從表3可以看出，RSD范圍為－4.86%～2.87%，平均相對(duì)誤差為0.5025%，樣品在傳感器上具有良好的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)用電子鼻選用的金屬傳感器對(duì)辣椒揮發(fā)性物質(zhì)具有較好的響應(yīng)值，適用于辣椒揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)。

表 3 樣品在傳感器上的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 3 Relative standard deviations for detection of dried chili peppers on different sensors%

2.3 電子鼻對(duì)干辣椒分析結(jié)果

圖 2 辣椒樣品的電子鼻響應(yīng)信號(hào)的主成分分析(PCA)Fig.2 PCA of electronic nose response signals for dried chili peppers

樣品電子鼻檢測(cè)結(jié)果主成分分析圖如圖2所示。選取2個(gè)主成分?jǐn)M合原數(shù)據(jù)，PCA的結(jié)果可以看出，其中第1和第2主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為98.455%和1.426%，累計(jì)達(dá)99%以上，說(shuō)明PC1和PC2已經(jīng)包含很大的信息量，能夠反映樣品的整體信息，貢獻(xiàn)率越大說(shuō)明辣椒氣味變化主成分能較好地被區(qū)分，主成分PC1貢獻(xiàn)率達(dá)98.455%，說(shuō)明主要是第1主成分對(duì)樣品起作用，在染菌處理組中貢獻(xiàn)大。由圖2發(fā)現(xiàn)，處理組風(fēng)味改變十分明顯，從分布的區(qū)域來(lái)看，很有規(guī)律性，相對(duì)對(duì)照組來(lái)說(shuō)處理組氣味主成分是沿著PC2軸向下分布，同時(shí)沿著PC1軸向右分布。其中對(duì)照組第二象限內(nèi)，處理組分不在第四象限內(nèi)。各樣品的差異主要表現(xiàn)在PC1上，PC2主成分也存在差異。對(duì)照與處理樣品的氣味分布距離較遠(yuǎn)，處理組間氣味分布的區(qū)域較為接近，該電子鼻系統(tǒng)利用PCA能判定對(duì)照組與3種處理組風(fēng)味特征有明顯差異，但處理組間的差異較小。

實(shí)驗(yàn)將各樣品在18個(gè)傳感器上的最大響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行了對(duì)比，如圖3所示，通過(guò)各傳感器信號(hào)的對(duì)比得樣品相似圖譜處理組樣品在傳感器上的響應(yīng)值均較小，且響應(yīng)值都低于對(duì)照樣品，電子鼻檢測(cè)唾液乳桿菌、反芻真桿菌、黑曲霉處理組辣椒粉與對(duì)照樣品相似程度分別為21.64%、31.17%、26.69%，說(shuō)明微生物污染辣椒樣品中揮發(fā)性物質(zhì)較對(duì)照樣品明顯不同，含量明顯降低，傳感器對(duì)風(fēng)味物質(zhì)響應(yīng)值下降，而處理組間風(fēng)味響應(yīng)值差異性較小。

圖 3 對(duì)照組與處理組氣味相似度Fig.3 Odour similarity between control and experimental samples

3 結(jié) 論

通過(guò)SPME-GC-MS檢測(cè)，獲得干辣椒在染菌后風(fēng)味化合物變化的基本特點(diǎn)，其出峰時(shí)間大多在20min后，明顯向后遷移，且為大分子揮發(fā)性成分，且占檢出物含量的83.033%～95.370%，對(duì)辣椒呈味貢獻(xiàn)較少，如烷烴類(lèi)化合物種類(lèi)相對(duì)含量急劇增加，削弱了辣椒的整體良好風(fēng)味，使辣椒原有風(fēng)味特征弱化。同時(shí)，多數(shù)具有芳香性化合物的相對(duì)含量都急劇減少，種類(lèi)減少也比較明顯，具良好的風(fēng)味特性的醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)，萜烯類(lèi)化合物經(jīng)過(guò)微生物染菌培養(yǎng)后呈下降趨勢(shì)。醇類(lèi)含量有所增加，可能與微生物發(fā)酵作用有關(guān)，但因在整體風(fēng)味化合物中含量有限，其積極的作用難以體現(xiàn)。同時(shí)，在SPME-GC-MS檢測(cè)方法對(duì)樣品中風(fēng)味物質(zhì)的具體種類(lèi)和含量進(jìn)行檢測(cè)與比較基礎(chǔ)上，通過(guò)電子鼻分析風(fēng)味物質(zhì)總體特征及處理樣品間風(fēng)味差異性大小，電子鼻的相似圖譜顯示，對(duì)照組與處理組風(fēng)味特征相似度低，僅為21.64%～31.17%。

干辣椒作為傳統(tǒng)大宗調(diào)味品原料，風(fēng)味品質(zhì)是產(chǎn)品品質(zhì)主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，目前市場(chǎng)上干椒原料及相關(guān)低水分產(chǎn)品微生物染菌嚴(yán)重[3]，微生物對(duì)干辣椒營(yíng)養(yǎng)安全帶來(lái)隱患已成共識(shí)，但對(duì)干辣椒風(fēng)味品質(zhì)造成的影尚并未引起足夠重視。科學(xué)完善干辣椒及辣椒粉產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)以及生產(chǎn)規(guī)范化管理具有重要意義。

[1] 李萌, 龍彭年, 肖四海. 世界辣椒產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r與我國(guó)的對(duì)策思考[J]. 辣椒雜志, 2010(4): 1-5.

[2] 李明遠(yuǎn), 武東繁. 干辣椒“虎皮”原因的調(diào)查與研究[J]. 植物保護(hù), 1994(2): 21-22.

[3] 張春燕, 蔡靜平, 潘峰. 低水分辣椒粉帶菌狀況及控制技術(shù)的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 131-134.

[4] 羅鳳蓮, 歐陽(yáng)建勛, 夏延斌. 發(fā)酵辣椒中主要風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(7): 346-348.

[5] JUNIOR S B, de MARCHI A, de MELO T , et al. Optimization of the extraction conditions of the volatile compounds from chili peppers by headspace solid phase micro-extraction[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(38)： 3345-3350.

[6] MAZIDA M M, SALLEH M M, OSMAN H. Analysis of volatilearoma compounds of fresh chilli (Capsicum annuum L.) during stages of maturity using solid phase microextraction (SPME)[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18(5)： 427-437.

[7] RONG Liu, KE Xiong, YANG Chaoluo. Changes in volatile compounds of a native Chinese chilli pepper (Capsicum frutescens var) during ripening[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2009, 44(12)： 2470-2475.

[8] GUADAYOL J M, CAIXACH J, RIBé J. Extraction, separation and identification of volatile organic compounds from paprika oleoresin (Spanish type)[J]. Agric Food Chem, 1997, 45(5)： 1868-1872.

[9] ROTSATCHAKUL P, CHAISERI S, CADWALLADER K R. Identification of characteristic aroma components of thai fried chili paste[J]. Agric Food Chem, 2008, 56(2)： 528-536.

[10] van RUTH S M, ROOZEN J P. Gas chromatography/sniffing port analysis and sensory evaluation of commercially dried bell peppers (Capsicum annuum) after rehydration[J]. Food Chemistry, 1994, 51(2)： 165-170.

[11] COOPER T H, GUZINSKI J A, FISHER C. Improved highperformanse liquid chromatography method for the determiation of major capsaicinoids in capsicum oleoresins[J]. Agric Food Chem, 1991, 39(12): 2253-2256.

[12] YANG Yongjuan, DING Zhuhong. Clustering analysis of volatile aroma compounds in dried chilli (Capsicum annum L.)[J]. Food Science, 2010, 31(4): 187-189.

[13] 徐亞丹, 王俊, 趙國(guó)軍. 基于電子鼻的對(duì)摻假的“伊利”牛奶的檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(5): 111-117.

[14] 李達(dá). 辣椒粉調(diào)味品工藝技術(shù)與風(fēng)味品質(zhì)相關(guān)性研究[D]. 貴陽(yáng): 貴州大學(xué), 2010.

[15] 朱曉蘭, 劉百戰(zhàn), 宗若雯. 辣椒油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2003, 23(1): 67-68.

[16] van RUTH S, BOSCAINI E, MAYR D, et al. 干辣椒風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜及質(zhì)譜方法的研究[J]. 辣椒雜志, 2007(1): 41-44.

[17] 李達(dá), 王知松, 丁筑紅. 固相微萃取-氣-質(zhì)聯(lián)用法對(duì)干椒烘焙前后風(fēng)味化合物的分析評(píng)價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16): 269-271.

[18] CREMER D R, EICHNER K. Formation of volatile compounds during heating of spice paprika (Capsicum annuum) powder[J]. Agric Food Chem, 2000, 48(6): 2454-2460.