芹甙元抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究

穆 培 丁 歡 許志興 陸雄偉

骨質(zhì)疏松癥是老年人的一個(gè)重要健康問題，由于人口老齡化加劇使得該疾病的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，診斷和治療仍然具有挑戰(zhàn)性[1]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是最常見的原發(fā)性形式[2]。骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，其特征是骨量減少，骨強(qiáng)度降低，骨小梁和皮質(zhì)骨骼微結(jié)構(gòu)惡化，可能導(dǎo)致更高的骨折風(fēng)險(xiǎn)[3]。骨的數(shù)量和質(zhì)量在破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間保持著動(dòng)態(tài)平衡[4]。然而，激素缺乏會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞異常激活，破壞骨代謝平衡[5]。

破骨細(xì)胞是來源于造血祖細(xì)胞的大型多核細(xì)胞[6]。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-κB受體激活劑(RANKL)的共同作用下，破骨前體細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞[7]。RANKL是腫瘤壞死因子家族的重要成員之一，通過與RANK相互作用激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，導(dǎo)致NF-κB通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等下游信號(hào)通路的持續(xù)激活[8]。此外，活化的T細(xì)胞胞質(zhì)核因子1(NFATc1)是由C-Fos激活誘導(dǎo)的，導(dǎo)致破骨細(xì)胞相關(guān)基因如酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K(CTSK)的表達(dá)增加[9]。目前，臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物種類繁多，如雙膦酸鹽、地諾舒單抗、特立帕肽和雌激素樣藥物，然而長期服用這些藥物會(huì)引起不良反應(yīng)，如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌[10,11]。

芹甙元又稱芹甙元-7-葡萄糖苷，是從黃芩、五味子、母菊、鐵線菊等中草藥中分離得到的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗焦慮、抗肥胖等活性[12]。已有研究表明，芹甙元可通過NF-κB信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性中耳炎[13]。然而目前還沒有關(guān)于芹甙元作用于破骨細(xì)胞的研究。因此，本研究旨在探討體外實(shí)驗(yàn)中芹甙元對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響及其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：芹甙元(芹甙元-7-葡萄糖苷，美國MCE公司)；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；Trizol試劑(賽默飛世爾科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT及qPCR試劑盒SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa生物公司)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(美國R&D System公司)；TRAP染色試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；一抗(GAPDH、p-NF-κB-p65)及二抗(美國Cell Signalling公司)；4%多聚甲醛、鏈霉素-青霉素、胰蛋白酶消化液、引物(生工生物股份有限公司)。

2.BMMs細(xì)胞的獲?。?～6周齡的SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠脫頸處死后用75%乙醇浸泡10min，超凈臺(tái)中分離出雙下肢體并剔除肌肉組織得到股骨和脛骨，剪去骨兩端暴露骨髓腔，10cm培養(yǎng)皿中加入含30ng/ml M-CSF的α-MEM完全培養(yǎng)基10ml，1ml注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至變白，移液槍輕柔打散血凝塊后培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)第3天半換液，第5天全換液后繼續(xù)培養(yǎng)1天，隨后PBS輕洗后胰蛋白酶消化下貼壁細(xì)胞即為所得BMMs細(xì)胞，然后用含30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基重懸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：為了評(píng)價(jià)芹甙元對(duì)BMMs細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性作用，將BMMs細(xì)胞以8×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，加入完整的α-MEM培養(yǎng)基和M-CSF(30ng/ml)，并增加芹甙元的濃度(0、5、10、15、20、30、40和50μmol/L)。用芹甙元處理后，分別孵育48、72和96h。處理結(jié)束后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃避光孵育4h后用酶標(biāo)儀檢測450nm下的A值。芹甙元對(duì)細(xì)胞存活率的影響以細(xì)胞存活率百分比表示，對(duì)照細(xì)胞存活率設(shè)為100%。

4.TRAP染色：為了研究芹甙元對(duì)破骨生成的影響，將BMMs以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。細(xì)胞貼壁后分別給予完整的α-MEM、RANKL(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)刺激破骨細(xì)胞分化，同時(shí)加入不同濃度的芹甙元(0、 5、10和20μmol/L)。隔天更換一次培養(yǎng)液，直至第5天觀察到破骨細(xì)胞的形成，然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20min，37℃下用TRAP染色液避光染色1h。取細(xì)胞核大于3個(gè)的TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為破骨細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡成像，用Image J軟件計(jì)數(shù)。

5.RNA提取及qPCR檢測：將BMMs細(xì)胞用完全培養(yǎng)基混勻后按3×106個(gè)/孔種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的芹甙元預(yù)處理5天后用Trizol法提取總RNA，隨后用Prime Script RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從RNA模板中獲得cDNA。隨后，使用SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ在ABI7500測序檢測系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測。簡而言之，將10μl的SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ、7.2μl的ddH2O、2μl的cDNA和0.4μl的每個(gè)引物混合，形成每個(gè)PCR的總體積為20μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 30s，延伸60℃ 40s，40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光度值。以GAPDH作為參照，用2-ΔΔCT法來計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列詳見表1。

表1 目的基因引物序列

6.Western blot法檢測：將BMMs細(xì)胞用完全培養(yǎng)基混勻后按3×106個(gè)/孔種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的芹甙元預(yù)處理24h，次日按照0、5、10、20、30、60min倒序加入RANKL使RANKL終濃度為50ng/ml，然后立即用細(xì)胞蛋白試劑盒提取各組細(xì)胞的蛋白，BCA測定各組蛋白濃度，配置10%分離膠溶液，20微升/孔加入蛋白勻漿，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1h后，一抗按1∶1000用TBST稀釋，4℃封閉過夜。二抗按1∶10000用TBST稀釋后室溫孵育2h，呈像儀曝光。

結(jié) 果

1.芹甙元對(duì)BMMs細(xì)胞毒性：CCK-8細(xì)胞活性測定結(jié)果顯示，當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L時(shí)，芹甙元對(duì)BMMs細(xì)胞也無明顯的毒性作用(圖1)。

圖1 CCK-8檢測芹甙元的細(xì)胞毒性A.48h細(xì)胞相對(duì)活性;B.72h細(xì)胞相對(duì)活性;C.96h細(xì)胞相對(duì)活性

2.芹甙元對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響：TRAP染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中可見到體積大、酒紅色、內(nèi)含多個(gè)細(xì)胞核的破骨細(xì)胞。隨著芹甙元的濃度增加，TRAP染色呈陽性的破骨細(xì)胞數(shù)目和大小均減少(P<0.05,圖2)。

圖2 TRAP染色下觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)5天后染色情況(TRAP，×40)A.RANKL+芹甙元0μmol/L;B.RANKL+芹甙元5μmol/L;C.RANKL+芹甙元10μmol/L;D.RANKL+芹甙元20μmol/L;E.TRAP染色陽性破骨細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì);F.TRAP染色陽性破骨細(xì)胞面積統(tǒng)計(jì)。與0μmol/L比較，*P<0.01，**P=0.000

3.芹甙元能夠降低破骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)：qPCR檢測BMMs細(xì)胞經(jīng)RANKL和不同濃度的芹甙元培養(yǎng)5天后的破骨細(xì)胞基因分化情況，結(jié)果表明隨著芹甙元濃度的升高，破骨細(xì)胞分化基因mRNA的表達(dá)逐漸降低(P<0.05，圖3)。

圖3 BMMs經(jīng)RANKL和不同濃度的芹甙元誘導(dǎo)后的mRNA表達(dá)情況A.NFATC1 mRNA；B.CTSK mRNA；C.C-Fos mRNA；D.Atp6v0d2 mRNA；E.DC-stamp mRNA；F.TRAP mRNA。與0μmol/L比較，*P<0.05, **P<0.01，***P=0.000

4.芹甙元抑制NF-κB通路p65蛋白的磷酸化：Western blot法檢測結(jié)果顯示，20μmol/L的芹甙元預(yù)處理后，磷酸化的p65激活水平相對(duì)于對(duì)照組有明顯的降低(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法分析各組BMMs中的NF-κB p65磷酸化情況A.蛋白條帶；B.p-p65相對(duì)于GAPDH的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與RANKL組比較，*P<0.05, **P=0.000

討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥通過降低骨密度和骨面積來降低骨質(zhì)量，這是破骨細(xì)胞活性異常的結(jié)果，因此抑制破骨細(xì)胞分化是治療骨質(zhì)疏松最重要的策略。破骨細(xì)胞是由骨髓的單核-吞噬細(xì)胞系分化而來的一種大而多核的細(xì)胞，通過在骨吸收區(qū)域分泌H+、Cl-、組織蛋白酶K和基質(zhì)金屬蛋白酶來發(fā)揮降解骨組織的作用[14]。破骨前體細(xì)胞的存活需要M-CSF的存在，并可促進(jìn)其表達(dá)基本受體RANK。RANKL是破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化必須細(xì)胞因子，RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的募集，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38，以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、激活蛋白1(AP-1)和活化T細(xì)胞的核因子-1(NFATC-1)。這些轉(zhuǎn)錄因子的激活通過上調(diào)破骨細(xì)胞相關(guān)基因，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶K(CTSK)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白(DC-stamp)來觸發(fā)破骨細(xì)胞分化[15]。

芹甙元是從黃芩、五味子、母菊、鐵線菊等中草藥中分離得到的黃酮類化合[16]。既往研究表明，芹甙元通過在無生物毒性的情況下通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)功能[17]。然而，尚未見芹甙元對(duì)破骨細(xì)胞的作用報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)芹甙元可以劑量依賴的方式抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成，而無明顯的細(xì)胞毒性。同時(shí)在20μmol/L的濃度下，幾乎沒有觀察到成熟的破骨細(xì)胞形成，提示芹甙元對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用。接著筆者進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上檢測破骨細(xì)胞特異性基因NFATC1、CTSK、Atp6v0d2、TRAP、DC-stamp、C-Fos 等mRNA的表達(dá)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了芹甙元對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用。

NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)的重要信號(hào)介質(zhì)，也是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致下游的TRAF6的募集并級(jí)聯(lián)使IκB磷酸化，使與其結(jié)合的p65釋放并磷酸，緊接著移位到細(xì)胞核并誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。鑒于NF-κB通路在破骨細(xì)胞分化中的重要作用，筆者研究在芹甙元是否能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的磷酸化水平。在對(duì)照組中，當(dāng)細(xì)胞加入RANKL刺激后，p65的磷酸化水平升高。而與對(duì)照組比較，用芹甙元預(yù)處理過的BMMs細(xì)胞，RANKL刺激后其p65磷酸化水平明顯降低，表明芹甙元可通過NF-κB信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化。

因破骨細(xì)胞分化過程中的其他通路如MAPKs通路、PI3K/AKT通路也發(fā)揮了重要的作用，本研究未進(jìn)一步檢測芹甙元對(duì)這些通路的是否有影響。同時(shí)芹甙元對(duì)NF-κB信號(hào)通路中TRAF6、IKK、IκB的具體作用靶點(diǎn)及結(jié)合機(jī)制未開展進(jìn)一步研究。這也是本研究存在的不足之處。

綜上所述，本研究證實(shí)芹甙元可在無細(xì)胞毒性的情況下有效的抑制體外培養(yǎng)的BMMs向破骨細(xì)胞分化，這可能是通過NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)將進(jìn)一步探究芹甙元作用于NF-κB及其他信號(hào)通路的情況，并在動(dòng)物水平加以驗(yàn)證其對(duì)破骨細(xì)胞抑制作用的效果，明確芹甙元對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用，為其作為潛在的治療藥物提供理論依據(jù)。