自噬對骨質(zhì)疏松的影響及中藥的調(diào)控作用研究進(jìn)展

李玉曼 馬紫童 王 瀚 劉仁慧

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，骨脆性增加，易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。其發(fā)病機(jī)制主要在于骨形成和骨吸收間的動態(tài)平衡的破壞。隨著我國進(jìn)入老齡化社會，OP的發(fā)生率日益增高，嚴(yán)重影響患者身體和心理健康，為社會和家庭增加負(fù)擔(dān)，因此如何防治OP成為亟待解決的問題。

自噬是一種在所有真核生物細(xì)胞中普遍存在的、進(jìn)化上保守的過程，具有許多生理功能。自噬可更新長壽命蛋白，去除多余或受損的細(xì)胞器；針對多種脅迫條件(如營養(yǎng)限制、熱以及氧化脅迫)產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答而被誘導(dǎo)。在細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮作用。越來越多證據(jù)表明自噬參與維持骨代謝平衡，在OP的發(fā)病機(jī)制及防治中起到重要作用。

一、自噬參與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制

自噬參與多種類型的OP的發(fā)病機(jī)制。Rinaldo等[1]總結(jié)了自噬途徑的失調(diào)與OP之間的可能關(guān)系：衰老、長期使用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)和雌激素缺乏可增加骨組織氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)和骨細(xì)胞凋亡，并增加破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的骨吸收，從而導(dǎo)致骨丟失。另一方面，氧化應(yīng)激增加刺激自噬途徑，通過降解受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，減少細(xì)胞應(yīng)激，抑制OB和骨細(xì)胞凋亡，減輕骨丟失和OP。衰老引起的自噬減少會導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加。雌激素缺乏和氧化應(yīng)激引起的自噬增加活化OC，而導(dǎo)致骨丟失和隨后的OP。

1.自噬與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)：OP常見于絕經(jīng)后婦女，由于機(jī)體卵巢功能減退和雌激素水平下降，影響骨骼細(xì)胞活性并導(dǎo)致骨丟失，是常見的OP類型。PMOP與自噬關(guān)系密切，研究表明，卵巢切除大鼠的自噬水平減弱，但過表達(dá)的損傷調(diào)節(jié)自噬因子可能會增加OB的自噬水平，抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡。雌激素具有增強(qiáng)OB線粒體自噬活性的功能，骨細(xì)胞區(qū)microRNA通過胰島素樣生長因子1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路參與雌激素提高骨細(xì)胞自噬活動。激活自噬能夠增加骨量，減少骨髓腔內(nèi)脂肪組織形成，增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs)成骨分化而減弱其成脂分化[2]。但也有研究得到了相反的結(jié)論，認(rèn)為卵巢切除大鼠體內(nèi)自噬水平升高，雌激素可逆轉(zhuǎn)升高的自噬水平，通過調(diào)控GPER影響PI3K/Akt/ mTOR信號通路抑制OB和軟骨細(xì)胞線粒體自噬[3]。

2.自噬與老年性骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis，SOP)：SOP是增齡等綜合因素導(dǎo)致的一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，骨脆性增加，容易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。研究發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠自噬能力下降可誘發(fā)SOP，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素通過促進(jìn)OB功能活動，減少OC數(shù)量并抑制OC活動，抑制骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨細(xì)胞自噬，對SOP起到了明顯的骨保護(hù)作用。氧化應(yīng)激與SOP關(guān)系密切，隨年齡增長，氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力減弱，骨量減少，激活自噬能降低BMMSCs細(xì)胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，抑制自噬能提高BMMSCs細(xì)胞的ROS水平，調(diào)節(jié)自噬可影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，并恢復(fù)大鼠骨丟失[2]。

3.自噬與糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)：研究表明，GC可誘導(dǎo)骨組織中BMMSCs、OB、OC、骨細(xì)胞自噬，發(fā)揮骨保護(hù)作用。而高濃度GC損害了BMMSCs的增殖，誘發(fā)自噬，使用自噬抑制劑3-MA后進(jìn)一步抑制BMMSCs的增殖并促進(jìn)其凋亡，表明自噬能夠維持其增殖活力并抑制高濃度GC造成的凋亡，在GC刺激的應(yīng)激環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞。在OB中GC以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)自噬，隨著時間的推移，自噬水平在48h達(dá)到峰值，然后逐漸下降。GC誘導(dǎo)OB凋亡，抑制OB基因的表達(dá)，抑制自噬可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制基因表達(dá)，自噬通過與Bax/Bcl-2的相互作用是OB凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。地塞米松可能通過抑制Akt/mTOR信號通路、調(diào)節(jié)ROS/SIRT1/FOXO3通路誘導(dǎo)OB或OC自噬來發(fā)揮其在GIOP中的保護(hù)作用[4]。

4.自噬與糖尿病性骨質(zhì)疏松癥：研究表明，糖尿病抑制OB骨形成作用強(qiáng)于抑制OC骨吸收作用，減少大鼠骨形成，降低骨密度。高糖環(huán)境BMMSCs細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ表達(dá)增加，自噬水平升高，并通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路中的相關(guān)因子表達(dá)加強(qiáng)對衰老細(xì)胞的吞噬作用并提高其成骨分化的能力。高糖環(huán)境抑制OB可能與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高、線粒體損傷和自噬有關(guān)，通過ROS-Akt-mTOR軸及ERK/p38MAPK通路影響OB自噬，進(jìn)而影響其增殖和凋亡。高糖環(huán)境影響OC是通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路抑制OC形成過程中的自噬，減弱OC的形成與功能[2]。

二、調(diào)節(jié)自噬防治OP的中藥及復(fù)方研究

OB和OC來源具有同一性，其間存在生克制化關(guān)系，陽性、陰性調(diào)控因子以及陰陽屬性的相對性。吳克亮等[5]研究認(rèn)為，OB及其主導(dǎo)的骨生成屬于“陰”，OC及其主導(dǎo)的骨吸收屬于“陽”，二者動態(tài)平衡發(fā)揮維持骨穩(wěn)態(tài)的作用，二者失衡造成的骨穩(wěn)態(tài)破壞是OP的基本病理改變。從微觀層面來說，自噬利于細(xì)胞生存的作用為“陽”，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用為“陰”，細(xì)胞通過自噬降解屬性為“陰”的無用的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物，化生屬性為“陽”的新的分子元素為細(xì)胞提供能量，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的更新，陰陽此消彼長，達(dá)到平衡。若自噬過度，則過快過多地分解代謝產(chǎn)物，造成細(xì)胞損傷。若自噬不足，則代謝產(chǎn)物堆積，再循環(huán)利用能量不足，不利于細(xì)胞生成與存活。這與OP中骨穩(wěn)態(tài)失衡的病理狀態(tài)相契合。目前中藥基于自噬防治OP的作用機(jī)制研究以單味藥為主。

1.單味藥研究

(1)補(bǔ)陽藥：腎藏精，主骨生髓，基于中醫(yī)理論，腎虛精虧是導(dǎo)致OP的主要病機(jī)，故臨床主要采用補(bǔ)腎法治療。淫羊藿、巴戟天、仙茅具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨之功效。淫羊藿主要成分淫羊藿苷能夠改善卵巢切除所致PMOP大鼠骨微結(jié)構(gòu)，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。增強(qiáng)BMMSCs成骨和礦化能力，上調(diào)成骨相關(guān)蛋白BMP2、RUNX2和自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)，下調(diào)p62蛋白的表達(dá)。改善自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤引起的骨小梁數(shù)目減少、骨小梁厚度和骨皮質(zhì)變薄的加劇[6]。體外研究中，淫羊藿苷能增加小鼠前體成骨細(xì)胞株(MC3T3-E1)自噬體的數(shù)量，上調(diào)成骨分化標(biāo)志物collagen Ⅰ、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runx2及自噬相關(guān)基因ULK1、FIP200、ATG13的mRNA和蛋白的表達(dá)；提取7～10天齡的SD雄性大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，淫羊藿苷通過下調(diào)NF-κB信號通路減弱腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，激活自噬過程[7]。仙茅有效成分仙茅苷可在用游離鐵螯合劑去鐵胺處理的鐵超載OB細(xì)胞中抑制抗氧化酶上游蛋白FOXO1磷酸化，升高FOXO1，從而升高其下游蛋白抗氧化酶和自噬相關(guān)蛋白LC3B水平，促進(jìn)OB自噬，抑制鐵超載引起的OB的氧化損傷，增強(qiáng)OB骨形成的作用[8]。巴戟天有效成分水晶蘭苷通過Akt/mTOR通路增強(qiáng)自噬介導(dǎo)抗氧化作用，保護(hù)氧化應(yīng)激暴露中的OB[9]。

(2)補(bǔ)氣藥:人參可大補(bǔ)脾臟、腎臟、心臟、肺之氣，其有效成分人參皂苷Rb2能抑制去勢小鼠NF-κB信號通路和調(diào)控mTOR介導(dǎo)的自噬信號通路抑制OC形成和分化[10]。甘草具有補(bǔ)脾益氣之效，在體外培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞以及體內(nèi)腹腔注射中，發(fā)現(xiàn)其有效成分異甘草素可阻斷NF-κB通路下調(diào)自噬，從而抑制體外OC分化和體內(nèi)OC形成和炎性骨吸收[11]。紅景天具有益氣活血之效，其有效成分紅景天苷能在PMOP患者中通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1α多肽(hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α)介導(dǎo)的自噬從而抵抗骨細(xì)胞凋亡，拮抗氧化應(yīng)激改善OP[12]。

(3)活血化瘀藥：川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，其有效成分川芎嗪能夠通過AMPK/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬從而保護(hù)高GC刺激的成骨分化的抑制和BMMSCs的凋亡[2]。牛膝具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，其有效成分牛膝甾酮在體外可通過上調(diào)成骨分化相關(guān)基因collagenⅠ、OPG、OPN、OCN的表達(dá)及刺激自噬體的形成從而促進(jìn)OB分化。β-蛻皮甾酮可下調(diào)GIOP大鼠中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、ATG5、LC3Ⅰ/Ⅱ和凋亡[13, 14]。

(4)清熱藥：穿心蓮具有清熱解毒涼血、消腫、燥濕的功效，其有效成分穿心蓮內(nèi)酯在體外能夠通過抑制TNF-α激活的自噬相關(guān)NF-κB通路保護(hù)和促進(jìn)BMMSCs成骨分化；通過抑制NF-κB通路的活化還可抑制OC分化，從而抑制骨丟失；通過調(diào)控ERK通路促進(jìn)OB增殖、激活Wnt/β-catenin 促進(jìn)成骨分化，從而增加骨合成[15]。知母具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，其有效成分芒果苷可在由叔丁基過氧化氫構(gòu)建的軟骨細(xì)胞損傷模型中通過激活A(yù)MPK信號通路增加軟骨細(xì)胞自噬并減少凋亡[16]?？鄥⒕哂星鍩嵩餄?、殺蟲利尿的功效，其有效成分苦參堿可通過調(diào)控NF-κB/AKT/MAPK通路，抑制破骨細(xì)胞生成，抑制炎性反應(yīng)，減輕卵巢切除小鼠OP癥狀[17]。

2.中藥化學(xué)成分研究

白藜蘆醇是一類天然多酚化合物，來源于虎杖、葡萄等多種植物，表現(xiàn)出多種活性。白藜蘆醇能增強(qiáng)GIOP大鼠模型SIRT1活性，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)OB自噬，影響RAW 264.7細(xì)胞自噬而抑制OC分化，誘導(dǎo)由H2O2構(gòu)建的OB和軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下的自噬，以降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)OB存活，抑制軟骨細(xì)胞增生[18]。

黃酮類成分槲皮素通過上調(diào)自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)，減輕雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP[19]。山奈酚是一種廣泛存在于各種植物中的膳食生物類黃酮，對新生大鼠、GC誘導(dǎo)的OP模型、卵巢切除誘導(dǎo)的OP模型和骨折模型均有保骨作用，通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，激活成骨細(xì)胞自噬，達(dá)到骨保護(hù)作用，自噬通路MAPK、mTOR參與其抗OP作用[18]。此外，一些黃酮類成分如高良姜素、淫羊藿苷Ⅱ、蘆丁等通過調(diào)控自噬以保護(hù)BMMSCs的生存并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[2]。

歐前胡素來源于白芷、防風(fēng)等植物，可通過提高自噬水平恢復(fù)去勢大鼠BMMSCs向成骨分化的能力，治療PMOP[20]。鳶尾素可降低自噬底物p62水平，升高LC3B水平，通過激活自噬促進(jìn)體外培養(yǎng)的老齡小鼠BMMSCs骨向分化的能力[21]。防己有效成分防己諾林堿可通過提高自噬相關(guān)蛋白ATG5和Beclin1增加自噬來預(yù)防GC誘導(dǎo)的OP大鼠骨質(zhì)流失[22]。葛根的有效成分葛根素可通過激活A(yù)MPK/LC3信號通路或下調(diào)miR-204表達(dá)致LC3B表達(dá)增加上調(diào)自噬增強(qiáng)OB增殖和分化，還可通過Akt/mTOR通路誘導(dǎo)OC自噬。脫氫木香內(nèi)酯通過下調(diào)整合素β3、蛋白激酶C-β和ATG5表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的遷移和溶酶體生物發(fā)生和分泌，從而抑制破骨細(xì)胞的活化[2]。香豆素衍生物蛇床子素在雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP模型中通過上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)BMMSCs成骨分化[23]。此外，紫丁香苷通過上調(diào)LC3Ⅱ的表達(dá)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)成骨分化。益母草堿通過PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬促進(jìn)大鼠BMMSCs向成骨細(xì)胞分化。熊果苷通過上調(diào)地塞米松引起的自噬抑制改善小鼠GIOP。

3.中藥復(fù)方研究

(1)補(bǔ)腎壯骨方藥:二至丸(墨旱蓮、女貞子)可降低自噬相關(guān)基因mTOR、ATG5、Beclin1、p62表達(dá)從而抑制OC分化來改善GC所致的斑馬魚OP癥狀[24]。左歸丸和右歸丸(熟地黃、炒山藥、枸杞子、山茱萸等)均可升高去卵巢大鼠BMMSCs自噬水平[4]。滋陰補(bǔ)腎方(生龍骨、生牡蠣、桑寄生、續(xù)斷、淫羊藿、天花粉、黃連)通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路顯著增加OB數(shù)量，增加骨量，治療糖尿病合并去卵巢OP大鼠[25]。

(2)補(bǔ)腎健脾方藥：培本固疏方(人參、鹿角片、龜板、仙桃草等)通過抑制卵巢切除OP大鼠自噬相關(guān)NF-κB通路抑制OC分化和成熟，并減少機(jī)體晚期糖基化終末產(chǎn)物的堆積抗氧化應(yīng)激，進(jìn)一步減少NF-κB的表達(dá)，從而增加骨密度，提高骨強(qiáng)度，改善骨代謝[26]。續(xù)苓健骨方(川續(xù)斷、白術(shù)、陳皮、赤芍、紅花、甘草等)治療卵巢切除所致大鼠OP模型過程中篩選差異miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)自噬通路參與其作用[27]。

(3)補(bǔ)腎活血方藥：補(bǔ)正續(xù)骨丸(何首烏、自然銅、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷等)通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)mTOR1信號通路糖體蛋白S6激酶1、真核細(xì)胞翻譯啟始因子4E蛋白的表達(dá)抑制骨吸收，從而對卵巢切除所致PMOP大鼠模型及OP性骨折有一定防治作用[28]。補(bǔ)腎通絡(luò)方能夠通過降低自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7A的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化，顯著改善潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚OP癥狀[29]。

(4)滋補(bǔ)肝腎方藥:抗疏強(qiáng)骨合劑(黃芪、熟地黃、淫羊藿、肉蓯蓉、菟絲子、當(dāng)歸、丹參、三七、延胡索、白芍、骨碎補(bǔ)、牛膝、甘草)通過降低骨組織中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的含量，抑制自噬達(dá)到治療去勢OP的作用[30]。

三、展 望

OP與中醫(yī)“骨痹”、“骨痿”癥狀相似，基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，中醫(yī)藥主要通過補(bǔ)腎的方法防治OP，且能通過整體觀念對患者進(jìn)行綜合治療，結(jié)合病證特點(diǎn)進(jìn)行辨證施治，在防治 OP方面具有其獨(dú)特優(yōu)勢。但對其治療機(jī)制的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)，對自噬相關(guān)機(jī)制的研究更是從近幾年才開始的。自噬與中醫(yī)腎陰陽理論關(guān)系密切，在骨代謝以及BMMSCs、OB、OC、骨細(xì)胞的增殖、分化、代謝與生理功能行使中有重要的調(diào)控作用。自噬的過度或不足都會引起陰陽失衡，打破骨形成和骨吸收之間的平衡，不利于骨穩(wěn)態(tài)和骨代謝，介導(dǎo)OP的發(fā)生和發(fā)展。但自噬在維持骨穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮正向還是負(fù)向的作用未有定論，治療過程中過度激活或抑制自噬可能對骨代謝產(chǎn)生不利影響，目前臨床尚無自噬調(diào)控藥物用于防治OP的評估，中藥的雙向調(diào)節(jié)作用可能會在維持自噬于適度水平的方面發(fā)揮作用，進(jìn)而維持腎中陰陽的平衡以及骨重建平衡，調(diào)控自噬可能成為治療OP的新思路。