咪喹莫特對MRL/ lpr狼瘡小鼠Th2細(xì)胞和IgG1+漿細(xì)胞的影響①

沈春秀 段相國 吳麗華 張曉羽 蘭亞如 蘇春霞 （寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川750004）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種由于自身抗體產(chǎn)生過多，形成免疫復(fù)合物沉積于組織器官而造成機(jī)體損傷的自身免疫性疾病，目前致病原因尚不明確［1-4］。多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞因子失調(diào)可能是SLE 發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，其中，Th2 細(xì)胞因子起重要作用［5-6］。細(xì)胞因子IL-4 被認(rèn)為是Th2 細(xì)胞的主要功能性細(xì)胞因子，不僅促進(jìn) Th0 向Th2 分化，增加Th2 細(xì)胞的數(shù)量，而且通過介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B 細(xì)胞分化、成熟和增殖，誘導(dǎo)抗體類別向IgG1轉(zhuǎn)化［7-10］。研究顯示，SLE患者體內(nèi)Th2細(xì)胞比例和功能性細(xì)胞因子IL-4的分泌水平明顯升高。因此，有效降低SLE 患者體內(nèi)Th2 細(xì)胞比例和功能細(xì)胞因子IL-4的分泌在尋求治療SLE的藥物方面尤為重要。

咪喹莫特（imiquimod，IMQ）是一種新型的TLR7激動劑，近期有研究發(fā)現(xiàn)，IMQ可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子通路，激活活化轉(zhuǎn)錄因子負(fù)向調(diào)控共刺激信號，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞幾乎完全“失能”，從而抑制細(xì)胞因子 IL-4、IL-17、IL-21 等的分泌［11］。本文通過研究IMQ對MRL/lpr狼瘡小鼠Th2細(xì)胞和IgG1+漿細(xì)胞的影響，初步探討其下調(diào)IgG1+漿細(xì)胞比例的可能原因，為IMQ 成為治療SLE 的靶向藥物提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級健康MRL/lpr 狼瘡小鼠（BALB/c 背景）及 BALB/c 小鼠各 15 只，6~8 周齡，體重18~22 g，均購自上海斯萊克股份有限公司（動物合格證號：SCXK（滬）2017-0005）。小鼠均飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，嚴(yán)格按照小鼠飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為50%，光照時(shí)間為8：00~20：00，飲用蒸餾水，飼養(yǎng)期間保持飼養(yǎng)房間整潔、通風(fēng)，定時(shí)清理鼠籠。實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》要求。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)8周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 咪喹莫特（純度>99%）購自MedChem Express；地塞米松（國藥準(zhǔn)字H42020020）購自湖北天藥股份有限公司。采用9 g/L 生理鹽水配制咪喹莫特和地塞米松注射液。小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液購自康寧；小鼠CD4 T 淋巴細(xì)胞分選試劑盒、流式抗體anti-CD19-FITC、anti-IgG1-PE、anti-IL-4-PE 均購自 BD 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；胎牛血清（fetal bottles bovine，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素、轉(zhuǎn)錄因子染色液購自eBioscience；佛波酯、離子霉素鈣鹽、莫能霉素均購自Solarbio。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Z383 型水平離心機(jī)，德國公司；BD FACS CelestaTM流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組及給藥 15 只BALB/c 正常小鼠和15 只MRL/lpr 狼瘡小鼠均隨機(jī)分為3 組：生理鹽水組（Veh）、0.05 mg/kg 咪喹莫特組（IMQ）、按照文獻(xiàn)［12］設(shè)置1 mg/kg 地塞米松組（DXM），5 只/組；各組小鼠按以上劑量每天腹腔注射給藥，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.2 磁珠分選CD4+T 細(xì)胞 連續(xù)干預(yù)4 周后，分別按頸椎脫臼方法處死小鼠，無菌取脾臟，充分研磨，制成脾細(xì)胞懸液，通過淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，按照說明書磁珠分選CD4+T細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活的CD4+T細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例 分選出的CD4+T 細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔培養(yǎng)于含2%FBS，100 U/（μg·ml）青霉素-鏈霉素，50 ng/ml PMA，250 ng/ml離子霉素鈣鹽及莫能霉素1.39 μg/ml的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；適量PBS 重懸細(xì)胞，1 500/rmin 離心 5 min，棄上清；加入200 μl 破膜液，常溫避光孵育 30 min 后加入 350 μl 1×Buffer 重懸后，1 500/rmin 離心 5 min，棄上清；100 μl PBS 重懸細(xì)胞，加入 1 μl IL-4-PE ，4℃ 孵育30 min，適量PBS 洗滌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Th2 細(xì)胞比例［CD4+IL-4+T細(xì)胞（%）］。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例 分離出的單個(gè)核細(xì)胞，以1×106個(gè)/管加入100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入0.5 μl CD19-FITC、0.5 μl IgG1-PE 4℃孵育30 min，適量PBS洗滌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測IgG1+漿細(xì)胞比例［CD19+IgG1+B細(xì)胞（%）］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示；不同樣本間比較，采用單因素方差分析法，采用Pearson 作相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水平為0.05。流式分析采用Flowjo VX.0.7軟件。統(tǒng)計(jì)學(xué)作圖采用GraphPad Prism7軟件。

2 結(jié)果

2.1 IMQ對BALB/c小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例的影響 連續(xù)干預(yù)4 周后，Veh 組BALB/c 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例為（6.03±0.05）%，IMQ 組 BALB/c 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例為（5.53±0.08）%，DXM 組BALB/c小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例為（6.24±0.19）%。與 Veh 組相比，IMQ 組 BALB/c 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），DXM組BALB/c小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例有升高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.21）。與DXM 組相比，IMQ 組BALB/c小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。見圖1。

圖1 IMQ對BALB/c小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例的影響Fig.1 Effect of IMQ on proportion of Th2 cells in spleen of BALB/c mice

2.2 IMQ 對BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例的影響 連續(xù)干預(yù)4 周后，Veh 組BALB/c 小鼠脾臟中 IgG1+漿 細(xì) 胞 比 例 為（1.83±0.04）% ，IMQ 組BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例為（1.73±0.03）%，DXM 組 BALB/c 小鼠脾臟中 IgG1+漿細(xì)胞比例為（2.45±0.08）%。與 Veh 組相比，IMQ 組BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DXM 松組BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與 DXM 組相比，IMQ 組 BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）。見圖2。

圖2 IMQ對BALB/c小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例的影響Fig.2 Effects of IMQ on proportion of IgG1+plasma cells in spleen of BALB/c mice

2.3 IMQ 對MRL/lpr 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例的影響 連續(xù)干預(yù)4 周后，Veh 組BALB/c 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例為（6.03±0.05）%，Veh 組 MRL/lpr 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例為（6.39±0.09）%，IMQ 組MRL/lpr 小 鼠 脾 臟 中 Th2 細(xì) 胞 比 例 為（6.04±0.07）%，DXM 組MRL/lpr 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例為（6.87±0.15）%。與BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Veh 組相比，IMQ 組MRL/lpr 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DXM 組MRL/lpr 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與DXM 組相比，IMQ 組 MRL/lpr 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）。見圖3。

圖3 IMQ對MRL/lpr小鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例的影響Fig.3 Effect of IMQ on proportion of Th2 cells in spleen of MRL/lpr mice

2.4 IMQ 對MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例的影響 連續(xù)干預(yù)4 周后，Veh 組BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例為（1.83±0.04）%，Veh 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例為（3.81±0.27）%，IMQ 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例為（2.39±0.14）%，DXM 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例為（3.91±0.33）%。與BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與Veh 組相比，IMQ 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；DXM 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例有升高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.77）。與DXM 組相比，IMQ 組MRL/lpr 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）。見圖4。

圖4 IMQ對MRL/lpr小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例的影響Fig.4 Effects of IMQ on proportion of IgG1+plasma cells in spleen of MRL/lpr mice

2.5 MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例與Th2 細(xì)胞因子IL-4 表達(dá)的相關(guān)性分析 由上述結(jié)果可知，IMQ 可下調(diào)Th2 細(xì)胞（細(xì)胞因子IL-4）和IgG1+漿細(xì)胞比例，因此對細(xì)胞因子IL-4與IgG1+漿細(xì)胞的比例進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例與細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P=0.002，圖5）。

圖5 MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例與細(xì)胞因子IL-4表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between proportion of IgG1+plasma cells and expression of cytokine IL-4 in spleen of MRL/lpr lupus mice

3 討論

SLE 是一種以大量自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物的形成及免疫復(fù)合物沉積組織、器官為突出表現(xiàn)的自身免疫性疾病［13-15］。目前，糖皮質(zhì)激素和非特異性免疫抑制藥物仍是臨床上治療SLE 的一線藥物，但長期使用激素及免疫抑制劑會產(chǎn)生明顯的毒副作用［16-17］。因此，尋找有效的替代藥物至關(guān)重要。IMQ是一種TLR7激動劑，在臨床上主要以軟膏形式應(yīng)用于銀屑病和皮膚腫瘤相關(guān)的治療，臨床療效顯著，具有使用簡單、方便、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，然而在自身免疫性疾病方面的研究較少［18］。

研究顯示TLR7 主要分布于細(xì)胞內(nèi)，通過識別靶細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和促炎癥釋放因子，觸發(fā)免疫應(yīng)答［19-20］。TLR7 可表達(dá)于淋巴細(xì)胞，尤其是 CD4+T 細(xì)胞［21］。Th2 細(xì)胞是一類主要的CD4+T 細(xì)胞，其可特異性地產(chǎn)生細(xì)胞因子 IL-4［22-23］。研究發(fā)現(xiàn)，Th2 細(xì)胞與IL-4 在SLE 的發(fā)展中起重要作用。例如：IL-4 是一種T 細(xì)胞生長因子，能促進(jìn)Th0 向Th2 方向轉(zhuǎn)化，使Th2 細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，進(jìn)而促進(jìn)SLE 患者自身抗體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，加重SLE 的病理損傷［22，24］。研究顯示，與正常 BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr 小鼠脾臟組織中IL-4 mRNA 表達(dá)明顯升高［25］；SLE 患者 PBMC 體外培養(yǎng)產(chǎn)生的 IL-4較對照組升高；狼瘡鼠模型研究發(fā)現(xiàn)抗IL-4 單抗可有效降低抗ds-DNA 含量，并且預(yù)防狼瘡腎炎發(fā)?。?6］；與對照組相比，SLE 患者體內(nèi) Th2 細(xì)胞比例明顯升高，且血清IL-4水平與SLE疾病活動指數(shù)（SLE‐DAI）和 Th2 細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)［25-27］。因此，如何調(diào)控IL-4 水平及Th2 細(xì)胞比例在尋求治療SLE 的靶向藥物方面尤為重要。

研究顯示，IMQ 能抑制CD4+T 細(xì)胞分化和功能性細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究分別在BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr狼瘡小鼠體內(nèi)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：與Veh 組相比，IMQ 組小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例明顯降低；DXM 組 MRL/lpr 小鼠脾臟中 Th2 細(xì)胞比例明顯升高，但對BALB/c 小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例上調(diào)不顯著；與DXM組相比，IMQ組BALB/c正常小鼠和MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞比例明顯降低。免疫球蛋白IgG1 作為SLE 主要致病性抗體，在SLE 的發(fā)展中起重要作用，而細(xì)胞因子IL-4 的水平又與IgG1 水平直接相關(guān)［28］。因此，研究組分別檢測了BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示：與Veh組相比，IMQ組小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低；DXM 組BALB/c 小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯升高，但對MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中Th2 細(xì)胞的比例上調(diào)不顯著；與 DXM 組相比，IMQ 組 BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例明顯降低。為了進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞因子IL-4 與IgG1 水平的相關(guān)性，研究組對MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞的比例與細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明：MRL/lpr 狼瘡小鼠脾臟中IgG1+漿細(xì)胞比例與細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。提示IMQ 可能通過抑制Th2 細(xì)胞比例和細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)，進(jìn)而影響IgG1+漿細(xì)胞的比例，從而降低免疫球蛋白IgG1 的表達(dá)，對MRL/lpr 狼瘡小鼠的治療起到了一定的效果。

綜上所述，本研究通過研究IMQ 對MRL/lpr 狼瘡小鼠Th2 細(xì)胞IgG1+漿細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)IMQ 能明顯抑制MRL/lpr 狼瘡小鼠Th2 細(xì)胞的比例和細(xì)胞因子IL-4 表達(dá)，降低IgG1+漿細(xì)胞比例，從而減少免疫球蛋白IgG1 表達(dá)，減緩SLE 的發(fā)生，為IMQ 成為治療SLE的靶向藥物提供了新的數(shù)據(jù)。