單克隆抗體制備技術(shù)的最新進(jìn)展①

林金香 王心睿③ （福建省兒童醫(yī)院，福州350011）

單克隆抗體是由B 細(xì)胞接受抗原刺激所產(chǎn)生的。20世紀(jì)末Kohler 和Milstein構(gòu)建了以雜交瘤細(xì)胞方式制備單克隆抗體的技術(shù)，該方法簡(jiǎn)單，但鼠源單抗在臨床使用中易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，導(dǎo)致抗體效價(jià)降低和免疫原性強(qiáng)等問(wèn)題，于是嵌合抗體技術(shù)和人源化技術(shù)隨后出現(xiàn)使之得到一定改善，但仍存在諸多缺點(diǎn)［1-3］。近二三十年來(lái)，隨著生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體制備技術(shù)也不斷更新，促使單克隆抗體在基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷、臨床治療等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文就單克隆抗體制備技術(shù)的最新進(jìn)展，如抗體庫(kù)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因和新型動(dòng)物模型技術(shù)、單個(gè)B 細(xì)胞抗體技術(shù)、多學(xué)科和計(jì)算機(jī)輔助抗體制備技術(shù)做一概述，并討論其存在問(wèn)題和未來(lái)運(yùn)用前景。

1 抗體庫(kù)技術(shù)

抗體庫(kù)技術(shù)是通過(guò)基因工程手段克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，接著重組到原核表達(dá)系統(tǒng)，然后通過(guò)設(shè)置抗原、結(jié)合和洗滌等條件，篩選出特異性抗體基因的技術(shù)?？贵w庫(kù)技術(shù)除了能用于篩選抗體外，又能對(duì)已有的抗體進(jìn)行改造，如降低鼠源性、提高親和力和穩(wěn)定性等。

1.1 抗體庫(kù)構(gòu)建 抗體庫(kù)始于基因文庫(kù)構(gòu)建，目前有天然抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)、全合成抗體庫(kù)和組合庫(kù)。1996 年，VAUGHAN 等［4］首次從健康人的外周血B細(xì)胞擴(kuò)增出輕鏈和重鏈可變區(qū)基因并構(gòu)建天然抗體庫(kù)。天然抗體庫(kù)根據(jù)供體狀態(tài)可分為單純文庫(kù)和免疫文庫(kù)。單純文庫(kù)是從幼稚動(dòng)物或健康人類供體的B 細(xì)胞衍生而來(lái)，具有廣泛靶標(biāo)的親和力［5］；而免疫文庫(kù)是經(jīng)免疫過(guò)的動(dòng)物或特定抗原疾病痊愈的患者身上獲取，經(jīng)歷天然親和力成熟，對(duì)特定靶標(biāo)有高親和力，如從MERS 痊愈者的血液B 細(xì)胞構(gòu)建而成的文庫(kù)［6］。近年來(lái)，半合成抗體庫(kù)及全合成的人HuCAL 庫(kù)相繼被構(gòu)建［7-8］。還出現(xiàn)一類整合了2 種或3 種不同類型的子庫(kù)而成的組合抗體庫(kù)，提高了實(shí)用性［9］。

1.2 抗體庫(kù)篩選 目前常用的篩選技術(shù)主要包括噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交展示技術(shù)。1985 年SMITH［10］首次提出噬菌體展示技術(shù)，將外源基因插入絲狀噬菌體中，將相應(yīng)的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而可以篩選出特定的結(jié)合物或具有親和特性的蛋白，該技術(shù)是目前發(fā)展最成熟、最廣泛的應(yīng)用。1990 年 JOHN［11］將噬菌體展示技術(shù)運(yùn)用于抗體研發(fā)，2002 年首個(gè)完全人源化的阿達(dá)木單抗獲FDA 批準(zhǔn)上市。噬菌體展示技術(shù)能夠克服免疫耐受，在制備靶向腫瘤、毒性抗原、自身抗原、高度保守的抗原等抗體中具有很大的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已拓展至可快速識(shí)別與多種靶分子（蛋白質(zhì)）結(jié)合的肽或抗體片段，甚至也可采用細(xì)胞、組織作為抗原［12］。此外，噬菌體展示技術(shù)和酵母展示技術(shù)因易于篩選高親和力的抗體變體和使用高通量篩選方式，現(xiàn)已被廣泛用于抗體親和力的成熟［13］。

抗體庫(kù)具有能夠模擬天然表位的結(jié)構(gòu)和功能、免疫源性好、生產(chǎn)成本相對(duì)低等優(yōu)勢(shì)，至今為止已有9 個(gè)通過(guò)此技術(shù)產(chǎn)生的抗體藥物獲得FDA 批準(zhǔn)，但是該技術(shù)在庫(kù)容量、多樣性和親和力等很多方面待改進(jìn)［14］。

2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和新型動(dòng)物模型技術(shù)

傳統(tǒng)上抗體來(lái)源于野生型的小鼠、大鼠、兔等，這些抗體治療使用受限，但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及各種新型動(dòng)物模型能產(chǎn)生更多樣的、親和力成熟的、全人源的抗體，滿足市場(chǎng)的不同需求。

2.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過(guò)將攜帶人抗體重鏈和輕鏈的基因簇導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。這種動(dòng)物所攜帶的人DNA 片段具有相對(duì)完善的功能，可進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟，使所產(chǎn)的抗體具有成為藥物的天然優(yōu)勢(shì)。目前通過(guò)HuMAbMouse、XenoMouse、VelocImmune Mouse、TC Mouse 轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)已研發(fā)出21 款全人源抗體上市，這4種轉(zhuǎn)基因小鼠和所產(chǎn)抗體各有不同的特點(diǎn)，如表1所示。最近有學(xué)者利用H2L2轉(zhuǎn)基因小鼠制備針對(duì)SARS-CoV-2 的中和抗體正在進(jìn)一步測(cè)試中［19］。此外，還有一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在開(kāi)發(fā)測(cè)試中，如KyMouse、OmniRat/Mouse/Chicken、Trianni Mouse等。

表1 世界上人類抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要平臺(tái)Tab.1 Major platforms of human antibody transgenic animals in world

2.2 新型動(dòng)物模型 除了來(lái)源于鼠的抗體外，自然界還有多種動(dòng)物產(chǎn)生不同特性的抗體，如納米抗體、兔抗體、雞抗體等。1993 年首次報(bào)道在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)只有重鏈的抗體，將此重鏈抗體的可變區(qū)單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)，仍具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗原結(jié)合活性，因分子量較小，故又被稱為納米抗體［20］。由于納米抗體穩(wěn)定性高、容易表達(dá)、不易出現(xiàn)空間位阻等優(yōu)點(diǎn)，因此引起廣泛關(guān)注和研究。2018 年，首個(gè)納米抗體Cablivi 獲批上市，用于治療成人獲得性血栓性血小板減少性紫癜［21］。近期有學(xué)者利用大羊駝研發(fā)出能夠中和SARS、MERS 以及新冠病毒的假病毒的多種“納米抗體”，有望被開(kāi)發(fā)成“中和噴霧”［22］。

與鼠源單抗相比，兔抗體具有更高的親和力、多樣性、人源化改造更簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。2019 年兩款兔來(lái)源單抗藥物Brolucizumab 和Eptinezumab 獲 FDA批準(zhǔn)，分別用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性和預(yù)防偏頭痛［23］。此外，雞、鴕鳥(niǎo)等擁有完全不同的IgY抗體，這類抗體具有耐酸、耐受蛋白酶等獨(dú)特特性，未來(lái)可開(kāi)發(fā)成消化道用藥或外用，并已有學(xué)者用鴕鳥(niǎo)抗體用于人的頭發(fā)修復(fù)［24-25］。

轉(zhuǎn)基因和新型動(dòng)物模型由于其獨(dú)特的自身優(yōu)勢(shì)，已成為抗體制備的主要技術(shù)之一，但仍存在研發(fā)周期長(zhǎng)、投入資金大、技術(shù)難度高，且轉(zhuǎn)基因易使動(dòng)物體細(xì)胞發(fā)生突變，產(chǎn)生不完全的人抗體序列等缺點(diǎn)，需進(jìn)一步改進(jìn)。

3 單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)

單個(gè)B 細(xì)胞抗體技術(shù)通過(guò)體外分選、克隆或測(cè)序、表達(dá)、測(cè)試等流程獲得具有抗原特異性的抗體，此類抗體具有輕重鏈可變區(qū)天然配對(duì)、全人源、親和力高等特點(diǎn)，運(yùn)用此技術(shù)能在少量細(xì)胞中高效地分離出潛在的單克隆抗體。

3.1 鑒定和分離單個(gè)B 細(xì)胞 B 細(xì)胞分選技術(shù)的核心是從人體中挑選出針對(duì)特定抗原的B 細(xì)胞，并將其BCR（B cell receptor）開(kāi)發(fā)為重組單克隆抗體。一種篩選策略是從患者或經(jīng)過(guò)疫苗免疫的志愿者體內(nèi)抽取外周血，再借助熒光激活、激光捕獲顯微切割、液滴微流體等分選技術(shù)［26-28］；另一種是通過(guò)分析對(duì)特定疾病具有抵抗能力的人進(jìn)行免疫系統(tǒng)的深度分析，尋找具有富集現(xiàn)象的BCR 序列，再做進(jìn)一步檢測(cè)，如CAO等［29］通過(guò)對(duì)60個(gè)新冠肺炎康復(fù)患者血中的B 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離和高通量測(cè)序，并通過(guò)患者自身B 細(xì)胞序列對(duì)比和全部樣本的B 細(xì)胞序列對(duì)比，從8 400個(gè)抗體序列中篩出400個(gè)富集度最高的抗體序列來(lái)合成，從中找到14個(gè)具有抗新冠病毒的高活性中和抗體。

3.2 克隆或測(cè)序單個(gè)B 細(xì)胞 單個(gè)B 細(xì)胞分選后需要進(jìn)行克隆，目前比較成熟的是基于流式多色分選技術(shù)的B 細(xì)胞克隆技術(shù)，根據(jù)B 細(xì)胞表面標(biāo)記物分選出具有抗原特異性的B 淋巴細(xì)胞，然后從單個(gè)B 細(xì)胞克隆出編碼抗體的重鏈和輕鏈基因［26］。常規(guī)B 細(xì)胞克隆技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，而直接對(duì)B 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞VDJ測(cè)序則耗時(shí)短。SETLIFF 等［30］開(kāi)發(fā)了一種用于抗體發(fā)現(xiàn)和疫苗開(kāi)發(fā)的LIBRA-seq 技術(shù)（linking B cell receptor to antigen specificity through sequencing），通過(guò)測(cè)序?qū) 細(xì)胞受體和抗原特異性連接起來(lái)，具有針對(duì)廣泛抗原靶標(biāo)的特點(diǎn)，也大大提高抗體制備效率。

3.3 高通量表達(dá)和測(cè)試 單個(gè)B 細(xì)胞被克隆或測(cè)序后，需對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和測(cè)試，以確定每種單克隆抗體的特性。目前比較成熟的高通量單個(gè)B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，有基于Beacon“單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)”的技術(shù)平臺(tái)［31］，它將微流控的納升級(jí)微反應(yīng)器技術(shù)、光電定位技術(shù)和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等結(jié)合在一起，形成一體化多功能單細(xì)胞平臺(tái)，能夠完成單細(xì)胞分選、分析、培養(yǎng)、測(cè)試以及導(dǎo)出等功能；也有基于單液滴微流控技術(shù)的完全集成的CelliGO技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)超高通量抗體選擇和測(cè)試，能以物種激動(dòng)的方式深入挖掘免疫庫(kù)，探索諸如多跨膜蛋白等具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)［28］。

近幾年，因單個(gè)B 細(xì)胞抗體技術(shù)具有許多不可替代的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤免疫和傳染性疾病上如火如荼開(kāi)展，但仍存在諸多問(wèn)題需要解決，如特異性抗原的選定、分選策略、高通量表達(dá)和測(cè)試等。

4 多學(xué)科和計(jì)算機(jī)輔助抗體制備技術(shù)

隨著生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、免疫學(xué)、抗體工程學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，以及大數(shù)據(jù)、人工智能、高通量、自動(dòng)化等技術(shù)的成熟，從不同方面輔助抗體制備技術(shù)的更新迭代。

4.1 多學(xué)科輔助抗體制備 生物信息學(xué)使用生物算法和相關(guān)的軟件工具來(lái)處理大量生物學(xué)數(shù)據(jù)，從中挖掘出重要信息，尤其是能從核酸和蛋白質(zhì)序列分析出其結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的信息，可用于分析疾病機(jī)體抗體組庫(kù)的變化，預(yù)測(cè)抗原與抗體的靶位，進(jìn)而提高抗體制備的精準(zhǔn)性。有學(xué)者通過(guò)與SARS-CoV密切相關(guān)的序列同源性和生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證對(duì)SARS-CoV-2 具有免疫應(yīng)答的潛在B 和T細(xì)胞表位，繪制病毒表位和其相對(duì)免疫原性的圖譜，為抗體設(shè)計(jì)提供關(guān)鍵信息［32］。JU 等［33］采用高通量的抗體分離和克隆抗體家族的生物信息學(xué)鑒定，從8 例新冠感染者的單個(gè)B 細(xì)胞中分離并鑒定出206 株 SARS-CoV-2 RBD（receptor-binding domain）特異性單克隆抗體。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)可在分子和原子水平上解析病原體或抗原與機(jī)體受體的蛋白結(jié)構(gòu)，如準(zhǔn)確定位新冠病毒受體結(jié)合域和人受體ACE2 的相互作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的受體結(jié)合氨基酸位點(diǎn)，比較SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的抗原差異性，找到SARS-CoV-2比SARS 結(jié)合力更強(qiáng)的抗原表位［34-35］。以上研究揭示新冠病毒侵染細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和關(guān)鍵抗原靶位，為多種中和性抗體的抗原表位的選擇和覆蓋奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

免疫學(xué)研究詮釋機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的反應(yīng)和處置過(guò)程，免疫系統(tǒng)中的抗體既可清除病原體，又可促進(jìn)病原體的復(fù)制，加重對(duì)機(jī)體的損害，因此深入研究人類對(duì)病原體的具體免疫反應(yīng)機(jī)制進(jìn)而指導(dǎo)抗體研發(fā)是十分重要。如分析新冠肺炎患者血清中病毒抗體的表達(dá)和分布規(guī)律，IgG 抗體在發(fā)病后一周被檢測(cè)到，在第2 周起迅速增加，在第4 周達(dá)滴度高峰［36］。又如研究抗體依賴性增強(qiáng)冠狀病毒進(jìn)入的分子機(jī)制，評(píng)估抗體如何影響病毒進(jìn)入表達(dá)病毒受體，F(xiàn)c 受體或兩種受體的細(xì)胞，這些對(duì)新冠病毒抗體的核心抗原表位選擇，抗體結(jié)構(gòu)改造，單個(gè)B細(xì)胞分選的病人選擇和取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)選擇等具有重要的指導(dǎo)意義［37］。

抗體工程學(xué)將抗體的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系建立起來(lái)，可對(duì)抗體進(jìn)行人源化、點(diǎn)突變、片段化等改造，又能構(gòu)建新的抗體或制備類抗體分子，使其具有適當(dāng)?shù)目乖H和力、效應(yīng)功能和生物物理特性，進(jìn)而調(diào)動(dòng)機(jī)體發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，提高抗體的有效性和安全性［38］。

此外，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、反向遺傳學(xué)等學(xué)科的興起，有學(xué)者針對(duì)呼吸道合胞病毒研發(fā)出蛋白從頭設(shè)計(jì)精準(zhǔn)誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的方法［39］，此方法顛覆傳統(tǒng)思維，它可直接靶向特異性的抗原表位，促使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生預(yù)期的特定抗體，類似疫苗，并且比疫苗更加的精準(zhǔn)，省去體外抗體制備的一系列繁瑣工作。

4.2 計(jì)算機(jī)輔助抗體制備 近幾年開(kāi)發(fā)出的免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)、整合抗體序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)，這些數(shù)據(jù)庫(kù)推動(dòng)了計(jì)算機(jī)輔助抗體設(shè)計(jì)和虛擬篩選［40-41］。人工智能技術(shù)在知識(shí)提取和建模分析中展現(xiàn)出巨大潛力，在抗體藥物研發(fā)方面應(yīng)用前景廣泛［42］。利用人工智能可加快對(duì)新冠肺炎患者的診斷和疾病預(yù)后的評(píng)估，也可對(duì)新冠病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析與預(yù)測(cè)，又能在短短幾天內(nèi)識(shí)別并篩選數(shù)億種潛在的抗體治療方法［43-44］。此外，隨著各類檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和深度學(xué)習(xí)與人工智能在檢驗(yàn)領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，抗體制備技術(shù)平臺(tái)也迎來(lái)了集成化、自動(dòng)化、智能化、高通量的新發(fā)展趨勢(shì)［45］。計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)仍存在一些局限性，需要對(duì)算法，評(píng)分功能，數(shù)據(jù)庫(kù)和基準(zhǔn)測(cè)試工具等方面進(jìn)行改進(jìn)和完善。

5 展望

單克隆抗體的各種制備技術(shù)日新月異，但仍各有優(yōu)缺點(diǎn)，需要進(jìn)行資源整合?？贵w庫(kù)技術(shù)的文庫(kù)可來(lái)源于免疫過(guò)的野生型或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，也可來(lái)源特定疾病痊愈患者所分選出來(lái)的單個(gè)B 細(xì)胞，總之幾種制備技術(shù)可以交叉使用。結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析抗原與抗體的結(jié)合部位、二代測(cè)序、人工智能等技術(shù)可以整合到抗體藥物的設(shè)計(jì)、發(fā)現(xiàn)、篩選、測(cè)試等過(guò)程中，如李慧瑾等［46］將計(jì)算機(jī)虛擬技術(shù)和噬菌體文庫(kù)技術(shù)結(jié)合起來(lái)預(yù)測(cè)抗原抗體結(jié)合部分，進(jìn)而有效篩選H1N1 流感病毒HA 抗原表位。未來(lái)隨著各類新技術(shù)的產(chǎn)生和整合，將大大加快研發(fā)速度，可根據(jù)特定需要或疾病發(fā)病機(jī)制制備不同特性的抗體。