基于分子對(duì)接篩選藥桑中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分

藥桑（Morus nigra Linn.）為黑桑種植物藥桑的果實(shí)，含有黃酮、生物堿、多糖、香豆素、甾體、萜類和揮發(fā)油等成分，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗炎等作用[1]。研究表明[2-4]藥桑降血糖作用機(jī)制與抑制α-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)，但其具體活性成分尚未完全明確。近年來，分子對(duì)接技術(shù)在天然產(chǎn)物中篩選靶標(biāo)特異性活性成分方面應(yīng)用廣泛[5]，研究表明[6]Autodock vina 要比Autodock 準(zhǔn)確度要高，目前α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選方法主要有pNPG 法、Caco-2 細(xì)胞篩選模型、固化酶篩選模型、以糖類（麥芽糖等）為底物的篩選模型、微孔板篩選模型等，pNPG 法由于篩選過程耗材少，實(shí)驗(yàn)過程方便快捷等優(yōu)勢(shì)，是目前最常用、最經(jīng)典的酶抑制劑篩選方法，適用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的初篩[7]。本研究采用分子對(duì)接軟件Autodock vina 對(duì)藥桑果、葉、枝中有文獻(xiàn)報(bào)道的小分子與大分子α-葡萄糖苷酶進(jìn)行對(duì)接,采用pNPG 法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，依據(jù)其結(jié)合能力和活性大小，探究藥桑中潛在的α-葡萄糖苷酶的抑制成分，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純），磷酸二氫鉀（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，分析純），碳酸鈉（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，分析純），氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，S10137，生物技術(shù)級(jí)99 %）、α-葡萄糖苷酶（S10050-100 U）、異鼠李素（B21554，HPLC≥98 %）、異槲皮苷（B21527，HPLC≥98 %）、紫云英苷（B21704，HPLC≥98 %）隱綠 原 酸（B21587，HPLC≥98 % ）、阿 卡 波 糖（B20003，HPLC≥98 %）、白藜蘆醇（B20044，HPLC≥98 %）、新綠原酸（B20888，HPLC≥98 %）均購于上海源葉生物科技有限公司。 實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器R1001-VN 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-III A 型循環(huán)水式多用真空泵、WB-2000 型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），AB135-S型電子天平（瑞士梅特勒公司），Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀、DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、雷磁HY-1 型旋渦混勻儀（美國Ther?mo Fisher公司）。

1.3 藥材藥桑葉、果、枝均采于新疆和田地區(qū)同一棵桑樹，由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院徐海燕副教授鑒定為藥桑（Morus nigra Linn.）的葉（Folium Mori）、果（Fructus Mori）、枝（Ramulus Mori）。

1.4 方法

1.4.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中（https://www.rcsb.org/pdb）下載結(jié)合有α-D-glucose 的α-葡萄糖苷酶（PDB ID 3A4A）的晶體結(jié)構(gòu)，利用Discovery studio 4.5 試用版（DS）軟件提取復(fù)合物中原配體保存，確定結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)置對(duì)接參數(shù)conf.txt文件。除去蛋白質(zhì)中的水與調(diào)節(jié)溶劑分子，利用Autodock tools（Scripps 研究所的Olson 實(shí)驗(yàn)室）[8]為蛋白質(zhì)加氫、加電荷、設(shè)置原子類型，保存為pdbqt 格式備用。

1.4.2 配體分子準(zhǔn)備 通過課題組前期研究與查閱文獻(xiàn)[9-13]，確定藥桑中主要活性成分12 種，其結(jié)構(gòu)見表1 所示，采用ZINC（http://zinc.docking.org/）小分子數(shù)據(jù)庫下載活性成分SDF 格式的3D 結(jié)構(gòu)，并用OpenBabel-2.4.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)格式轉(zhuǎn)換工具將格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式備用。

表1 12種成分的分子式與結(jié)構(gòu)式

1.4.3 分子對(duì)接方法 將配體pdbqt 文件、受體pdbqt文件、對(duì)接參數(shù)文件conf.txt 和Autodock vina 程序放在一個(gè)文件夾內(nèi)，通過Windows命令程序cmd調(diào)用vi?na 對(duì)接程序進(jìn)行對(duì)接，記錄親和力大小，以臨床常用藥阿卡波糖的對(duì)接結(jié)果為閾值，親和力越小越好，低于閾值視為優(yōu)秀。為提高篩選的準(zhǔn)確性，本研究以親和力< -7.0 Kcal/mol 為潛在抑制劑篩選條件，最后用PyMOL 1.0（DeLano Scientific LLC 公司）作圖，分析受體-配體相互作用。

1.4.4 對(duì)接方法學(xué)評(píng)價(jià)[14]將提取出的原配體分子α-D-glucose 對(duì)接回受體的結(jié)合口袋，通過與原晶體復(fù)合物中的配體分子的POSE 進(jìn)行疊合比對(duì)，評(píng)價(jià)對(duì)接方法的準(zhǔn)確性。

1.4.5 樣品處理與緩沖鹽溶液配制 分別將桑葉、桑枝、桑椹，粉碎，過篩，分別稱取1 g 粉末，75 %乙醇按料液比1∶25（g/mL），超聲提取3 次，每次30 min，過濾，合并濾液，回流濃縮，水浴干燥后取適量粉末配制2 g/L 的溶液。用10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.86）將α-葡萄糖苷酶凍干粉配制0.5 U/mL的酶溶液。10 mmol/L（pH 6.86）的PBS 磷酸緩沖鹽的配制：分別取2.00 g NaOH 和13.60 g KH2PO4溶于250 mL 容量瓶和500 mL 容量瓶，從中分別取118 mL NaOH 溶液和250 mL KH2PO4溶液混合稀釋到1 000 mL 容量瓶即得10 mmol/L（pH 6.86）的PBS 磷酸緩沖鹽溶液。

續(xù)表

1.4.6α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn) 以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyran?oside，pNPG）為底物，阿卡波糖為陽性對(duì)照，分別測(cè)定藥桑不同藥用部位提取物及分子對(duì)接部分成分的酶抑制活性。實(shí)驗(yàn)分為空白組、樣品空白組，樣品組和對(duì)照組（n＝3）?？瞻捉M不加樣品和酶，樣品空白組不加α-葡萄糖苷酶溶液，對(duì)照組不加樣品。其余組依次加入PBS 緩沖液、樣品和α-葡萄糖苷酶液于96孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，加入10 mmol/L pNPG 溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，立刻測(cè)定405 nm 處吸光度（A）值[15]。按照公式I=1-[(As－Asb)]/(Ac-Ab)]計(jì)算其α-葡萄糖苷酶抑制率（I），Ac：對(duì)照組；Ab：空白組；As：樣品組；Asb：樣品空白組?？疾?～2.0 g/L 內(nèi)5個(gè)不同質(zhì)量濃度下各藥用部位提取物及部分活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。通過Graphpad Prism 計(jì)算IC50，具體滴加溶液量見表2。

表2 各組酶促反應(yīng)體系（n=3）

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果重新對(duì)接的配體與原受體結(jié)晶中的配體位置比較見圖1（A），α-D-glucose 的重新對(duì)接構(gòu)象與原始構(gòu)象在所選的對(duì)接參數(shù)下能夠較好的疊合，其對(duì)接評(píng)分為4.92，得分較高，表明所選用的蛋白結(jié)構(gòu)及對(duì)接方法比較可靠，可用于虛擬篩選。

圖1 原配體對(duì)接疊合比較圖

2.2 分子對(duì)接結(jié)果對(duì)藥桑中已報(bào)道的12種小分子和阿卡波糖分別與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接親和力結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)12種成分的親和力大小均小于0，且其中11 個(gè)化合物親和力小于閾值（< -5.14 Kcal/mol），其中結(jié)合性最好的是1-脫氧野尻霉素，評(píng)分為10.49，將評(píng)分排名前8 的對(duì)接模式作圖（親和力< -7.0 Kcal/mol），見圖2，它們與阿卡波糖一樣與α-葡萄糖苷酶氨基酸殘基Asp 69、Asp 215、Glu 277、Asp 352形成強(qiáng)氫鍵作用。

圖2 1-脫氧野尻霉素

表3 12種藥桑成分與α-葡萄糖苷酶的對(duì)接結(jié)果

2.3 藥桑各藥用部位提取物的抑制活性將藥桑不同藥用部位提取物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4 和圖3，可以很明顯的看出桑不同藥用部位提取物有良好的的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且各藥用部位提取物中桑枝活性>桑葉>桑椹。

圖3 藥桑各藥用部位劑量反應(yīng)曲線圖

表4 藥桑各藥用部位提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

藥用部位提取桑葉桑枝桑椹樣品濃度/（μg/mL）800.0 400.0 80.00 50.00 10.00 800.0 400.0 80.00 50.00 10.00 800.0 400.0 80.00 50.00 10.00抑制率/%96.25±0.05 89.42±0.03 75.00±0.54 63.00±1.64 52.00±0.02 96.40±0.05 92.64±0.73 82.00±1.35 74.00±0.03 53.00±0.01 93.09±0.03 83.34±0.01 64.00±0.50 42.00±0.45 38.00±0.65 IC50/（μg/mL）11.100 8.647 37.580

2.4 藥桑中部分高活性化合物的抑制活性將表3中打分值較高的成分異鼠李素、異槲皮苷、紫云英苷、隱綠原酸、阿卡波糖、白藜蘆醇、新綠原酸進(jìn)行活性驗(yàn)證，計(jì)算其IC50值。結(jié)果見表5，各樣品都表現(xiàn)出不錯(cuò)的結(jié)合活性，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其中異槲皮苷活性>白藜蘆醇>異鼠李素>紫云英苷>隱綠原酸，并且異鼠李素與紫云英苷的IC50值接近，其中阿卡波糖活性最好，IC50為1.92×10-4μg/mL。

表5 部分活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

組別阿卡波糖異槲皮苷異鼠李素紫云英苷隱綠原酸白藜蘆醇樣品濃度/（μg/mL）0.001 0.005 0.010 0.050 0.100 120.0 160.0 200.0 240.0 280.0 120.0 160.0 200.0 240.0 280.0 120.0 160.0 200.0 400.0 600.0 160.0 200.0 400.0 600.0 800.0 400.0 800.0 1200 1600 2000抑制率/%72.53±0.23 85.31±0.15 92.53±0.21 95.21±0.06 98.32±0.13 21.59±0.21 43.08±0.82 45.37±0.64 53.24±0.29 58.36±0.31 14.64±1.20 20.16±0.10 42.44±1.51 54.46±0.08 59.66±0.07 10.24±0.24 11.71±0.54 28.75±0.64 59.62±0.15 69.23±0.13 18.22±0.54 23.53±0.06 39.89±0.09 45.55±0.15 66.82±0.02 56.04±0.15 60.36±0.15 66.52±0.14 69.76±0.45 80.19±0.06 IC50/（μg/mL）1.92×10-4 220.7 353.2 355.4 556.0 312.9

3 討論

本研究應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)藥桑中12 種成分對(duì)α-葡萄糖苷酶（3A4A）親和力大小均小于0，且其中11 種成分親和力小于阿卡波糖親和力閾值（<-5.14 Kcal/mol）。此外，1-脫氧野尻霉素、異槲皮苷、蕎麥堿、白藜蘆醇、異鼠李素、紫云英苷、槲皮素、隱綠原酸與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合活性較高（親和力< -7.0 Kcal/mol），這8 種成分與阿卡波糖皆與α-葡萄糖苷酶氨基酸殘基Asp 69、Asp 215、Glu 277、Asp 352形成強(qiáng)氫鍵作用，這可能是它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的形成強(qiáng)抑制作用的主要作用力?；钚则?yàn)證實(shí)驗(yàn)表明其中5 種得分值高的成分具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且異槲皮苷活性>白藜蘆醇>異鼠李素>紫云英苷>隱綠原酸，表明分子對(duì)接篩選酶抑制劑具有一定的準(zhǔn)確性。

Chen 等[16]研究發(fā)現(xiàn)桑樹不同藥用部位中黃酮（Morin、sanggenon C、kuwanon G 和morusin）、黃酮醇（山奈酚、槲皮素、蘆丁和異槲皮苷）和生物堿（1-脫氧野尻霉素）是α-葡萄糖苷酶的抑制成分，與本研究部分化合物一致，并且本研究采用pNPG 法證實(shí)了藥桑各藥用部位醇提物活性高于部分單體化合物，且各藥用部位提取物中桑枝活性>桑葉>桑椹，本研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、異鼠李素、紫云英苷、隱綠原酸也是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，進(jìn)一步擴(kuò)大了藥桑資源活性成分范圍。此外，這8種成分在體內(nèi)也具有多種降糖活性，如改善胰島素抵抗[17]，保護(hù)胰島β 細(xì)胞等功效[18-19]，其具有多靶點(diǎn)多通路治療糖尿病的作用。因此，通過分子對(duì)接進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選是可行且高效的。本研究應(yīng)用分子對(duì)接原理篩選到8 種具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性成分，為藥桑通過抑制α-葡萄糖苷酶抗糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)做了新的補(bǔ)充，為從天然產(chǎn)物中篩選活性成分提供了新的技術(shù)參考。