不同滅菌方法對(duì)地麥活性糖中4種糖類(lèi)成分及微生物的影響*

張建偉，劉海燕，劉 瑾，鄧龍飛，劉 力，沈婷婷，喬哥娣，蔣潔瑩

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

生地低聚糖和麥冬多糖組合物（以下稱(chēng)地麥活性糖）由生地低聚糖和麥冬多糖組成，其中生地低聚糖主要由蔗糖、棉子糖和水蘇糖組成[1]；麥冬多糖主要由35分子果糖和1分子葡萄糖通過(guò)化學(xué)鍵連接而成[2]。課題組前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生地低聚糖能顯著改善慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）的氣道病理變化，減輕氣流受阻，有效延緩和逆轉(zhuǎn)COPD的發(fā)生[3]；麥冬多糖能夠保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制心肌缺血造成的自由基生成增加，并清除氧自由基[4]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中，地黃和麥冬均可用于內(nèi)熱消渴等癥，而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇，課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)地麥活性糖可以降低糖尿病患者血糖，具有良好的臨床應(yīng)用前景。地麥活性糖分別由生地黃和麥冬經(jīng)水煎煮、除雜、膜分子截留分離等制得，制備工藝較復(fù)雜，糖是微生物的一種營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中極容易被微生物污染、霉變，從而影響藥品的安全性和質(zhì)量控制[5]。滅菌是保證中藥臨床安全的有效途徑。不同滅菌方法的滅菌效力與制劑種類(lèi)和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)，滅菌可影響制劑中化學(xué)成分的含量[6-7]。因此，考察不同的滅菌方法對(duì)地麥活性糖中指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量，以及微生物數(shù)量的影響，旨在為地麥活性糖和其他糖類(lèi)制劑的滅菌方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 Agilent 1100型液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；SEDEX75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（法國(guó)SEDERE公司）；TG332A型微量電子分析天平（上海精密科技儀器有限公司）；FA2004B型電子分析天平（上海精密科技儀器有限公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XGL.DW型脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；60Co-γ輻照源（上海核銘輻射科技有限公司）；CA-1390-1型超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 材料 果糖對(duì)照品（批號(hào)：100231-201606，純度：99.7%）、蔗糖對(duì)照品（批號(hào)：111507-201704，純度：100%）、水蘇糖對(duì)照品（批號(hào)：112031-201701，純度：90.5%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；棉子糖對(duì)照品（批號(hào)：19042322，純度：99.6%）購(gòu)于上海同田生物技術(shù)有限公司；蛋白胨（批號(hào)：180716）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190424）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190529）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：181228）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：180619）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180420）均購(gòu)自上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；生地低聚糖（批號(hào)：20180911，20190418）、麥冬多糖（批號(hào)：20180514，20180524，20180528）由上海中醫(yī)藥大學(xué)制劑實(shí)驗(yàn)室制備；乙腈（色譜純）由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地麥活性糖滅菌 按照飲片生地黃-麥冬（1∶1），分別精密稱(chēng)取生地低聚糖（由生地黃經(jīng)過(guò)水提、濃縮、HPD100大孔吸附樹(shù)脂分離、截留分子量為1 000 Da和150 Da的膜分離等制得）[1]和麥冬多糖（由麥冬經(jīng)過(guò)水提、濃縮、80%乙醇兩次醇沉、截留分子量為10 000 Da和1 000 Da的膜分離等制得）[8]，加水超聲溶解，定容，配置成濃度為0.28 g/mL的地麥活性糖水溶液。

2.1.1 煮沸滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180524）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液于燒杯中，稱(chēng)質(zhì)量后，加熱煮沸30、60、90、120 min，放至室溫，用水補(bǔ)質(zhì)量，混勻，備用。

2.1.2 100 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180514）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液于口服液體藥用高密度聚乙烯瓶，置脈動(dòng)真空滅菌器中，100 ℃流通蒸汽滅菌60、120 min，備用。

2.1.3 加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180528）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液，加入適量防腐劑，配制成苯甲酸鈉（3‰）-地麥活性糖水溶液、羥苯乙酯（0.5‰）-地麥活性糖水溶液、山梨酸（2‰）-地麥活性糖水溶液、苯甲酸鈉（3‰）-羥苯乙酯（0.5‰）-地麥活性糖水溶液，置脈動(dòng)真空滅菌器中，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min，備用。

2.1.4 120 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180524）+生地低聚糖（批號(hào)：20190418）]水溶液于滅菌錐形瓶中，置脈動(dòng)真空滅菌器中，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，備用。

2.1.560Co-γ射線輻照滅菌 地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180514）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]粉末分裝于鋁箔袋，10 kGy60Co-γ射線輻照12 h，備用。

2.2 微生物限度檢查[9]參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查，采用“微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）項(xiàng)下平皿法測(cè)定滅菌前后各地麥活性糖中需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)；采用“控制菌檢查法”（通則1106）項(xiàng)下平皿法測(cè)定樣品中的大腸埃希菌，檢查標(biāo)準(zhǔn)為非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 滅菌對(duì)微生物限度檢查結(jié)果的影響（cfu/mL）

由表1知，地麥活性糖在制備過(guò)程中未污染霉菌、酵母菌、大腸埃希菌；煮沸、100 ℃流通蒸汽、120 ℃流通蒸汽、60Co-γ射線輻照及加防腐劑后100 ℃流通蒸汽滅菌均可明顯降低地麥活性糖需氧菌總數(shù)，且滅菌時(shí)間越長(zhǎng)滅菌效力越好，進(jìn)一步結(jié)合滅菌前后地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量變化，確定最佳滅菌方法。

2.3 果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量測(cè)定

2.3.1 溶液配制

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取適量果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對(duì)照品于2 mL容量瓶中，超聲溶解后定容，搖勻，上述對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.9、0.9、1.0、2.0 mg/mL。再分別量取果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對(duì)照品溶液300、300、350、600 μL于2 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.13、0.13、0.18、0.59 mg/mL果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖混合對(duì)照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 精密移取120 μL滅菌前后的地麥活性糖水溶液于10 mL容量瓶中（或精密稱(chēng)量0.15 g左右輻射前后的地麥活性糖于50 mL容量瓶，加適量水超聲至溶解），加水定容，搖勻，過(guò)0.45 μm水性濾膜，續(xù)濾液供HPLC分析。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Shodex NH2P-50 4E（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水；梯度洗脫（0～15 min，75%～45%乙腈；15～30 min，45%乙腈）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射器檢測(cè)溫度：40 ℃，采集頻率：3.125 Hz。以對(duì)照品質(zhì)量（μg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)方法學(xué)考察，所建方法中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的線性范圍分別為分別0.525～10.508 μg（r=0.999 3）、0.614～12.284 μg（r=0.999 2）、0.636～12.727 μg（r=0.999 4）、0.755～15.102 μg（r=0.999 3），精密度、24 h穩(wěn)定性和加樣回收率等均符合含量測(cè)定要求。4種對(duì)照品、地麥活性糖及麥冬多糖的色譜圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的HPLC 色譜圖

圖2 地麥活性糖的HPLC 色譜圖

圖3 麥冬多糖的HPLC 色譜圖

2.3.3 煮沸滅菌樣品含量 分別精密量取加熱煮沸0、30、60、90、120 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 煮沸滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表2 煮沸滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表2可知，與滅菌前（0 min）比較，隨著煮沸滅菌時(shí)間的增加，地麥活性糖溶液顏色逐漸加深，果糖含量逐漸增加，且煮沸60 min時(shí)，果糖含量明顯增加，蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量變化均小于5.58%，說(shuō)明果糖含量的增加可能由麥冬多糖分解引起。煮沸90 min時(shí)，果糖含量進(jìn)一步增加，且蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量分別降低9.85%、12.45%和11.74%。結(jié)合“2.2微生物限度檢查”結(jié)果，煮沸滅菌時(shí)間不長(zhǎng)于60 min，地麥活性糖中微生物數(shù)量即符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量也無(wú)顯著變化。

2.3.4 100 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取100 ℃流通蒸汽滅菌0、60、120 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 100 ℃流通蒸汽滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表3 100 ℃流通蒸汽滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表3可知，與滅菌前（0 min）比較，100 ℃流通蒸汽滅菌60 min，果糖峰面積對(duì)數(shù)增加19.71%，滅菌120 min，果糖含量明顯增加；滅菌后蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量變化均小于5%。說(shuō)明果糖含量的增加可能由麥冬多糖分解引起。100 ℃流通蒸汽滅菌60 min，微生物限度符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，進(jìn)一步考察100 ℃流通蒸汽滅菌30 min對(duì)果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.5 加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取添加或不添加防腐劑、100 ℃流通蒸汽滅菌30 min前后的地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 4 種防腐劑對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表4 4 種防腐劑對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表4可知，與滅菌前（0 min）比較，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量均無(wú)明顯變化，且防腐劑3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、2‰山梨酸、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯對(duì)滅菌前后地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量均無(wú)明顯變化，但采用山梨酸為防腐劑在滅菌過(guò)程中，包裝容器發(fā)生膨脹。結(jié)合“2.2”項(xiàng)下微生物限度檢查結(jié)果，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min可有效殺滅降低地麥活性糖需氧菌，而不影響4種糖類(lèi)成分含量，防腐劑可選擇3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯。

2.3.6 120 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取120 ℃流通蒸汽滅菌0、15 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 120 ℃流通蒸汽滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表5 120 ℃流通蒸汽滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表5可知，與滅菌前（0 min）比較，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，地麥活性糖中果糖含量明顯增加，蔗糖和棉子糖含量無(wú)明顯變化，水蘇糖含量降低9.29%，說(shuō)明地麥活性糖中的生地低聚糖和麥冬多糖在120 ℃流通蒸汽條件下均發(fā)生分解，故不能采用120 ℃流通蒸汽滅菌。

2.3.760Co-γ射線輻照滅菌樣品含量 分別精密量取10 kGy60Co-γ射線輻照前后的地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 60Co-γ 射線輻照滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表6 60Co-γ 射線輻照滅菌對(duì)4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表6可知，輻照滅菌前后，地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量無(wú)明顯變化，說(shuō)明10 kGy60Co-γ射線輻照12 h不影響果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量，可用于地麥活性糖滅菌。

3 討 論

近年來(lái)，有關(guān)糖類(lèi)成分治療慢性阻塞性肺疾病[3]、抗急性心肌缺血[4]、抗炎[10]及抗氧化[11]等藥理活性研究越來(lái)越多。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)地麥活性糖具有良好的降低高血糖療效。低聚糖、多糖類(lèi)藥物制備工藝復(fù)雜，在制備、儲(chǔ)存過(guò)程中容易污染微生物而變質(zhì)，而滅菌方法對(duì)低聚糖、多糖成分影響的研究報(bào)道較少。

目前，常用的物理滅菌方法有干熱滅菌法、濕熱滅菌法、射線滅菌法、微波滅菌法、過(guò)濾除菌法和60Co-γ射線輻照等。不同的滅菌方法對(duì)多糖含量產(chǎn)生不同程度的影響，如邱曉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度高于60 ℃時(shí)，黨參總多糖可能在高溫下分解，提取液中多糖含量下降。100 ℃流通蒸汽滅菌和煮沸滅菌，不能保證殺滅樣品中所有細(xì)菌的芽孢，除制備過(guò)程盡量避免微生物污染，特別是制備成口服液、注射液等液體制劑時(shí)，可添加適宜的抑菌劑，故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察添加或不添加防腐劑，100 ℃流通蒸汽滅菌對(duì)糖類(lèi)成分和微生物的影響；國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》（2015年版）建議中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過(guò)10 kGy[13]，本研究同時(shí)考察10 kGy60Co-γ射線輻照對(duì)地麥活性糖中4種糖類(lèi)成分含量的影響。

多糖或低聚糖在濃硫酸和高溫條件下，會(huì)水解成單糖，并脫水生成糠醛或糠醛衍生物，再與蒽酮或苯酚生成有色化合物，利用該原理，總糖主要通過(guò)苯酚-硫酸顯色法和蒽酮-硫酸顯色法法測(cè)定含量[14-15]。糖類(lèi)成分在高溫滅菌過(guò)程中可能分解為果糖或葡萄糖等，檢測(cè)總糖含量，不足以反映地麥活性糖中生地低聚糖（指標(biāo)成分為果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖）和麥冬多糖的含量變化。張文婷等[16]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD），以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)生地黃在炮制過(guò)程中寡糖成分的變化，其中蔗糖受熱分解成果糖與葡萄糖，棉子糖受熱分解成蜜二糖、蔗糖和果糖，水蘇糖受熱主要分解成甘露三糖。XU Z等[17]采用超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography,UHPLC）、HPLC、三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和紫外光譜等快速定量分析技術(shù)，研究了3種苷類(lèi)（梓醇、豆蔻苷和苦杏仁苷）和6種糖（鼠李糖、果糖、蔗糖、蜜二糖、水蘇糖和毛蕊花糖）等含量測(cè)定方法。WANG X等[18]采用HILIC-UHPLC-TQ-MS/MS技術(shù)，以甲醇-水（60∶40）為流動(dòng)相，建立了同時(shí)分析地黃中環(huán)烯醚萜苷（秋梨醇、梓醇）和低聚糖（蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露糖和水蘇糖）含量的方法。本研究通過(guò)HPLC-ELSD方法，檢測(cè)不同滅菌方法對(duì)指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量影響，評(píng)價(jià)生地低聚糖在不同滅菌過(guò)程中的穩(wěn)定性，并通過(guò)果糖含量變化間接反映以果糖組成為主的麥冬多糖的穩(wěn)定性。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同滅菌方法對(duì)不同批次地麥活性糖中微生物數(shù)量及果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量影響的考察結(jié)果一致，煮沸滅菌30 min、100 ℃流通蒸汽滅菌30 min（防腐劑可選擇3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯）、10 kGy60Co-γ射線輻照12 h均可有效殺滅地麥活性糖中的需氧菌、霉菌和酵母菌，樣品的微生物數(shù)量符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部中的微生物限度要求，同時(shí)不影響地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)考察煮沸滅菌、100 ℃流通蒸汽滅菌、加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌、120 ℃流通蒸汽滅菌、10 kGy60Co-γ射線輻照對(duì)地麥活性糖指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量及微生物數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)煮沸滅菌60 min以上，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min以上，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，雖然能有效殺滅地麥活性糖溶液中的微生物，但地麥活性糖中果糖含量明顯升高、水蘇糖含量明顯降低。防腐劑3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯對(duì)地麥活性糖中4種糖含量無(wú)影響，可為地麥活性糖和其他糖類(lèi)藥物的滅菌方法提供參考。因缺乏麥冬多糖標(biāo)準(zhǔn)品，本研究主要考察了不同滅菌方法對(duì)不同批次地麥活性糖中生地低聚糖指標(biāo)成分的影響，并通過(guò)果糖含量變化間接反映以果糖組成為主的麥冬多糖的變化，需要進(jìn)一步研究麥冬多糖的含量測(cè)定方法。