芪黃藥對改善糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制探討*

李雪瑩，何春承，邱 偉，黎 明，許祿華，林豐夏，趙貝貝

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院/深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)），廣東 深圳 518133；2.深圳恒特醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000；3.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510006）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是終末期腎臟病的第二位原因，是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。既往研究多認(rèn)為DN的病理改變以腎小球?yàn)橹?，但最新研究發(fā)現(xiàn)以成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的腎間質(zhì)纖維化亦是DN早期重要的病理改變[1-2]。腎間質(zhì)纖維化在慢性腎臟病的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但具體發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床尚缺乏有效的治療手段。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的病理基礎(chǔ)以虛為本，以濁瘀為標(biāo)，治以益氣降濁為基本大法[3-4]，中藥防治DN具有研究前景[5]。本研究團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)，芪黃藥對，即黃芪、大黃組合是益氣降濁法治療慢性腎臟疾病最常用的中藥[6]，在延緩慢性腎臟疾病進(jìn)展方面有明確的臨床效果，但目前仍沒有文獻(xiàn)報道芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。因此本研究擬觀察芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及炎癥因子的影響，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討可能的機(jī)制，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡SPF級Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量約180 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：11400700344861。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物飼養(yǎng)室，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，12 h明暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)通過深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批件號：2020033102，嚴(yán)格按照相關(guān)條例執(zhí)行。

1.2 藥物與試劑 道地藥材黃芪（批號：20110105）、大黃（批號：20080312）購自深圳康美藥業(yè)公司；鏈脲佐菌素（批號：09171211）購自瑞士Alexis公司；IL-1β ELISA試劑盒（批號：MM-0922R2）、IL-6 ELISA試劑盒（批號：MM-1011M2）、IL-17 ELISA試劑盒（批號：MM-51291H2）、VEGFA ELISA試劑盒（批號：MM-60042O2）、MAPK ELISA試劑盒（批號：MM-70557R2）、TNF-α ELISA試劑盒（批號：MM-0132M2）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；α-SMA抗體（批號：GR3241135-2）、山羊抗小鼠抗兔IgG/IgM（批號：GB23303）均購自美國Thermo Fisher公司；血糖監(jiān)測儀（批號：10131214）及血糖試紙（批號：26001921）購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；尿蛋白定量測試盒（批號：AUZ3672）、肌酐測試盒（批號：AUZ3621）、尿素氮測試盒（批號：AUZ3653）均購自深圳愛樂信生物有限公司。

1.3 主要儀器 代謝籠（意大利TECNIPLAST 公司）；SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；全封閉自動脫水機(jī)、組織包埋機(jī)（深圳達(dá)科為公司）；CRYOSTAR NX50型冰凍切片機(jī)（美國Thermo公司）；高速冷凍型微量離心機(jī)（美國Thermo公司）；BV-2型垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；倒置熒光成像分析顯微鏡（奧林巴斯有限公司）。

2 方 法

2.1 芪黃藥對提取液制備 根據(jù)文獻(xiàn)方法[7]，黃芪、大黃按2∶1比例粉碎，加8倍量60%乙醇-水浸泡30 min，常壓下加熱回流提取3次，每次1 h，濾過合并提取液；減壓回收乙醇，添加蒸餾水，調(diào)pH值至6.5～7.0，并調(diào)整至相當(dāng)于含生藥0.5 g/mL。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測芪黃藥對改善糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn) TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集黃芪、大黃及其化合物成分信息，通過GeneCards獲取腎間質(zhì)纖維化的靶標(biāo)蛋白，所獲得的基因交集使用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫結(jié)合R語言進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

2.3 造模與分組 30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為對照組，予水和普通飼料；剩余20只予高糖高脂飼料，并腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg），造模后監(jiān)測空腹血糖，當(dāng)空腹血糖維持大于16.7 mmol/L時即為造模成功。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組和芪黃藥對組，每組10只。

2.4 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)芪黃藥對成人常規(guī)服用劑量（27 g/d），采用人與大鼠的體表面積換算系數(shù)計算出大鼠的每日給藥劑量為2.8 g/kg，根據(jù)大鼠180 g體質(zhì)量計算為0.51 g生藥；芪黃藥對提取液濃度為0.5 g/mL，因此每日灌胃量為1 mL。芪黃藥對組大鼠每日予以1 mL芪黃藥對提取液灌胃1次，正常組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥28 d。模型組及芪黃藥對組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，對照組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 血尿生化指標(biāo)檢測 大鼠禁食不禁水12 h，取出固定后用剪刀將大鼠尾尖剪去約0.5 cm，將血滴加至血糖試紙上，血糖儀讀取數(shù)值，干棉球擦凈血液并按壓止血。每周測量1次血糖。末次給藥后將大鼠置入代謝籠內(nèi)，采集其24 h排泄尿液，計算其24 h尿量并進(jìn)行尿蛋白定量。腹膜內(nèi)注射硫噴妥鈉（200mg/kg）處死大鼠，取全血標(biāo)本，室溫靜置2 h，4 ℃3 000 r/min離心15 min，取上清血清，使用試劑盒檢測肌酐和尿素氮。

2.5.2 免疫組化染色與分析 將腎臟組織樣品固定在4%多聚甲醛溶液中，冷卻，脫水，石蠟包埋及切片。乙醇脫蠟至水，抗原修復(fù)，5%的山羊血清室溫封閉30 min，加入稀釋好的一抗α-SMA（1∶200），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次后滴加稀釋好的二抗（山羊抗兔/鼠HRP），37 ℃孵育30 min。PBS清洗3次后，DAB避光顯色，鏡下觀察直到棕褐色陽性結(jié)果出現(xiàn)。水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，使用Image J軟件計算每個視野下陽性結(jié)果的積分吸光度和面積。

2.5.3 腎組織IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α水平取腎組織，使用10倍體積PBS冰上研磨，研磨后4 ℃靜置2 h，然后3 000 r/min離心20 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作，樣本孔按10∶1比例加上清液，后再以40∶1比例加稀釋液，再分別加入IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α抗體；空白對照孔不加任何試劑；酶標(biāo)儀上450 nm處，用空白對照孔為標(biāo)準(zhǔn)，測各孔光密度值。每個樣本各5孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠空腹血糖水平比較 與對照組比較，模型組及芪黃藥對組大鼠空腹血糖水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪黃藥對組大鼠空腹血糖水平在第14天、第21天明顯降低（P＜0.05）；第28天空腹血糖水平有所下降，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠空腹血糖水平比較（，n=10）

3.2 各組大鼠24 h尿蛋白、腎功能比較 與對照組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪黃藥對組大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明顯降低（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠24 h 尿蛋白、腎功能比較（，n=10）

3.3 芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響 對照組大鼠腎組織α-SMA表達(dá)不明顯；模型組大鼠α-SMA在腎間質(zhì)中明顯表達(dá)，見大量深棕黃色物質(zhì)；芪黃藥對組大鼠腎間質(zhì)的α-SMA表達(dá)明顯減少。（見圖3）

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA 表達(dá)情況（免疫組化）

與對照組比較，模型組大鼠α-SMA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪黃藥對組大鼠α-SMA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。（見圖4）

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA 表達(dá)情況比較（，n=10）

3.4 芪黃藥對靶標(biāo)及腎間質(zhì)纖維化靶基因篩選與交集 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選黃芪及大黃相關(guān)有效化合物和作用靶點(diǎn)。逐一對應(yīng)有效成分和靶點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成Gene Symbol后，共得到芪黃藥對的有效化合物24個，對應(yīng)靶點(diǎn)102個。以“Diabetic Nephropathy”為關(guān)鍵詞，分別從GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫獲得2 974、251、19個靶點(diǎn)，篩查重復(fù)值后得到3 149個靶點(diǎn)；以“Renal tubular fibrosis”為關(guān)鍵詞，分別從GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫獲得3 344、207、0個靶點(diǎn)，篩查重復(fù)靶點(diǎn)后得到3 511個靶點(diǎn)，兩者分別匯總再取交集，共得到4 976個DN腎間質(zhì)纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。兩者交集獲得芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的可能作用靶點(diǎn)55個，對應(yīng)有效化合物22個，其中大黃7個，黃芪15個，利用Cytoscape軟件構(gòu)建芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的“有效成分-作用靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖5。其中，各化合物連接度的平均值為7.8，中位數(shù)為4。度值最高的為槲皮素（quercetin)，其余依次為山柰酚（kaempferol）、異鼠李亭（isorhamnetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）和芒柄花黃素（formononetin）等，度值排名前10的化合物信息見表1。這些度值較高的化合物可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵化合物。

表1 芪黃藥對改善DN 的關(guān)鍵化合物

圖5 芪黃藥對治療DN 腎間質(zhì)纖維化的“有效化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

3.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn) 將上述獲得的芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的55個作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，然后使用Cytosacpe軟件對其進(jìn)行優(yōu)化，得到最終的芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的連接度中位數(shù)為19.3，節(jié)點(diǎn)介度中位數(shù)為1.31×10-2，節(jié)點(diǎn)緊密度中位數(shù)為0.602，其中連接度、介度、緊密度均超過中位數(shù)的靶點(diǎn)有14個（見表2），推測這些靶點(diǎn)可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖6 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的PPI 圖

3.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能和通路分析結(jié)果 根據(jù)GO和KEGG分析結(jié)果確定芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化功能及作用機(jī)制，以分析芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的可能途徑。GO分析獲得209個生物學(xué)功能，其中60條有顯著意義（P＜0.01），KEGG分析獲得88條通路，其中65條有顯著意義（P＜0.01）。根據(jù)P由低到高，分別選取排名前20者，繪制芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的GO功能分析和KEGG通路富集分析結(jié)果的氣泡圖，見圖7～8。其中排序越靠前，提示越可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的主要生物學(xué)功能和作用機(jī)制。

芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的GO功能分析主要富集在炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路、細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程、平滑肌細(xì)胞遷移、巨噬細(xì)胞分化、成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控和正調(diào)控胰島素樣生長因子受體信號通路等生物學(xué)功能。（見圖7）

圖7 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的GO 功能分析結(jié)果

芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的KEGG通路富集分析主要富集在炎癥反應(yīng)，液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化，腫瘤壞死因子信號通路，細(xì)胞凋亡，松弛素信號通路，HIF-1信號通路，MAPK信號通路，IL-17信號通路，NF-κB信號通路，p53信號通路和VEGF信號通路等相關(guān)通路。（見圖8）

圖8 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析結(jié)果

3.7 ELISA驗(yàn)證芪黃藥對對預(yù)測靶標(biāo)的影響 對預(yù)測的IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8靶標(biāo)及炎癥因子IL-1β、IL-17進(jìn)行ELISA驗(yàn)證。與對照組比較，模型組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，芪黃藥對組大鼠腎組織中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17水平均明顯降低（P＜0.05），而CASP3水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖9）

圖9 各組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17 水平比較（，n=10）

4 討 論

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，臨床上可引起各系統(tǒng)重要臟器的嚴(yán)重并發(fā)癥，而DN是其最常見且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一。在西方國家，DN是終末期腎病的最主要病因，有將近40%的慢性腎衰由DN引起；而在我國，DN則是高達(dá)13.5%患者接受血液透析治療的原因[8]，此外它的發(fā)病率還在不斷增加[9]。因此如何有效預(yù)防DN發(fā)生并減慢其發(fā)展進(jìn)度，是目前內(nèi)分泌醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的熱門課題。然而盡管對DN發(fā)病機(jī)制的研究深度不斷增加，但有關(guān)DN臨床治療的研究進(jìn)展仍停滯不前?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是通過血壓控制、糖脂代謝控制及低蛋白飲食方案等對癥治療DN。近年來單純或聯(lián)合使用ACEI、ARB以減輕蛋白尿減少腎臟損傷亦取得一定臨床療效[10]，但仍有很大局限性。至今還未發(fā)現(xiàn)可以阻斷DN進(jìn)展的藥物，病情發(fā)展至腎功能衰竭階段時，只能采取腎臟替代治療維持生命。因此，尋找能改善DN的有效且安全的藥物具有重要意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的發(fā)展過程包括腎小球高濾過、蛋白尿進(jìn)展，然后是腎小球?yàn)V過率下降，最終發(fā)展為終末期腎病，其對應(yīng)的病理表現(xiàn)包括腎小球肥厚、腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥和纖維化[11]。既往大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DN是一種腎小球疾病，而腎間質(zhì)炎癥和纖維化通常被認(rèn)為是DN后期階段才會發(fā)生的病理改變。因此，以往對DN發(fā)病機(jī)制的研究大多圍繞腎小球進(jìn)行，而對體積占到整個腎臟體積90%的腎間質(zhì)的研究[12]則較少。但近年來的許多研究表明，即便是在DN早期，腎間質(zhì)病變也可獨(dú)立并早于腎小球損傷發(fā)生。有研究[13-14]分析了2型糖尿病的DN患者早期階段的腎臟結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示僅有30%患者表現(xiàn)為典型的糖尿病腎小球病變，而40%的患者患有更嚴(yán)重的腎間質(zhì)和（或）血管病變。并且，腎間質(zhì)病變不僅可能比腎小球損傷提前發(fā)生，其病變程度甚至可能決定了DN患者腎臟功能損傷的程度[15]。因此，腎間質(zhì)纖維化是DN重要的病理改變，延緩乃至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對改善DN預(yù)后至關(guān)重要。

中醫(yī)學(xué)沒有關(guān)于DN的病名記載及相關(guān)專著，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，DN屬中醫(yī)學(xué)“腎消”“虛勞”“水腫”“關(guān)格”等范疇。早在東漢張仲景的《金匱要略》就有相關(guān)論述：“小便不利者，有水氣，其人若渴，用栝蔞瞿麥丸主之”。又如《圣濟(jì)總錄》中所言：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開合不利，水液聚于體內(nèi)而出現(xiàn)水種”，認(rèn)為DN是腎氣虛衰，氣化失常開闔不利所致。而現(xiàn)代中醫(yī)對DN的辨證論治已基本趨于統(tǒng)一，認(rèn)為其證候本質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，即以虛為本，濁瘀為標(biāo)[3-4]。一方面，DN患者多有氣虛的證候特點(diǎn)，病位多在脾腎。脾虛則無力運(yùn)化水液，水液停聚成痰濁濕邪，阻礙氣機(jī)升降而出現(xiàn)嘔吐，濕邪外犯肌膚而出現(xiàn)浮腫、皮膚瘙癢；腎氣不足，膀胱氣化不利則有癃閉、蛋白尿等表現(xiàn)，DN患者多有倦怠乏力、氣短懶言、腰膝酸軟等脾腎虛衰的表現(xiàn)。另一方面，痰濁瘀阻血脈則出現(xiàn)高血壓，瘀阻心脈則出現(xiàn)心悸。濁瘀積久，因?qū)嵵绿摚膿p精血，形成惡性循環(huán)。這也和中醫(yī)“久病入絡(luò)”“久病必虛”“水停則血瘀，血瘀則水?！钡鹊睦碚摬恢\而合?？傮w而言，DN早期患者多缺乏特異性癥狀，中期患者普遍出現(xiàn)乏力、腰酸、浮腫等癥狀，晚期患者癥狀錯綜復(fù)雜。現(xiàn)代中醫(yī)藥臨床研究學(xué)者開展了大量關(guān)于DN的中醫(yī)臨床研究[16-19]，結(jié)果顯示，中醫(yī)藥不僅可以改善DN患者的臨床癥狀，還能減少尿蛋白排泄、改善腎功能，并且能提高DN患者的生存質(zhì)量。

而在中醫(yī)學(xué)使用益氣降濁法治療DN的藥物中，芪黃藥對，即黃芪、大黃是使用頻率最高且最具代表性的中藥[6]。黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水消腫、托毒排膿等功效，大黃具有瀉熱通腑、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效，兩者一補(bǔ)一瀉，與糖尿病腎病以虛為本、以濁瘀為標(biāo)的病機(jī)對應(yīng)。近年來多項體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明，黃芪、大黃對DN腎間質(zhì)纖維化有顯著的保護(hù)作用。如黃芪多糖為中藥黃芪的有效成分之一，具有抗應(yīng)激、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。黃芪多糖可以負(fù)性調(diào)控腎間質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減輕腎間質(zhì)纖維化[20]；下調(diào)NF-κB、MCP-1表達(dá)，從而降低24 h尿蛋白、NAG，保護(hù)腎間質(zhì)[21]；下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，保護(hù)足細(xì)胞，減輕腎臟肥大[22]。氧化應(yīng)激（oxidative stress）學(xué)說是目前最重要的DN發(fā)病機(jī)制相關(guān)學(xué)說之一[23]，腎間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中有非常重要的地位[24]，而黃芪多糖具有抗氧化應(yīng)激的作用[25]。大黃酸（Rhein）屬于大黃蒽醌衍生物中的一種，可以通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增生、腎臟固有細(xì)胞肥大及細(xì)胞外基質(zhì)堆積，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[26-27]，大黃制劑可通過AKI信號通路抑制氧化應(yīng)激等[28]達(dá)到對DN腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用。

本研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型觀察了芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及炎癥因子的影響。結(jié)果顯示，芪黃藥對能有效降低糖尿病腎病模型大鼠的24 h尿蛋白、肌酐和尿素氮水平。但芪黃藥對對大鼠空腹血糖影響不明顯，這表明芪黃藥對改善糖尿病腎病大鼠腎功能的機(jī)制并非直接控制血糖。α-SMA是肌成纖維母細(xì)胞的標(biāo)記分子，α-SMA表達(dá)增加是腎間質(zhì)纖維化的重要標(biāo)志[29]。免疫組化結(jié)果表明，α-SMA在模型組大鼠腎間質(zhì)中顯著表達(dá)，芪黃藥對能有效降低糖尿病腎病模型大鼠腎間質(zhì)的α-SMA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)證明芪黃藥對可以減輕糖尿病腎間質(zhì)纖維化。

以往對芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的研究多專注于單藥或某化合物的改善機(jī)制，而缺乏整體性、系統(tǒng)性。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬模擬的方法，系統(tǒng)地探討了芪黃藥對改善DN改善腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，芪黃藥對可以通過槲皮素、山柰酚、異鼠李亭、蘆薈大黃素、芒柄花黃素等有效成分，作用于IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、ERBB2、PPARG、NOS3等靶點(diǎn)，通過影響TNF、松弛素、HIF-1、MAPK、IL-17、NF-κB、p53、VEGF等信號通路，發(fā)揮改善DN腎間質(zhì)的血流動力學(xué)狀態(tài)、糖脂代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程的作用，進(jìn)而改善DN腎間質(zhì)纖維化。因此，本研究進(jìn)一步采用ELISA檢測腎臟組織中預(yù)測關(guān)聯(lián)度最高的靶標(biāo)IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8，以及炎癥因子IL-1β、IL-17水平。結(jié)果表明，模型組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平表達(dá)顯著增高，而芪黃藥對可以明顯降低大鼠腎組織中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17的水平。研究表明，VEGF通路參與了腎間質(zhì)纖維化的病理改變過程，其相關(guān)機(jī)制是調(diào)節(jié)血管新生、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖等。VEGFA可促進(jìn)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，使細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)累積，進(jìn)而加重腎纖維化[30]。MAPK通路的活化可激活下游TGF-β1基因的過度轉(zhuǎn)錄和翻譯，加劇ECM的沉積和炎癥反應(yīng)[31]。IL-1β、IL-6、IL-17與糖尿病腎病腎損害進(jìn)展有關(guān)[32-33]，其表達(dá)水平與糖尿病動物模型及糖尿患者的蛋白尿程度呈正相關(guān)，并可促進(jìn)糖尿病腎病的腎間質(zhì)纖維化[34]。表明芪黃藥對可能通過VEGF通路及MAPK通路改善糖尿病腎病炎癥反應(yīng)、清除炎癥因子而達(dá)到改善腎間質(zhì)纖維化的作用。

綜上，芪黃藥對作用機(jī)制軸可能是“多成分-靶點(diǎn)（VEGFA、MAPK）-表型（炎癥反應(yīng)）-功能（腎間質(zhì)纖維化）”。芪黃藥對具有保護(hù)腎功能、改善腎間質(zhì)纖維化、清除炎癥因子的作用。