基于TGF-β1/Smad通路探究補腎化瘀方對宮腔粘連大鼠子宮內膜纖維化的作用及機制*

李 姣，林 潔，易星星，邱冉冉

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）也稱為Asherman綜合征，是指子宮內膜基底層損傷后，功能層再生修復障礙及過度纖維化，正常組織被纖維組織所取代，宮腔部分或完全封閉的一種疾病，清宮術是導致IUA的主要原因之一[1-2]。由于IUA可導致妊娠早期反復流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血等不良妊娠結局，給育齡期女性的生殖生理健康帶來較大損傷。因此，改善IUA、恢復子宮功能，是當前IUA臨床治療亟待解決的關鍵問題[3]。目前，中醫(yī)藥作為治療IUA的主要手段之一，具有多成分靶點、防治結合的特點[4]。中醫(yī)臨床治療IUA多以補腎、活血、化瘀為基本治療原則[5-6]。已有多項研究表明，補腎化瘀法治療IUA有顯著療效，能夠促進患者子宮內膜修復，降低宮腔再粘連率，改善妊娠結局，提高生活質量，但其作用機制尚不清楚[7-8]。因此，本研究擬建立大鼠IUA模型，觀察補腎化瘀方對IUA大鼠子宮內膜纖維化的改善作用，探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級SD大鼠75只，健康未孕雌性，體質量160～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)條件為室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、飲水，實驗結束后麻醉處死全部大鼠。本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批準號：HNZYYDXDYFSYY20190325。

1.2 藥物與試劑 補腎化瘀方，方藥組成：紫石英15 g，補骨脂8 g，菟絲子8 g，桑寄生8 g，茺蔚子5 g，澤蘭8 g，澤瀉8 g，土鱉蟲8 g，三七3 g，覆盆子8 g，蓮子心3 g，甘草3 g，由本院藥劑科制成含有生藥2g/mL的藥液；SRI-011381 hydrochloride（TGF-β通路激活劑）（北京百奧萊博科技有限公司，批號：M05956-EKD）；蘇木素染液（批號：G1080）、伊紅染色液（批號：G1100）、Masson三色染色試劑盒（批號：G1340）均購自北京索萊寶科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R2856c）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R0012C）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA檢測試劑盒（批號：E-EL-R0896c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（批號：K1621）、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（批號：4309155）均購自美國Thermo scientific公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）兔單抗（批號：5154）、Smad3兔單抗（批號：9523）、Smad4兔單抗（批號：46535）、p-Smad3兔單抗（批號：9520）、p-Smad4兔單抗（批號：38454）均購自美國CST公司；Smad7免單抗（批號：ab264745）、p-Smad7兔單抗（批號：ab272928）均購自艾博抗（上海）貿易有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（IgG-HRP）（上海碧云天生物技術有限公司，批號：A0208）。

1.3 主要儀器 DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；G:BOX型多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）；7500型PCR儀（美國Applied biosystems）；Multiskan MK3型酶標儀（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 造模與分組 參考文獻[9]方法建立大鼠IUA模型：大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，無菌條件下于大鼠下腹正中部位縱切一長3～4 cm的切口，分離組織，暴露子宮。在距宮體交界處1 cm的左宮角橫切開一微小切口，用自制的小刮勺向宮角遠端搔刮左側子宮腔4圈，搔刮長度約4 cm，待宮腔四壁有粗糙感時，停止搔刮。于宮腔內留置已備好的脂多糖棉線，同法處理右側子宮角。生理鹽水沖洗腹腔，縫合切口，留置約2 cm的棉線殘端于腹部，48 h后輕拉尾絲，取出宮內棉線。另取15只大鼠作為假手術組，僅在大鼠宮頸上方做一切口，不刮宮，生理鹽水沖洗腹腔后縫合。將建立IUA模型的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、補腎化瘀方組、補腎化瘀方+SRI-011381組、SRI-011381組，每組15只。

1.5 實驗給藥 按照前期預實驗結果及人與大鼠體表面積折算等效劑量，補腎化瘀方組、補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠灌胃給予補腎化瘀方藥液，8.9 g/kg，同時，補腎化瘀方+SRI-011381組、SRI-011381組大鼠腹腔注射SRI-011381，10 mg/kg，假手術組和模型組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)21 d。

1.6 觀察指標 末次給藥后24 h，各組大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，腹主動脈取血，置于4 ℃冰箱中靜置3 h，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，分裝后凍存于-80 ℃冰箱中，用于ELISA試劑盒檢測。分離各組大鼠子宮組織，觀察形態(tài)，取右側子宮組織于4%多聚甲醛中固定，用于HE和Masson染色，其余組織凍存于-80 ℃冰箱中，用于RT-qPCR及Western blotting檢測。

1.6.1 大鼠子宮組織病理變化 將大鼠子宮組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4 μm組織切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇及蒸餾水中復水，HE染色，脫水、透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠異位灶組織病理變化，在每張HE染色切片中隨機選取4個高倍鏡視野，計算每個視野的腺體數(shù)量并求平均值。

1.6.2 大鼠子宮組織纖維化情況 大鼠子宮組織固定、病理切片制作、脫蠟和復水過程同“1.6.1”。按照Masson染色試劑盒的操作步驟進行染色，光鏡下觀察子宮組織纖維化情況，在每張Masson染色切片中隨機選取4個高倍鏡視野，使用Image J軟件計算子宮內膜間質膠原纖維部分的面積與子宮內膜間質總面積之比，并求平均值。

1.6.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取各組大鼠血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.4 子宮內膜TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表達水平 取子宮組織，研磨勻漿后加入Trizol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物序列見表1。反應條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，擴增40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃5 min終止反應，實驗重復3次。根據(jù)2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.6.5 TGF-β1/Smad通路蛋白表達水平 取子宮組織，研磨勻漿后加入裂解液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，蛋白中加入loading buffer煮沸使之變性，按照30 μg/孔的上樣量進行SDSPAGE電泳，轉膜、封閉，放入各一抗稀釋液（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像儀中顯影。以GAPDH為內參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠子宮組織形態(tài)學觀察 假手術組大鼠子宮組織的表面呈淡粉色，延展性良好，形態(tài)勻稱；模型組大鼠子宮組織明顯增粗，有充血現(xiàn)象，延展性較差；與模型組比較，補腎化瘀方組大鼠子宮的增粗現(xiàn)象有所減輕，粗細均勻，延展性尚可；補腎化瘀方+SRI-011381組和SRI-011381組大鼠子宮組織仍有明顯增粗和充血，彈性減退。（見圖1）

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)

2.2 各組大鼠子宮組織病理學變化比較 HE染色結果顯示，假手術組大鼠子宮組織形態(tài)規(guī)則，可見清晰的內膜層、漿膜層和肌層，黏膜下層可見較多的腺體，排列整齊，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠子宮組織內膜層被破壞，結構疏松，有大量炎癥細胞浸潤，腺體數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，補腎化瘀方組大鼠子宮內膜增厚，腺體數(shù)量增加，炎癥細胞浸潤減少，而SRI-011381可削弱補腎化瘀方的作用，使大鼠的子宮內膜腺體數(shù)量減少，炎癥細胞浸潤增加（P＜0.05）。Masson染色顯示，假手術組大鼠子宮內膜間質組織僅可見少量藍色膠原纖維；模型組大鼠子宮內膜組織可見大量的膠原纖維生成，排列緊密，纖維化面積明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，補腎化瘀方組大鼠子宮內膜組織膠原纖維的生成減少，分布相對稀疏，纖維化面積減少（P＜0.05），而SRI-011381可削弱補腎化瘀方的作用，補腎化瘀方+SRI-011381組和SRI-011381組大鼠子宮內膜的纖維化面積均高于補腎化瘀方組（P＜0.05）。（見圖2～3）

圖2 各組大鼠子宮組織病理學變化（×400）

圖3 各組大鼠子宮組織腺體數(shù)量及纖維化面積比較（，n=15）

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，補腎化瘀方組、補腎化瘀方+SRI-011381 組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05），SRI-011381組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.05），其中補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于補腎化瘀方組（P＜0.05）。（見圖4）

圖4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（，n=15）

2.4 各組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達均明顯升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎化瘀方組和補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達均降低（P＜0.05），Smad7 mRNA表達升高（P＜0.05），SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達均升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表達降低（P＜0.05），其中補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達均高于補腎化瘀方組（P＜0.05），Smad7 mRNA表達低于補腎化瘀方組（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA 和Smad7 mRNA 表達水平比較（，n=15）

2.5 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad通路蛋白表達水平比較與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎化瘀方組和補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），SRI-011381 組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化表達降低（P＜0.05），其中補腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均高于補腎化瘀方組（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平低于補腎化瘀方組（P＜0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad 通路蛋白表達Western blotting 圖

圖7 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad 通路蛋白表達水平比較（，n=15）

3 討 論

近年來，IUA的發(fā)病率和檢出率逐年升高，患者發(fā)病年齡亦呈年輕化趨勢[10]。IUA具有子宮內膜纖維化的病理特征，而子宮內膜纖維化也是IUA的發(fā)病機制之一，防止宮腔黏膜過度纖維化具有重要意義[11-12]。IUA屬中醫(yī)“閉經(jīng)”“斷緒”“無子范疇”，先天腎氣不足、房勞多產(chǎn)、宮腔手術等均可致腎虛，同時宮腔手術可導致子宮受損，瘀血內停，邪氣趁虛而入，氣血運行不暢，因而導致患者經(jīng)血不通、閉經(jīng)、不孕，治療當以補腎、活血、化瘀為基本治療原則[13-14]。補腎化瘀方中紫英石、補骨脂為君藥，補腎助陽；菟絲子補益肝腎，潤燥補虛；桑寄生補肝腎，安胎元；覆盆子填精補髓，疏利腎氣；蓮子心交通心腎，可制君藥的溫燥；澤蘭、澤瀉、茺蔚子和三七調經(jīng)活血；土鱉蟲破血逐瘀；甘草調和諸藥。全方共奏補腎填精、活血化瘀之功效。

本研究建立了IUA大鼠模型，模型組大鼠子宮組織明顯增粗，內膜層破壞，有大量炎癥細胞浸潤，腺體數(shù)量明顯減少，纖維化面積明顯增加，表明造模成功。使用補腎化瘀方治療后，IUA大鼠子宮組織形態(tài)趨于正常，腺體數(shù)量增加、炎癥細胞浸潤和纖維化程度減輕，表明補腎化瘀方對IUA子宮內膜病理學改變具有改善作用。TNF-α、IL-1β、IL-6均是參與機體免疫應答、具有廣泛免疫調節(jié)的促炎性細胞因子，具有促進異位內膜及間質細胞的增殖、侵襲、轉移，以及促進血管生成的作用，能增加盆腔局部組織粘連及纖維化的發(fā)生率[15-16]。在本研究中，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，使用補腎化瘀方治療后，IUA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，表明補腎化瘀方可減輕大鼠IUA的炎癥反應。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的水平升高常在發(fā)生不受控制的纖維化反應的組織中出現(xiàn)，TGF-β1的表達水平亦與子宮內膜纖維化程度呈正相關[17]。Smad是參與TGF-β信號細胞內傳導的一個蛋白家族，TGF-β1/Smad通路的失調可導致機體組織纖維化，Smad3和Smad4是TGF-β1的關鍵下游信號分子，Smad7為Smad家族的抑制性蛋白，活化的TGF-β1與細胞膜上的受體結合后可催化Smad3和Smad4磷酸化，使Smad3與Smad4結合后入核，進一步調控靶基因的轉錄活動[18-19]。在本研究中，模型組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達和Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平明顯升高，Smad7 mRNA表達和Smad7蛋白磷酸化水平明顯降低，使用補腎化瘀方治療后，IUA大鼠的TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達和Smad3、Smad4蛋白磷酸化減少，Smad7 mRNA表達和Smad7蛋白磷酸化增加，表明補腎化瘀方可抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活。為了進一步探究補腎化瘀方對TGF-β1/Smad通路的調控作用，本研究使用了TGF-β通路激活劑SRI-011381，結果顯示，SRI-011381明顯削弱了補腎化瘀方對IUA大鼠子宮內膜纖維化的抑制作用，并進一步加重了纖維化病變和炎癥反應，提示補腎化瘀方對IUA的治療作用可能是通過抑制TGF-β1/Smad通路產(chǎn)生的。

綜上所述，補腎化瘀方可能通過影響TGF-β1/Smad通路的活化改善IUA相關子宮內膜纖維化，初步揭示了補腎化瘀方治療IUA的作用機制，但IUA是一種多因素疾病，病機復雜，補腎化瘀方治療IUA的療效及作用機制仍需進一步結合體外實驗及臨床研究加以闡明。