一起境外輸入性牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情

劉 存，呂桂霞，徐 鴻，黨安坤，梁 琳，陳 靜，孫圣福*，蘭鄒然*

(1.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，濟(jì)南 250100；2.東營(yíng)市現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，東營(yíng) 257091；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease, LSD)，又稱牛疙瘩皮膚病，是OIE須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄中一種牛的重要傳染病[1-2]。該病以皮膚結(jié)節(jié)病變?yōu)榈湫吞卣鳎l(fā)病率為3%～85%，通常死亡率為1%～5%，是嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的疾病之一[2-4]。2015年以后，我國(guó)周邊哈薩克斯坦、俄羅斯等國(guó)家LSD疫情頻繁發(fā)生，這使LSD輸入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)增大[5]。2019年，我國(guó)首次確診LSD疫情，在福建、江西、廣東、安徽、浙江等省也相繼發(fā)現(xiàn)了LSD疫情，但我國(guó)快速、及時(shí)采取綜合防控措施，及時(shí)阻斷了LSD繼續(xù)蔓延[2, 6-7]。

2020年11月初，山東濱州及東營(yíng)報(bào)告可疑LSD疫情，后經(jīng)山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心進(jìn)行病原學(xué)診斷，最終確診該起疫情為L(zhǎng)SD疫情。此次LSD疫情是山東省首次確診境外輸入LSD疫情。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit為Roche 產(chǎn)品；LSDV熒光PCR檢測(cè)試劑盒Biovet產(chǎn)品；核酸提取儀、熒光定量PCR儀均為Roche產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照LSDV GCPR基因序列(MN598006)，以Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，GCPR-F：5′-ATGAATTATACTCTTAGACAGTT-3′，GCPR-R：5′-AACAATGACATAGAGACACAATTTC-3′。

1.3 樣品采集

濱州共采集71份樣本，包括54份?？鼓?7份皮痂組織。東營(yíng)共采集273份樣本，包括144份?？鼓?29份皮痂。

1.4 DNA提取

皮痂樣本使用組織勻漿機(jī)對(duì)進(jìn)行勻漿。分別取 200 μL 皮痂組織勻漿液、牛抗凝全血，利用Roche核酸提取儀提取DNA。

1.5 熒光定量PCR方法檢測(cè)

以“1.4”所提取DNA為模板，參照牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 GCPR基因擴(kuò)增

以“1.4”提取的DNA為模板，利用GCPR-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的DNA片段并送測(cè)序。

1.7 GCPR基因比對(duì)分析及遺傳演化分析

將測(cè)序獲得的GCPR基因序列與GenBank中下載的LSDVGCPR基因序列，利用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，并利用MEGA 6.0軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)GCPR基因的遺傳演化關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)病牛臨床癥狀

流行病學(xué)調(diào)查顯示，濱州、東營(yíng)兩市購(gòu)買的牛均為由智利引進(jìn)的種用牛。該批牛2020年8月底由連云港入境，按要求隔離45 d后進(jìn)行入境檢疫，檢疫合格牛取得合格證明。濱州市業(yè)主共購(gòu)入奶牛、肉牛75頭，于2020年10月21日運(yùn)抵養(yǎng)殖場(chǎng)隔離場(chǎng)。在飼養(yǎng)約5 d后，隔離牛發(fā)病，出現(xiàn)精神不振、皮膚結(jié)節(jié)等臨床癥狀，之后出現(xiàn)死亡病例1例。11月4日，80%的牛表現(xiàn)出皮膚圓形結(jié)節(jié)、破傷以及皮痂(圖1)，符合皮膚性結(jié)節(jié)病的臨床癥狀，初步判定為可疑牛皮膚性結(jié)節(jié)病。2020年10月24日，東營(yíng)市業(yè)主由連云港購(gòu)入273頭，運(yùn)輸前即發(fā)現(xiàn)約40頭牛出現(xiàn)皮膚破傷。11月4日，專家現(xiàn)場(chǎng)診斷發(fā)現(xiàn)該批牛整群精神萎靡、消瘦，皮膚有圓形結(jié)節(jié)、破傷以及傷口愈合形成的結(jié)痂等臨床癥狀(圖1)，無(wú)死亡病例。濱州市及東營(yíng)市業(yè)主購(gòu)入牛運(yùn)抵隔離場(chǎng)后未與其他牛群混養(yǎng)。

黃色箭頭.局限性皮膚結(jié)節(jié)；紅色箭頭.皮膚破傷；藍(lán)色箭頭.傷口愈合后形成的結(jié)痂

2.2 實(shí)驗(yàn)室診斷

檢測(cè)結(jié)果顯示，濱州采集的樣品中，15份全血及17份組織樣品呈LSDV陽(yáng)性，共確診25頭牛。濱州采集的樣品中，3份全血及128份組織樣品呈LSDV陽(yáng)性。

2.3 GCPR擴(kuò)增

利用PCR方法成功擴(kuò)增出約1 045 bp的DNA片段，符合預(yù)期大小(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示，所獲序列為GCPR基因序列并暫標(biāo)記為CH/SDBinzhou/2020、CH/SDDongying/2020。

M.DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CH/SDBinzhou/2020；2.CH/SDDongying/2020

2.4 GCPR基因比對(duì)分析及遺傳演化分析

GCPR基因比對(duì)分析結(jié)果顯示，CH/SDBinzhou/2020和CH/SDDongying/2020GCPR基因與2019年我國(guó)新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的LSDVGCPR基因相似性最高。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)CH/SDBinzhou/2020和CH/SDDongying/2020GCPR基因存在12個(gè)核苷酸的插入(圖3)，這一插入序列與疫苗毒株Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及俄羅斯發(fā)現(xiàn)的疫苗樣毒株Saratov株在GCPR基因的核苷酸插入序列相同，這表明CH/SDBinzhou/2020株和CH/SDDongying/2020株GCPR基因具備疫苗樣毒株的特征。

圖3 LSDV GCPR基因核苷酸序列比對(duì)分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，CH/SDBinzhou/2020、CH/SDDongying/2020GCPR基因與我國(guó)新疆發(fā)現(xiàn)的LSDV毒株處同一小分支中，親緣關(guān)系較近。同時(shí)，我國(guó)LSDV毒株與Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及Saratov株等共處于同一大分支中(圖4)。

三角形標(biāo)記為本研究中涉及的LSDV毒株

3 討 論

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(LSD)是牛的一種重要的經(jīng)濟(jì)性傳染病，具有潛在的快速傳播特性，可造成重大經(jīng)濟(jì)損失[8]。2019年，歐亞大陸LSD疫情頻發(fā)發(fā)生，疫情形勢(shì)嚴(yán)峻，俄羅斯發(fā)生26起、土耳其131起，以色列、敘利亞等國(guó)也均有LSD疫情報(bào)道[9]，而中國(guó)、印度、孟加拉國(guó)也首次發(fā)現(xiàn)了LSD疫情[10-12]。我國(guó)所面臨的LSD疫情形勢(shì)更加復(fù)雜，并且防控LSD疫情輸入壓力增大。

2020年11月初，山東濱州及東營(yíng)報(bào)告可疑LSD疫情，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)最終此次疫情確診為L(zhǎng)SD疫情。發(fā)病牛呈現(xiàn)典型的臨床癥狀，全身皮膚出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)、結(jié)節(jié)脫落后形成破傷及結(jié)痂等。山東本次確診的LSD疫情與種牛引進(jìn)有關(guān)，是輸入型LSD疫情。該起LSD疫情已被快速處置，消除傳染源，對(duì)環(huán)境進(jìn)行全面消毒，降低了此次疫情繼續(xù)傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

LSD是由痘病毒科(Poxviridae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)LSDV引起[13]。LSDV基因組為雙股線性DNA，變異率低，具有遺傳穩(wěn)定性，而這一特性也被應(yīng)用于弱毒活疫苗與也毒株的鑒定[14-17]。2017年，俄羅斯發(fā)現(xiàn)流行的LSDV野毒株中存在疫苗樣毒株的特征，如GCPR基因中12個(gè)核苷酸序列的插入、EEV糖蛋白基因中27個(gè)核苷酸序列的缺失[18]。將這種現(xiàn)象歸結(jié)于疫苗毒株和野毒株共同存在于易感動(dòng)物體內(nèi)時(shí)發(fā)生的重組事件[19-20]。作者成功擴(kuò)增出此次疫情L(zhǎng)SDVGCPR基因，發(fā)現(xiàn)其中存在12個(gè)核苷酸序列的插入，具有疫苗毒株GCPR基因的特征。此外，研究也顯示，此類重組變異LSDV毒株在體內(nèi)和體外相較于經(jīng)典LSDV毒株引發(fā)更嚴(yán)重的病情。此次疫情中LSDVGCPR基因的疫苗毒株樣特征，提示山東輸入LSD疫情可能與LSDV重組變異毒株有關(guān)，但需要測(cè)定病毒全基因組序列進(jìn)行研究。

迄今為止，我國(guó)多個(gè)省份報(bào)導(dǎo)了LSD疫情，主要與邊境地區(qū)帶毒嗜血蟲(chóng)媒傳播、境外輸入帶毒種畜、由蟲(chóng)媒或進(jìn)出人員、交通工具等引入病毒[2, 6-7]。當(dāng)前，我國(guó)LSD疫情呈多點(diǎn)散發(fā)，而我國(guó)周邊LSD疫情形勢(shì)嚴(yán)峻，LSD輸入我國(guó)風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)增加。依托《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》，落實(shí)“早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早確診、早處置”動(dòng)物疫情防控工作，防止LSD疫情輸入我國(guó)，阻止LSD疫情的蔓延與擴(kuò)散，為我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)高效綠色健康可持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航。

4 結(jié) 論

確診濱州市、東營(yíng)市兩地疫情為牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情，這是山東省首次確診輸入性牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情。對(duì)引起疫情的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LSDV)毒株的GCPR基因開(kāi)展了比對(duì)分析和遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn)其具有與疫苗毒株及疫苗樣毒株相同的插入序列，具備疫苗樣毒株的特征，同時(shí)發(fā)現(xiàn)引起疫情的LSDV的GCPR基因與疫苗毒株Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及俄羅斯發(fā)現(xiàn)的疫苗樣毒株Saratov株位于同一進(jìn)化分支中。