1株豬鼻支原體的分離鑒定及致病性

王 佳，華利忠，劉蓓蓓，張 磊，袁 廳，甘 源，韋艷娜，邵國青,3，馮志新，熊祺琰,2*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點實驗室，南京 210014；2.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是豬上呼吸道的一種常見寄生菌，在豬群中廣泛流行，尤其是在斷奶仔豬及生長豬中感染率極高[1-2]。豬群感染豬鼻支原體后通常不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但特定情況下可以引起仔豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、中耳炎等癥狀，在大豬中則主要引發(fā)關(guān)節(jié)炎。同時豬鼻支原體在臨床中常與其他病原菌混合感染，有報道顯示豬鼻支原體在與豬繁殖與呼吸綜合征病毒或豬圓環(huán)病毒共感染時會加重對肺部的損傷[3-4]。目前國內(nèi)養(yǎng)豬行業(yè)對豬鼻支原體認(rèn)識較少，因其與副豬嗜血桿菌感染引起的臨床癥狀極其相似，常因誤診導(dǎo)致豬鼻支原體在豬場內(nèi)的持續(xù)性感染，造成豬群生產(chǎn)性能下降，產(chǎn)生嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于豬鼻支原體感染的普遍性，臨床常用抗生素已產(chǎn)生了一定的耐藥性[5]。目前豬鼻支原體致病機(jī)制尚不清楚，缺乏特異性血清診斷試劑盒，亦無商品化疫苗。

感染模型是致病機(jī)制研究和疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。從20世紀(jì)60年代開始陸續(xù)有多家研究機(jī)構(gòu)對豬鼻支原體發(fā)病模型開展研究，但至今為止尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的攻毒方法或菌株。本實驗室從安徽某豬場的發(fā)病豬關(guān)節(jié)液中分離得到一株支原體，經(jīng)PCR鑒定為豬鼻支原體。將該菌株人工感染自然分娩不吃初乳豬(SF-pCD豬，snatch-farrowed, porcine-colostrum-deprived pigs)，成功建立感染模型，為研究豬鼻支原體的致病機(jī)制及疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR試劑、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KM2培養(yǎng)基由本實驗室自制。

1.1.2 實驗動物 試驗豬選用1月齡SF-pCD豬(杜長大三元豬)9頭，由本實驗室和南京洲邦生物科技有限公司聯(lián)合培育。試驗豬使用前經(jīng)PCR/RT-PCR方法和血清抗體檢測確定豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬鼻支原體(Mhr)、豬肺炎支原體(Mhp)抗原、抗體均為陰性。

1.1.3 病料來源 病料采集自安徽省合肥市某豬場，該豬場20%左右保育豬出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂、食欲下降，跛行及關(guān)節(jié)腫大的癥狀，期間使用阿莫西林、頭孢噻呋等藥物治療無效，判斷可能存在豬鼻支原體強(qiáng)毒株感染。選擇關(guān)節(jié)腫脹的發(fā)病豬，于無菌條件下抽取關(guān)節(jié)液用于后續(xù)支原體的分離。

1.2 方法

1.2.1 豬鼻支原體的分離培養(yǎng) 將關(guān)節(jié)液用KM2培養(yǎng)基稀釋10倍，用0.45 μm無菌濾器過濾除菌，將濾液按1∶10的比例接種入KM2培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)物顏色的變化。

1.2.2 培養(yǎng)物鑒定 待培養(yǎng)物由紅色變?yōu)辄S色后，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒按說明書操作進(jìn)行培養(yǎng)物基因組的提取。采用本實驗室以P37基因為靶標(biāo)建立的套式PCR方法進(jìn)行初步鑒定[6]，然后利用英聰[7]以16S rRNA基因為靶標(biāo)建立的PCR方法進(jìn)行再次確認(rèn)，所用到的引物序列及PCR參數(shù)見表1。測序后通過BLAST與NCBI公布的豬鼻支原體相關(guān)序列信息進(jìn)行比對。

表1 引物信息

1.2.3 菌株純化及形態(tài)觀察 將新鮮的豬鼻支原體分離株菌液作104倍稀釋后涂布KM2固體平板，置于37 ℃靜置培養(yǎng)，進(jìn)行連續(xù)3次單克隆。3次 單克隆后用體視顯微鏡觀察菌落形態(tài)。將新鮮培養(yǎng)的豬鼻支原體菌液離心收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌兩次后，用2.5%戊二醛電鏡固定液固定，用于電鏡觀察其顯微形態(tài)。

1.2.4 MLST分析 參考文獻(xiàn)方法設(shè)計合成豬鼻支原體6個看家基因(adk、gmk、gltX、rpoB、dnaA、gyrB)的引物序列，進(jìn)行多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析[8]。PCR擴(kuò)增結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果上傳至https://pubmlst.org/進(jìn)行比對，獲得6個看家基因的等位基因數(shù)值和ST型。

1.2.5 分離菌株的致病性試驗 選擇9頭1月齡SF-pCD三元豬進(jìn)行豬鼻支原體分離株毒力評價試驗。試驗方法：試驗豬隨機(jī)分為感染組(6頭)和對照組(3頭)，置于隔離房間分開飼養(yǎng)。將新鮮培養(yǎng)的HEF16 分離株10倍濃縮后，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行重懸，感染組經(jīng)氣管注射、腹腔注射、肺內(nèi)注射和滴鼻四個途徑共接種109CCU(color change unit，顏色變化單位)的HEF16 分離株[9]。每個途徑接種2 mL(2.5×108CCU)，共8 mL。對照組用磷酸鹽緩沖液取代菌液，采用相同途徑及體積進(jìn)行接種。攻毒后每天觀察臨床癥狀并記錄，每周測定試驗豬體重并采血。血清樣品用本實驗室建立的Vlp-ELISA豬鼻支原體血清抗體檢測方法進(jìn)行IgG抗體的測定[10]。試驗豬于感染21 d后剖殺，觀察病變情況，參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行關(guān)節(jié)炎、心包炎、胸膜炎、腹膜炎的評分，具體評分方法見表2。采集含有支氣管的肺組織塊進(jìn)行組織固定，切片后HE染色(hematoxylin-eosin staining)，觀察。同時，采集心、肺、扁桃體和關(guān)節(jié)積液進(jìn)行豬鼻支原體的再分離，并對分離得到的豬鼻支原體進(jìn)行MLST分析。如試驗過程中出現(xiàn)死亡，立即剖檢。

表2 豬鼻支原體感染豬剖檢評分表

1.2.6 統(tǒng)計方法 利用SPSS20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗分析，P<0.05判定為具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 豬鼻支原體分離鑒定及分離株MLST分析

采集發(fā)病豬關(guān)節(jié)液樣品，用KM2培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離，平行接種3瓶，結(jié)果均在第3天時出現(xiàn)由紅變黃的顏色變化。收集培養(yǎng)物，提取核酸后分別進(jìn)行豬鼻支原體P37基因及16S rRNA基因的PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示。3份分離培養(yǎng)物的P37基因的外套和內(nèi)套PCR產(chǎn)物分別在627和346 bp處出現(xiàn)了特異性條帶(圖1 A、B)，16S rRNA基因PCR產(chǎn)物在826 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1 C)。取產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中收錄的豬鼻支原體序列進(jìn)行比對，相似性為99.3%，證明分離獲得的菌株為豬鼻支原體。將其中一份培養(yǎng)物接種固體培養(yǎng)基，5 d后生長出單菌落，菌落呈典型的煎蛋狀，直徑約0.4 mm(圖1 D)。離心收集菌體，用掃描電鏡觀察，菌體呈球形，直徑約400 nm(圖1 E)。對單克隆后的菌株再次進(jìn)行PCR驗證，并正式命名為豬鼻支原體HEF16株。

A.P37 PCR外套試驗結(jié)果；B.P37 PCR內(nèi)套試驗結(jié)果；C.16S rRNA PCR試驗結(jié)果；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.豬鼻支原體陽性對照；2.陰性對照；3～5.3份分離樣品；D.固體菌落形態(tài)；E.菌體形態(tài)(掃描電鏡)

對豬鼻支原體HEF16株的6個看家基因進(jìn)行測序，結(jié)果通過網(wǎng)站中的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定了6個 看家基因的等位基因數(shù)值，具體見表3。ST型在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中未有匹配，說明該豬鼻支原體分離株屬于一個新基因型。

表3 豬鼻支原體分離株MLST分型結(jié)果

2.2 感染后臨床癥狀觀察及體重變化

豬鼻支原體感染組6頭豬在感染后的第4天開始均出現(xiàn)后肢關(guān)節(jié)輕度腫脹，食欲出現(xiàn)下降；感染7 d 后，多個關(guān)節(jié)出現(xiàn)中度腫大，跛行，食欲差，關(guān)節(jié)觸診疼痛；感染14 d后，試驗豬行動困難，消瘦，臥地不起，2頭試驗豬死亡；攻毒后17 d，另有1頭試驗豬死亡，剩余3頭試驗豬中有2頭狀態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。對照組的3頭豬均未出現(xiàn)臨床癥狀(圖2 A、B)。

豬鼻支原體感染后每7 d對試驗豬進(jìn)行體重測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組豬生長緩慢，在攻毒后14～21 d體重下降明顯，平均日增重為負(fù)值。對照組試驗豬隨著日齡的增加，體重持續(xù)上升，平均日增重達(dá)0.3 kg·d-1。攻毒組與對照組豬日增重差異顯著(圖2 C)。

A.感染組關(guān)節(jié)腫脹；B.對照組關(guān)節(jié)；C.日增重變化測定(**.P<0.01)

2.3 感染豬的大體與顯微病變觀察

豬鼻支原體感染21 d后對試驗豬進(jìn)行剖檢觀察，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎、心包炎、胸膜炎以及腹膜炎評分。由表4可知，攻毒組6頭豬均出現(xiàn)了胸膜炎、心包炎及關(guān)節(jié)炎，其中2頭豬出現(xiàn)了腹膜炎(圖3A)。胸膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎以及腹膜炎的平均分值分別為2.3分、2.3分、3分以及0.5分。對照組3頭豬均未出現(xiàn)上述病變，評分均為0。

表4 豬鼻支原體感染豬剖檢發(fā)病情況及評分統(tǒng)計

肺肉眼變化顯示感染組肺黏連嚴(yán)重，未出現(xiàn)肺臟實變的情況(圖3 B1)。顯微觀察顯示肺間質(zhì)增寬，淤血，肺泡內(nèi)有漿液性和纖維素性滲出(圖3 C1)，支氣管黏膜層杯狀細(xì)胞增多(圖3 C2)。對照組肉眼觀察及顯微觀察均沒有明顯病變(圖3 B2、C3)。

A.豬鼻支原體感染豬剖檢病變觀察；B.豬鼻支原體感染豬肺剖檢病變(1.感染組肺；2.對照組肺)；C.豬鼻支原體感染豬肺病理組織學(xué)變化(1.感染組，肺間質(zhì)增寬，肺淤血，肺泡內(nèi)有漿液性和纖維素性滲出；2.感染組，氣管上皮細(xì)胞杯狀細(xì)胞增多；3.對照組肺，無明顯變化；200×)

2.4 感染豬血清中的抗體檢測

試驗豬于感染后每周采血一次，進(jìn)行血清IgG抗體的檢測，結(jié)果如圖4所示，感染組豬血清的豬鼻支原體IgG抗體水平在感染14 d后開始上升，21 d維持在一定的抗體水平，而對照組試驗豬IgG抗體水平無明顯變化，組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

DPI.感染后時間/d；*.P<0.05

2.5 豬鼻支原體的再分離及鑒定

試驗豬剖檢后，采集心、肺、扁桃體、關(guān)節(jié)積液進(jìn)行豬鼻支原體的再分離，具體結(jié)果如表5所示。感染組試驗豬均能從至少一處組織中再分離到豬鼻支原體，而對照組均未分離到。進(jìn)一步將分離到的菌株按“1.2.4”的方法進(jìn)行MLST分型，結(jié)果顯示，從感染豬中再分離得到的菌株MLST分型結(jié)果均與HEF16株一致。

表5 豬鼻支原體再分離情況統(tǒng)計(分離數(shù)/總數(shù))

3 討 論

豬場豬鼻支原體的感染率非常高，主要定植于上呼吸道，根據(jù)文獻(xiàn)報道斷奶仔豬鼻拭子中的檢出率可達(dá)98%[1]。支原體對營養(yǎng)要求高，且生長緩慢，一般從臨床樣品中分離培養(yǎng)支原體成功率較低。與豬肺炎支原體等其他豬支原體相比，豬鼻支原體具有更強(qiáng)的能量獲取能力及代謝能力[12]，其臨床分離率能達(dá)到7%～35%[13]。值得注意的是，大多數(shù)情況下豬鼻支原體感染陽性豬并不表現(xiàn)出臨床癥狀，一般認(rèn)為致病性的出現(xiàn)與豬鼻支原體突破呼吸道實現(xiàn)全身性感染有關(guān)。但全身性感染的出現(xiàn)究竟是取決于菌株毒力的差異還是動物狀態(tài)差異導(dǎo)致的條件性致病，目前尚不清楚。從呼吸道分離的豬鼻支原體菌株其致病力可能并不強(qiáng)。本研究選擇從發(fā)病豬的關(guān)節(jié)病變部位采集樣品進(jìn)行菌株分離，更容易分離到致病性強(qiáng)的菌株。

發(fā)病模型是開展感染機(jī)制研究或疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)，雖然豬鼻支原體人工感染模型已有一些報道，但目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法，使用的接種途徑也各不相同。已經(jīng)報道的接種途徑包括滴鼻、腹腔注射、靜脈注射、氣管內(nèi)注射[3, 14-18]。多途徑聯(lián)合接種的方式也常見于豬鼻支原體的人工感染，如氣管內(nèi)和腹腔注射聯(lián)用[3, 17]、滴鼻、腹腔注射和靜脈注射聯(lián)用[18]。本試驗也采用了多途徑聯(lián)用的方式接種分離株，包括滴鼻、腹腔注射、氣管內(nèi)注射和肺內(nèi)注射，試驗豬感染后出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降的現(xiàn)象，感染后體重增長緩慢，后期甚至出現(xiàn)下降。感染4 d后部分試驗豬的關(guān)節(jié)開始腫脹，并出現(xiàn)跛行，一周后所有感染豬均出現(xiàn)較為嚴(yán)重的臨床癥狀，這與文獻(xiàn)報道的癥狀出現(xiàn)時間相近[14, 19]，剖檢觀察到明顯的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的典型發(fā)病癥狀，說明通過滴鼻、腹腔注射、氣管內(nèi)注射、肺內(nèi)注射四種途徑聯(lián)合接種可以成功誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。然而，四種途徑聯(lián)合接種存在操作繁瑣、對試驗豬應(yīng)激較大的問題，在后續(xù)試驗中將對比各途徑感染效果，優(yōu)化攻毒途徑。Martinson等[18]對滴鼻、腹腔注射、靜脈注射三種途徑及其聯(lián)合接種的感染效果進(jìn)行了比較，數(shù)據(jù)顯示感染途徑的差異會導(dǎo)致發(fā)病程度和組織的差異性，靜脈注射更容易誘導(dǎo)多發(fā)性漿膜炎，腹腔注射則可增加關(guān)節(jié)腫脹和跛行的概率，而僅滴鼻不容易誘導(dǎo)發(fā)病，聯(lián)合接種效果優(yōu)于單一途徑接種。該研究也可為我們后續(xù)的接種途徑優(yōu)化提供一定參考。

豬鼻支原體感染對肺部的影響尚存在爭議。豬鼻支原體最早被認(rèn)為是豬地方性肺炎(enzootic pneumonia，EP)的致病菌之一。Lin等[16]報道，通過氣管注射的方法感染6周齡試驗豬，剖檢時肺部可見類似于豬肺炎支原體感染產(chǎn)生的蝦肉樣病變；危艷武等[17]將豬鼻支原體感染巴馬豬后，剖檢同樣可見肺部呈蝦肉樣病變。但肺產(chǎn)生肉變的數(shù)據(jù)并不多，數(shù)據(jù)的差異有可能來自毒株或接種途徑兩個方面。本研究選擇聯(lián)合接種途徑時，作者參考豬肺炎支原體的接種方式，有針對性地加入了下呼吸道攻毒常用的氣管內(nèi)注射和肺內(nèi)注射的方式進(jìn)行聯(lián)合接種，以充分考察肺部的病變情況。結(jié)果顯示：感染組均出現(xiàn)了胸膜炎，顯微病理檢查發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)增寬，肺泡內(nèi)有漿液性和纖維素性滲出，支氣管黏膜層杯狀細(xì)胞增多，但所有感染豬的肺均未出現(xiàn)肉變。由此作者推測肺部肉變的發(fā)生可能更多是因為毒株毒力或嗜性的差異，而非接種途徑。

豬場中豬鼻支原體感染主要引起斷奶仔豬發(fā)病，表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎及關(guān)節(jié)炎，而大豬很少發(fā)病，或僅出現(xiàn)輕微的關(guān)節(jié)炎癥狀[20]。因此仔豬更適合用于建立豬鼻支原體發(fā)病模型。根據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)，豬鼻支原體在仔豬斷奶后會出現(xiàn)感染率的上升[1]，因此本試驗選取1月齡剛斷奶仔豬用于感染試驗，更接近豬鼻支原體自然狀態(tài)下的臨床感染時間。在感染的過程中出現(xiàn)了3頭試驗豬死亡，感染狀態(tài)較為嚴(yán)重，一方面可能是由于該分離毒株的毒力較強(qiáng)，另一方面感染采用了4種途徑聯(lián)用，感染劑量也較大，也可能是造成臨床癥狀嚴(yán)重的原因之一。在試驗的后期，可以觀察到有部分感染豬臨床癥狀出現(xiàn)了一定程度的減輕。Barden 等[14]報道，通過腹腔注射途徑感染豬鼻支原體后試驗豬在第7天出現(xiàn)臨床癥狀，持續(xù)至1個月時癥狀出現(xiàn)減輕，感染時間至6個月時癥狀基本消失。豬場中大豬感染豬鼻支原體也較少發(fā)病或癥狀較輕[20]。這些數(shù)據(jù)提示機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)有可能能夠逐漸對豬鼻支原體產(chǎn)生一定的抵抗和清除[21]。在豬肺炎支原體的感染中也存在類似的情況，當(dāng)豬感染254 d后，病原會被徹底清除[22]。由于本次試驗周期較短，未能繼續(xù)觀察感染癥狀的轉(zhuǎn)歸。后續(xù)可以對感染豬進(jìn)行長時間的癥狀觀察和病原檢測，豬肺炎支原體上的凈化經(jīng)驗也可能為豬鼻支原體的凈化提供參考。

豬鼻支原體在臨床中常見于混合感染，為了防止試驗豬存在其他病原的影響，本試驗采用豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鼻支原體、豬肺炎支原體多病原的陰性試驗豬。同時，作者采集了試驗豬組織對3種可引起豬鼻支原體感染類似癥狀的病原(即副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和鏈球菌)，進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果均為陰性。菌株的再分離試驗也進(jìn)一步證實本次動物試驗中試驗豬的發(fā)病癥狀是由豬鼻支原體HEF16感染引發(fā)的。

4 結(jié) 論

從臨床感染發(fā)病豬關(guān)節(jié)積液中分離得到一株豬鼻支原體，菌株經(jīng)過純化和鑒定后，采用多途徑聯(lián)用的方式感染1月齡三元SF-pCD豬，試驗豬在感染后出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、跛行等臨床癥狀，剖檢可見典型的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎癥狀。強(qiáng)毒株的獲得和發(fā)病模型的建立可為豬鼻支原體致病機(jī)理研究及疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。