PRRSV-VR2332減毒活疫苗不影響豬瘟疫苗和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生

李 洋，高 勝，焦 點，杜興乾，徐樂樂，鄭紫方，曹鑫宇，肖書奇

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)每年給世界范圍內(nèi)的生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV是動脈炎病毒科的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15 kb，可分為歐洲型PRRSV(Ⅰ型)和美洲型PRRSV(Ⅱ型)兩種基因型[1]。PRRSV基因組變異速度快，核苷酸取代率高達(dá)4.7×10-2～9.8×10-2堿基·年-1，是已知變異速度最快的RNA病毒之一[2-3]。歐洲型PRRSV和美洲型PRRSV間僅共享約60%的核苷酸相似性、50%～80%的氨基酸相似性[4-6]。此外，PRRSV毒株眾多，易于發(fā)生重組而形成新的PRRSV毒株，具備更加復(fù)雜的基因組特性和致病性，這也為PRRS的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)[7-11]。雖然PRRS疫苗已退出國家強(qiáng)制免疫，但疫苗接種仍是我國大部分豬場防控PRRS的主要手段。目前我國PRRS疫苗種類較多，大致可分為以高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)為種毒的HP-PRRS疫苗和以經(jīng)典毒株為種毒的經(jīng)典PRRS疫苗。

由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus type 2 associated diseases，PCVAD)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道綜合征(PRDC)及豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等臨床綜合性疾病的統(tǒng)稱[12]。仔豬感染PCV2后易于繼發(fā)其他疾病，特別是PRRS等[13-14]。疫苗接種是防控PCV2的主要手段[15]。

豬瘟(classical swine fever, CSF)，又稱經(jīng)典豬瘟，是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種熱性、烈性豬傳染病，具有高發(fā)病率和高死亡率[16-17]。豬場常用的豬瘟減毒活疫苗為傳代細(xì)胞源豬瘟活疫苗和脾淋源豬瘟活疫苗[18-19]。

PRRSV、PCV2、CSFV往往給豬場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。更重要的是PRRS作為免疫抑制性疾病，常與PCV2或CSFV感染相伴而發(fā)，甚至發(fā)生PRRSV、PCV2、CSFV的共感染[20-23]。疫苗免疫是豬場防控PRRS等疾病的主要手段。雖然有部分報道分析了HP-PRRSV、PCV2、CSFV疫苗免疫后的效果[24-27]，但考慮到臨床上經(jīng)典PRRSV(VR2332)減毒活疫苗的廣泛使用，探究經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)對PCV2疫苗和CSF疫苗免疫的干擾作用、比較不同免疫方式對仔豬生長性能的影響，可以為經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)與PCV2、CSF疫苗的聯(lián)合免疫提供一定的數(shù)據(jù)支持，為規(guī)模化豬場制定科學(xué)合理的免疫程序提供一定的經(jīng)驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗主要于2019—2020年在西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院及山東某規(guī)模化豬場完成。試驗用豬為該場二元母豬所產(chǎn)的仔豬。在試驗前對仔豬進(jìn)行了PRRSV、PCV2、CSFV抗體檢測(未進(jìn)行相關(guān)病原檢測)，挑選PRRSV、PCV2、CSFV抗體為陰性的仔豬進(jìn)行試驗。

1.2 疫苗及抗體檢測試劑盒

經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)、PCV2滅活疫苗(CP08株)均購自勃林格殷格翰公司、豬瘟減毒活疫苗(傳代細(xì)胞源)購自中牧實業(yè)股份有限公司。PRRSV抗體X3檢測試劑盒、CSFV抗體檢測試劑盒均購自愛德士(IDEXX)公司；PCV2抗體檢測試劑盒購自荷蘭百測公司。

1.3 試驗方案

將100頭健康狀況良好的仔豬隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組25頭，用于評估經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響。另選100頭健康狀況良好的仔豬隨機(jī)分為E、F、G、H四組，每組25頭，用于評估經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響。各組仔豬具體免疫方案如表1所示。

表1 仔豬免疫方案

A組于21日齡時免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗，7 d后再免疫PCV2疫苗；B組于28日齡時同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和PCV2疫苗；C組于28日齡時僅免疫PCV2疫苗；D組于28日齡時僅免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。E組于28日齡時免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗，12 d后再免疫CSF疫苗；F組于28日齡時同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和CSF疫苗；G組于40日齡時僅免疫CSF疫苗；H組于28日齡時僅免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。免疫4周后，采集各組仔豬的前腔靜脈血液，分離血清，貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。待所有血清收集完畢后，同批次檢測PRRSV、PCV2、CSFV抗體水平，比較不同組的抗體產(chǎn)生水平。

于免疫前、免疫后4周，稱量各組仔豬的體重，計算各組仔豬的平均日增重：平均日增重=(終末體重-初始體重)/間隔時間(d)，以比較不同免疫方案對仔豬生長性能的影響。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)IDEXX抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)S/P≥0.4時，PRRSV抗體為陽性；當(dāng)S/P<0.4時，PRRSV抗體為陰性。根據(jù)荷蘭百測公司PCV2抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)S/P≥0.4時，PCV2抗體為陽性；當(dāng)S/P<0.4時，PCV2抗體為陰性。根據(jù)IDEXX抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)豬瘟抗體阻斷率>40%時，CSFV抗體為陽性；當(dāng)40%≥豬瘟抗體阻斷率≥30% 時，CSFV抗體為可疑；當(dāng)豬瘟抗體阻斷率<30%時，CSFV抗體為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用T檢驗法進(jìn)行不同組數(shù)據(jù)差異顯著性分析。當(dāng)P<0.05時，判定為差異顯著；當(dāng)P<0.01時，判定為差異極顯著；P>0.05時判為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響

如前所述，A組在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗接種7 d后再注射PCV2疫苗，B組同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗及PCV2疫苗，C組僅接種PCV2疫苗，D組僅接種經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。結(jié)果顯示A、B、D組均產(chǎn)生了較高水平的PRRSV抗體，且相互間無顯著性差異，共同免疫組A、B組的PRRSV抗體水平甚至略高于D組單獨免疫組(P>0.05, 圖1a)。A、B、C組經(jīng)免疫后均產(chǎn)生了較高水平的PCV2抗體；其中A組PCV2抗體水平最高，顯著高于B組；C組PCV2抗體水平略高于B組，但無顯著性差異(P>0.05, 圖1b)。以上結(jié)果表明經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫并未對PCV2誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生造成明顯干擾。

A.PRRSV免疫7 d后再免疫PCV2；B.同期分點免疫PRRSV和PCV2；C.僅免疫PCV2；D.僅免疫PRRSV；ns.P>0.05；*.P<0.05；***.P<0.01。圖3同

2.2 經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響

如前所述，E組在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗接種12 d后再注射CSF疫苗，F(xiàn)組同期分點注射經(jīng)典PRRS減毒活疫苗及CSF疫苗，G組僅接種CSF疫苗，H組僅接種經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。結(jié)果顯示，共同免疫組E、F及單獨免疫組H組均產(chǎn)生了高水平的PRRSV抗體，其中H組PRRSV抗體水平最高，顯著高于F組(P<0.05)，而略高于E組(P>0.05)，而共同免疫組E、F間并無顯著性差異(圖2a)。共同免疫組E、F和單獨免疫組G組均產(chǎn)生了高水平的CSFV抗體，且相互間無顯著性差異(圖2b)。以上結(jié)果表明，與經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗共同免疫并未干擾CSF疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，甚至還略微提高了其抗體水平(P>0.05)。

E.PRRSV免疫12 d后再免疫CSFV；F.同期分點免疫PRRSV和CSFV；G.僅免疫CSFV；H.僅免疫PRRSV；ns.P>0.05；*.P<0.05；***.P<0.01。圖3同

2.3 不同免疫方案對仔豬生長性能的影響

為進(jìn)一步探究不同免疫方式對仔豬生長性能的影響，分別在免疫前及免疫后28 d時采集A、B、C、D和E、F、G、H各組仔豬的體重數(shù)據(jù)，計算各組仔豬的平均日增重，結(jié)果如圖3所示。

圖3 A、B、C、D和E、F、G、H組仔豬平均日增重

在A～D中，A組的平均日增重最低，顯著低于B、C、D組；D組的平均日增重最高，但相較于B組并無顯著差異。

在E～H中，E組具有最高的平均日增重，顯著高于F、G、H組；F組的平均日增重最低。

3 討 論

豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、豬瘟是危害生豬產(chǎn)業(yè)的三種重要傳染病，嚴(yán)重影響豬場的經(jīng)濟(jì)效益，是豬病防控的重點。盡管有多種針對這三種重要病原體的防控方案，但疫苗免疫仍是國內(nèi)使用最多，也是效果最好的方式[28]。PRRS作為免疫抑制性疾病，會對豬體的免疫功能產(chǎn)生特異性或非特異性的抑制作用。有報道稱PRRSV減毒活疫苗免疫可能會對其他疫苗的免疫產(chǎn)生干擾[29-32]。基于PRRSV毒株多樣、經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗的廣泛使用、臨床上PRRSV、PCV2、CSFV常以混合感染的形式出現(xiàn)等原因，探究經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2、CSFV疫苗免疫的干擾情況，在有效防控的基礎(chǔ)上篩選對仔豬生長性能更有利的免疫方案是實現(xiàn)生豬綠色健康養(yǎng)殖的重要舉措，對養(yǎng)豬生產(chǎn)具有非常重要的指導(dǎo)意義。

陸佳麗等[25]評價了同時與分別接種HP-PRRSV疫苗和PCV2疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生水平，發(fā)現(xiàn)無論是同時免疫還是分別免疫，均產(chǎn)生了高水平的PRRSV抗體及PCV2抗體，且無顯著性差異。本研究的結(jié)論與其并不完全一致，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗7 d后再免疫PCV2疫苗與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和PCV2疫苗均產(chǎn)生了針對兩種病毒的高水平抗體。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，兩種組合方式免疫產(chǎn)生的PRRSV抗體無顯著性差異，而間隔免疫組的PCV2抗體高于同期分點免疫組。與單獨免疫PCV2疫苗組相比，兩種組合方式免疫均未影響PCV2的抗體水平。意外的是單獨免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗組也檢出了PCV2抗體陽性。基于仔豬在免疫前抗體檢測均為陰性，作者推測該組仔豬可能感染了PCV2野毒。鑒于未在試驗開始前對供試仔豬進(jìn)行相關(guān)抗原檢測，推測可能是仔豬在試驗開始前處于低水平的帶毒狀態(tài)，但考慮到所有供試仔豬均來自該場本場，且供試仔豬隨機(jī)進(jìn)行分組，試驗均在該場進(jìn)行，降低了不同組間的誤差，雖然仍對試驗結(jié)果造成了影響，但作者認(rèn)為其并未對研究結(jié)論造成本質(zhì)上的影響。當(dāng)然，這充分說明了在試驗前對供試仔豬進(jìn)行相關(guān)抗原的核酸檢測的必要性。

李彩虹等[33]的研究中用HP-PRRSV JXA1-R疫苗與CSF疫苗對種公豬、后備母豬、育肥豬進(jìn)行了共同免疫，結(jié)果顯示HP-PRRSV JXA1-R疫苗的免疫可能會降低豬群中的CSFV抗體，而提高PRRSV抗體水平。徐孝會等[34]發(fā)現(xiàn)同時免疫兩種疫苗時，CSF疫苗或口蹄疫疫苗會促進(jìn)HP-PRRSV JXA1-R疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。朱華賢等[26]在試驗組仔豬49日齡時接種HP-PRRSV 減毒活疫苗，56日齡時又免疫了CSF疫苗，對照組僅在56日齡時免疫了CSF疫苗。結(jié)果顯示試驗組CSFV抗體水平明顯低于對照組，表明HP-PRRSV JXA1-R疫苗免疫會對CSF疫苗的免疫造成干擾，CSF疫苗免疫應(yīng)在PRRS疫苗免疫后7 d以上進(jìn)行。本研究中，與單獨免疫CSF疫苗組相比，無論免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)12 d后再免疫CSF疫苗，還是使用經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與CSF疫苗同期分點免疫，均未影響豬群的CSFV抗體水平，甚至還略微提高了CSFV的抗體水平。作者推測PRRS疫苗對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響可能與PRRSV疫苗原型毒株的類型有關(guān)，這還需要更進(jìn)一步的試驗來驗證。但與單獨免疫CSF疫苗組相比，與CSF疫苗同期分點免疫顯著降低了經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗誘導(dǎo)的PRRSV抗體水平，而CSF疫苗的免疫在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫12 d后再進(jìn)行時，則可以產(chǎn)生與經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗單獨免疫相似水平的PRRSV抗體，且抗體處于較高水平(S/P值>1.35)。

高杏[15]比較了PCV2疫苗免疫與不免疫對豬生長的影響，發(fā)現(xiàn)免疫PCV2疫苗有助于提升豬的日增重。本研究未與正常組進(jìn)行平均日增重的比較，但比較了不同免疫方案組仔豬的平均日增重水平。無論與單獨免疫PCV2疫苗組(單獨免疫組)相比，還是與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與PCV2疫苗組(同期分點免疫組)相比，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗7 d后再免疫PCV2疫苗組(間隔免疫組)顯著均降低了仔豬的平均日增重。而同期分點免疫組仔豬的平均日增重與單獨免疫組相比差異不顯著，但顯著高于間隔時間免疫組。相反，無論與單獨免疫CSF疫苗組相比，還是與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與CSF疫苗組相比，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗12 d后再免疫CSF疫苗均顯著提高了仔豬的平均日增重。

疫苗接種在誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的同時，往往會不同程度地激活細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫是機(jī)體清除病原微生物的重要手段。本研究僅在體液免疫水平探究了PRRSV減毒活疫苗(VR2332)免疫對PCV2、CSF疫苗免疫誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響，并未進(jìn)行細(xì)胞免疫相關(guān)的評估。且目前關(guān)于這3類疫苗免疫，特別是共同免疫下對機(jī)體細(xì)胞免疫影響的報道較少。Martelli等[35]探究了單獨接種PCV2疫苗或與PRRSV-1疫苗共同接種對豬體液免疫和細(xì)胞免疫的影響，發(fā)現(xiàn)共同免疫PRRSV-1和 PCV2疫苗不會干擾特定的體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。孫雪等[36]比較了PRRSV減毒活疫苗(VR2332)與滅活苗同時免疫或單獨免疫的效果，發(fā)現(xiàn)在免疫42 d后，同時免疫組引起豬淋巴細(xì)胞增殖速度高于單獨免疫組；而免疫后56 d時, 雖都呈下降趨勢，但單獨免疫減毒活疫苗組具有更高的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。這些結(jié)果似乎表明共同免疫在產(chǎn)生高水平相關(guān)抗體的同時，對機(jī)體細(xì)胞免疫的影響可能是一個較為復(fù)雜的情況。鑒于細(xì)胞免疫在清除病原體中的關(guān)鍵作用，聯(lián)合免疫對豬細(xì)胞免疫的影響值得更多的研究。

綜上，在制定聯(lián)合免疫方案時，除了考慮抗體水平外，還應(yīng)參考免疫方案對仔豬生長性能的影響，綜合選擇科學(xué)、高效、性價比高的聯(lián)合免疫方案。

4 結(jié) 論

1)經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)不影響PCV2滅活苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，且二者同期分點免疫能使仔豬具備更高的平均日增重。2)經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)不影響CSF疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，但間隔12 d免疫時效果更好，且能使仔豬具備更高的平均日增重。3)28日齡時同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)和PCV2疫苗，12 d后再免疫CSF疫苗可能是比較理想的聯(lián)合免疫方案，但仍需要進(jìn)一步驗證。