山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒全基因組序列分析及其gag基因促腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究

潘啟東，曾顯成，楊彬偲，劉慶華，徐泉明，陳吉龍

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002)

羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(enzootic nasal adenocarcinoma, ENA)是由綿羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 1, ENTV-1)和山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)導(dǎo)致鼻甲篩骨上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而引起的慢性、進(jìn)行性、傳染性的腫瘤[1]。該病呈世界性分布，迄今為止，除了澳大利亞和新西蘭所在的大洋洲之外，其他大洲均有ENTV-2的報道[2]。1995年，林曦等[3]報道了14例發(fā)生在內(nèi)蒙古山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病例，這也是我國首次報道，之后在湖南[4]、四川[5]、陜西[6]等地相繼報道此病，但并未引起相關(guān)人員的注意和重視，由于引種和運輸檢疫把關(guān)不嚴(yán)，從2011年開始，福建有多個市相繼暴發(fā)該疾病[7]，且有流行的趨勢，目前沒有有效的藥物和疫苗可以使用，對我國的養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本病呈地方性流行，主要臨床癥狀為病羊食欲減退，日漸消瘦，精神萎靡，鼻腔產(chǎn)生大量鼻涕滲出物，張口呼吸，剖檢可見鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)出現(xiàn)腫瘤增生物[8]。腫瘤除了損害鼻甲骨之外，還會入侵鼻竇和額竇等部位，使局部骨骼變軟或萎縮，造成面部不對稱，后期增生物擴(kuò)大占據(jù)鼻腔空間引起鼻腔堵塞，導(dǎo)致病羊呼吸困難或者窒息死亡[9-10]。從出現(xiàn)臨床癥狀到病羊死亡的時間從3周到1年不等[11]，本病發(fā)病率不高，但是死亡率可達(dá)到100%，其主要原因是后期腫瘤增生物堵塞鼻腔，病羊呼吸衰竭和繼發(fā)性感染[2，12]。截至目前，并未見有成功體外分離病毒的報道[13]，導(dǎo)致對該病毒致病性研究偏少。本研究從福建福州市郊某山羊場采集疑似山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤組織樣品，通過RT-PCR確診該羊場部分山羊患有該病，根據(jù)NCBI上傳的ENTV-2序列設(shè)計多對引物進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)測序后利用生物信息學(xué)軟件拼接得到病毒全基因組，其GenBank登錄號為MT598195。進(jìn)一步對全基因組繪制進(jìn)化樹進(jìn)行分析，同時構(gòu)建了gag蛋白的原核表達(dá)和真核表達(dá)載體，制備多克隆抗體和獲得了過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，對gag蛋白的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為該病的防控及深入研究其致病機(jī)制、研發(fā)疫苗和藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

293T細(xì)胞、K562細(xì)胞和OFTu細(xì)胞由本實驗室保存；山羊鼻內(nèi)腫瘤組織采樣于福州市郊某羊場；BALB/c Nude裸鼠：4～5周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-21a(+)和過表達(dá)載體pMIG-CMV-80 ℃凍存于本實驗室；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、克隆載體pLB、大腸桿菌DH5α、表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NheⅠ、XhoⅠ、BgIⅡ、T4連接酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Oligod T(18)/Random Primer、25 mmol·L-1MgCl2、RTase、RiboLock Rnase Inhibitor、10 mmol·L-1dNTP Mixture均購自TaKaRa公司，5×Reaction buffer購自Promega公司，核酸 Marker、2×TaqPCR Master Mix購自Biomed公司，蛋白Marker購自賽默飛公司，DEPC水購自AMRESCO公司，NC膜購自Millipore公司，ECL化學(xué)發(fā)光液購自普利萊生物有限公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自北京化工，DMEM、RPMI1640購自Invitrogen公司，胎牛血清FBS、ploybrene購自Gibco公司，真核轉(zhuǎn)染試劑VigoFect購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司，Anti-phospho-STAT5、Anti-phospho-JAK2、Anti-phospho-Akt、Anti-STAT5、Anti-JAK2、Anti-Akt購自Cell Signaling Technology；Anti-actin購自博奧瑞金有限公司，Anti-Flag，購自Sigma公司。

1.3 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病的鑒定

挑選出現(xiàn)流鼻涕、打噴嚏等典型臨床癥狀的山羊進(jìn)行剖檢，采集鼻腔腫瘤組織，稱量30 mg腫瘤組織,利用Trizon法提取病毒總RNA，-80 ℃保存或立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：總RNA 5 μg，OligodT(18)/Random Primer 1 μL，加DEPC水至10 μL，70 ℃水浴5 min；冰浴5 min，再向上述反應(yīng)體系中加入以下試劑：5×Reaction buffer 4 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，10 mmol·L-1dNTP Mixture 1 μL，RTase 1 μL，RiboLock Rnase Inhibitor 0.4 μL，DEPC水1.6 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min；42 ℃ 1 h；70 ℃ 10 min；-20 ℃保存。根據(jù)NCBI收錄的ENTV-2序列設(shè)計1對特異性引物進(jìn)行RT-PCR確診，上游引物ENTV-2-F：5′-CAGTCCATTCAAGCTGCTCATACTG-3′，下游引物ENTV-2-R：5′-CAATCACCGGATCCTTACTTAATCG-3′，擴(kuò)增目的片段大小為828 bp。采用15 μL RT-PCR體系：2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，水5.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析來鑒定ENTV-2。

1.4 ENTV-2-FJ全基因組擴(kuò)增及拼接

接下來分別設(shè)計6對引物進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物信息

以“1.3”反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系一致，P1～P6退火溫度分別為56、60、55、56、57、56 ℃，延伸時間分別為30、90、45、90、30、90 s，其余反應(yīng)條件一樣。1%瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶后根據(jù)膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收，將其克隆至pLB克隆載體后送北京擎科生物科技有限公司測序，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAStar對序列進(jìn)行拼接、基因注釋，并將得到的ENTV-2-FJ全基因組序列上傳至NCBI。

1.5 ENTV-2-FJ全基因組進(jìn)化分析

下載GenBank先前報道的19株ENTV-2毒株全基因組，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件MEGA-X將它們和本研究毒株采用Kimura 2參數(shù)，Neighbour-joining鄰接法，1 000次的步長檢驗進(jìn)行運算并繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建

由北京擎科生物有限公司合成gag基因引物，上游引物gag-F：5′-CTAGCTAGCATGGGACAAATGCATAGTCGCCAGT-3′，下劃線為NheⅠ酶切位點，下游引gag-R：5′-CCGGAATTCGTACTGTATAGGAGGCGGCAC-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點。利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物片段和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，純化、回收后再用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗，挑取單克隆菌株搖菌，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定，并將重組質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 多克隆抗體的制備及檢測

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，對誘導(dǎo)劑IPTG濃度(0.25、0.5、0.75、1 mmol·L-1)和誘導(dǎo)時間(3～8 h)進(jìn)行優(yōu)化，收集全菌，NanoDrop 2000測其OD600 nm值，再根據(jù)OD600 nm值按比例添加1×loading buffer制備全菌蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，選擇最適合條件(37 ℃、0.75 mmol·L-1IPTG、誘導(dǎo)8 h)進(jìn)行融合蛋白可溶性檢測，然后將重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白利用SDS-PAGE電泳后切相應(yīng)大小條帶的膠，送往北京百爾康納特實驗動物繁育生物技術(shù)開發(fā)有限公司制備兔抗gag蛋白多克隆抗體。稱量300 mg山羊腫瘤組織裂解制備成蛋白樣品，SDS-PAGE電泳后冰浴轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂奶粉封閉2 h，制備好的血清作為一抗(1∶40 000)稀釋孵育2 h，TBST洗滌3次，HRP-IgG(羊抗兔)作為二抗(1∶2 000)，孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光液(AB液)反應(yīng)3 min后進(jìn)行曝光，記錄并分析條帶。

1.8 真核表達(dá)載體構(gòu)建

由北京擎科生物有限公司合成gag基因引物，上游引物gag-F：5′-GGAAGATCTATGGGACAAATGCATAGTCGCCAGT-3′，下劃線為BgIⅡ酶切位點，下游引物gag-R：5′-CCGCTCGAGTCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGTACTGTAT-AGGAGGCGGCAC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點，斜體為Flag序列。如“1.5”原核表達(dá)載體方法構(gòu)建pMIG-gag-Flag重組質(zhì)粒載體。

1.9 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建

通過制備逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染靶細(xì)胞的方法，將特定的序列整合到細(xì)胞的基因組中，得到可穩(wěn)定遺傳的過表達(dá)細(xì)胞系。培養(yǎng)293T細(xì)胞至密度為80%～90%，棄掉完全培養(yǎng)基換成無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基，取1.5 mL EP管，分兩組，各加500 μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基，一組加待轉(zhuǎn)染包裝質(zhì)粒(pMIG-VSVG、pMIG-pcleco)、空載質(zhì)粒(Linker)、靶基因質(zhì)粒(pMIG-gag)，一組加10 μL的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min，將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻室溫放置20 min，逐滴加到293T細(xì)胞中，4～6 h后換成完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集上清液，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后，加到離心后收集的K562細(xì)胞，避光1∶1 000 添加ploybrene，混勻后分裝至6孔板中經(jīng)保鮮膜包裹封閉在32 ℃，2 200 r·min-1離心120 min。懸浮感染結(jié)束后補(bǔ)加1 mL完全培養(yǎng)基，24 h后可傳代。

1.10 裸鼠致瘤試驗

購買4～5周齡的雌性BALB/c裸鼠于SPF動物房飼養(yǎng)，收集K562細(xì)胞(細(xì)胞狀態(tài)良好，提前換液)，用1×PBS洗滌兩次，血球計數(shù)板計數(shù)，每管分裝1×107～2×107個細(xì)胞，用100 μL的1×PBS重懸，總體積約為200 μL。將細(xì)胞置于冰上，減少代謝，接種時再次將細(xì)胞混勻，用1 mL注射器抽取細(xì)胞，趕盡氣泡后注射小鼠。將小鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，定期觀察小鼠致瘤效果，1周后可觀察到腫瘤的出現(xiàn)，2～3周后，腫瘤長至一定大小后取出腫瘤塊拍照記錄。

1.11 免疫印跡試驗

收集細(xì)胞或稱量腫瘤組織并制備成蛋白樣品，制備5%濃縮膠和10%分離膠，先使用恒壓(80 V)將蛋白樣品壓縮至凝膠分界線，再使用恒壓(120 V)在分離膠中進(jìn)行電泳，120 min，恒流(250 mA)，冰浴轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗分別按以下比例稀釋：p-JAK2(1∶4 000)、p-STAT5(1∶5 000)、p-Akt(1∶5 000)、JAK2(1∶2 000)、STAT5(1∶2 000)、Akt(1∶4 000)、Flag(1∶2 000)、actin(1∶40 000)、gag(1∶40 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，HRP-IgG(羊抗兔)、HRP-IgG(羊抗鼠)作為二抗(1∶4 000)，孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光液(AB液)反應(yīng)3 min后進(jìn)行曝光，記錄并分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病的鑒定

2018年7月，福州市郊某山羊場發(fā)生疑似地方性鼻內(nèi)腫瘤疫病，部分病羊出現(xiàn)食欲減退，逐漸消瘦、流鼻涕、打噴嚏等癥狀。剖檢病羊發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)出現(xiàn)增生物，顏色呈淡粉紅色，質(zhì)地松軟，類似菜花樣(圖1A)。針對ENTV-2設(shè)計一對特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為828 bp，經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增后得到預(yù)期目的條帶(圖1B)。將目的條帶切膠回收并連接到pLB克隆載體后送北京擎科生物科技有限公司測序，得到的序列在NCBI進(jìn)行blast，與NCBI收錄的ENTV-2序列相似性最高達(dá)99%，在核酸水平上證實該羊場患鼻內(nèi)腫瘤疾病是由ENTV-2引起的。同時還對病羊的心、肝、腎、肺、淋巴、腫瘤等組織進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，只有在腫瘤組織中能檢測出病毒(圖1C)。設(shè)計6對特異性引物(圖1D)進(jìn)行RT-PCR，分別擴(kuò)增出相應(yīng)片段(圖1E)，大小均與預(yù)期一致，切膠回收克隆至pLB載體上，測序后利用生物學(xué)軟件DNAStar將各個片段去除載體信息后進(jìn)行拼接，獲得ENTV-2全基因組序列，長度為7 443 bp，命名為ENTV-2-FJ，上傳至NCBI獲得GenBank登錄號為MT598195。以上結(jié)果顯示，該羊場的鼻內(nèi)腫瘤疾病是由ENTV-2引起的，作者成功克隆擴(kuò)增出病毒全基因組。

A.地方性山羊鼻內(nèi)腫瘤病主要臨床癥狀；B.核酸水平證實該病由ENTV-2引起(1.腫瘤組織；2.陰性對照; M.核酸marker)；C.RT-PCR檢測(1.山羊胚胎鼻甲細(xì)胞和病羊；2.心；3.肝；4.腎；5.肺；6.淋巴；7.腫瘤組織; M.核酸marker)；D.設(shè)計6對特異性引物示意圖；E.全基因組克隆擴(kuò)增(P1～P6.擴(kuò)增片段; M.核酸marker)

2.2 ENTV-2全基因序列分析

本研究毒株核酸序列與GenBank先前收錄的19株ENTV-2毒株全基因組相似，具有5′-U5-gag-pro-pol-env-U3-3′典型結(jié)構(gòu)，包含4個開放閱讀框和側(cè)翼非編碼區(qū)以及末端重復(fù)序列，且核酸相似性在88.93%～98.71%。gag基因主要編碼核心蛋白，位于基因組的215～2 053 bp，全長為1 839 bp；pro基因位于gag和pol基因之間，編碼蛋白酶，全長870 bp，在基因組1 945～2 814區(qū)間；pol基因位于3 060～5 405 bp，全長2 346 bp，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶兩種蛋白；囊膜蛋白由env基因編碼，前體蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生兩條肽鏈，較大的那條氨基端通過二硫鍵和氫鍵與較小的穿膜蛋白(TM)相連，暴露于囊膜之外，稱為表面蛋白(SU)，較小的那條羧基端鏈TM貫穿病毒的囊膜。env基因全長1 869 bp，位于5 281～7 149 bp。

為了進(jìn)一步了解本研究的ENTV-2-FJ株與GenBank中公布的19個ENTV-2基因組序列之間的遺傳關(guān)系，用MEGA-X以Kimura 2-parameter 模型，建立NJ樹，并對拓?fù)鋱D進(jìn)行了自展檢驗(bootstrap)，重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000 次進(jìn)行運算并繪制遺傳進(jìn)化樹(圖2)。通過比較可知，本試驗獲得的毒株與福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院江錦秀等[14]報道的毒株(MK559457.1)親源性較近。根據(jù)以上結(jié)果，推測該病毒可能是通過商品貿(mào)易或者人員攜帶傳入。通過解析ENTV-2全基因序列信息，對本病毒在福建省內(nèi)發(fā)生的遺傳變異和之后的疫苗藥物等研發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

該進(jìn)化樹使用MEGA-X中的鄰接法構(gòu)建，建樹的檢驗方法為1 000次的步長檢驗。ENTV-2-FJ毒株帶有三角形

2.3 gag蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NheⅠ對重組質(zhì)粒pET-21a-gag在37 ℃條件下進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果正確，大小為1 839 bp左右(圖3A)。gag基因編碼613個氨基酸，軟件預(yù)測大小在70 ku左右，將酶切正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達(dá)載體中，在37 ℃，0.5 mmol·L-1的IPTG條件下誘導(dǎo)6 h，收集全菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色，洗脫后結(jié)果在預(yù)期大小有目的條帶(圖3B)，說明融合蛋白His-gag誘導(dǎo)表達(dá)成功。保持誘導(dǎo)時間(6 h)和溫度(37 ℃)不變，以0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1不同濃度進(jìn)行誘導(dǎo)以及保持誘導(dǎo)濃度(0.75 mmol·L-1)和溫度(37 ℃)不變，誘導(dǎo)3～8 h。結(jié)果表明，融合蛋白His-gag隨著IPTG濃度增加而逐漸增多，在濃度為0.75 mmol·L-1時表達(dá)量最高(圖3C)，而隨著誘導(dǎo)時間推移蛋白表達(dá)量并沒有明顯增高(圖3D)。在37 ℃濃度為0.75 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)8 h后，收集His-gag融合蛋白菌液，離心沉淀菌體，低溫超聲破碎，分別收集上清和沉淀并制備成蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測其可溶性，結(jié)果如圖3E所示，His-gag融合蛋白主要存在沉淀中，在上清未見明顯條帶。His-gag融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，切膠作為抗原制備多抗血清，將制備好的血清作為一抗與地方性山羊鼻內(nèi)腫瘤組織陽性樣品進(jìn)行反應(yīng)，出現(xiàn)70 ku 左右的條帶，與預(yù)期的大小相符(圖3F)。以上結(jié)果表明，作者成功制備了兔抗gag蛋白多克隆抗體。

A.pET-21a-gag重組質(zhì)粒酶切鑒定(M.核酸marker; 1.重組質(zhì)粒；2.酶切結(jié)果)；B.融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M.蛋白質(zhì)marker; 1.空載未誘導(dǎo)；2.空載誘導(dǎo)；3.融合蛋白未誘導(dǎo)；4.融合蛋白誘導(dǎo))；C.不同溶度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M.蛋白質(zhì)marker; 1.融合蛋白未誘導(dǎo)；2～5.分別為終濃度0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo))；D.不同時間點誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M.蛋白質(zhì)marker; 1.融合蛋白未誘導(dǎo)；2～8.分別為誘導(dǎo)3～8 h)；E.融 合蛋白可溶性檢測(M.蛋白質(zhì)marker; 1.空載未誘導(dǎo)；2.空載誘導(dǎo)；3.融合蛋白未誘導(dǎo)；4.融合蛋白誘導(dǎo)；5.融合蛋白誘導(dǎo)超聲上清；6.融合 蛋白誘導(dǎo)超聲沉淀)；F.抗體檢測(1.山羊正常組織；2.腫瘤組織)

2.4 gag基因通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT5通路促進(jìn)腫瘤生長

為探究gag基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用，首先將帶有Flag標(biāo)簽的gag基因構(gòu)建到pMIG-CMV載體上，利用雙酶切對重組質(zhì)粒pMIG-gag-Flag進(jìn)行鑒定，酶切結(jié)果正確(圖4A)。接著使用慢病毒感染方法使gag基因在K562細(xì)胞中高表達(dá)，證實轉(zhuǎn)染效率的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)超過80%(圖4B)，表明轉(zhuǎn)染效率高，接著利用Flag和gag抗體作為一抗檢測gag蛋白的表達(dá)情況，如圖4C所示，與空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，gag蛋白能在K562細(xì)胞中大量表達(dá)。然后利用上述構(gòu)建好的細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠皮下致瘤，檢測過表達(dá)gag基因是否影響K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤情況。將皮下的腫瘤剖解出來，發(fā)現(xiàn)與對照組相比過表達(dá)gag基因的K562細(xì)胞系所誘發(fā)的裸鼠皮下腫瘤體積明顯更大(圖4D)。隨后，將這些腫瘤裂解后以Flag和制備的兔抗gag抗體作為一抗進(jìn)行Western blot檢測，再次檢測gag蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明，腫瘤裂解樣品gag蛋白仍顯著表達(dá)(圖4E)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5，STAT5)在眾多癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-16]，并由細(xì)胞因子受體下游的JAK激酶激活，STAT5蛋白的異常激活，極大地促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的存活和疾病的惡性發(fā)展[17-18]。因此，本研究在過表達(dá)gag基因的細(xì)胞系中檢測JAK2和STAT5的磷酸化情況。研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)gag基因的細(xì)胞系中JAK2和STAT5磷酸化水平明顯升高(圖4F)。以上結(jié)果顯示，gag基因能夠通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT5通路促進(jìn)腫瘤生長。

A.重組質(zhì)粒pMIG-gag-Flag酶切鑒定(M.核酸marker；1.重組質(zhì)粒；2.酶切結(jié)果)；B.K562細(xì)胞熒光圖；C.過表達(dá)細(xì)胞系鑒定結(jié)果；D.裸鼠致瘤情況；E.腫瘤組織gag蛋白檢測結(jié)果; F.Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

ENA病程長，前期不易發(fā)現(xiàn)，后期病死率可達(dá)100%，對養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界上除大洋洲外，其他大洲均有ENA發(fā)生的報道，在我國也有蔓延的趨勢，目前沒有特效藥和有效的疫苗進(jìn)行防控，只能通過嚴(yán)格的檢疫和隔離撲殺來降低發(fā)病率。國內(nèi)對ENTV-2的研究較少，主要礙于未能找到合適的體外培養(yǎng)細(xì)胞系和研究體系。本研究獲得了ENTV-2-FJ全基因組序列并對其進(jìn)化進(jìn)行了分析，豐富了ENTV-2全基因組信息，對病毒在福建省內(nèi)發(fā)生的遺傳變異和之后的疫苗藥物等研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。有報道稱，gag蛋白是做ELISA檢測的首選蛋白[19]，作者成功制備了兔抗gag蛋白的多克隆抗體，可以為后續(xù)開發(fā)檢測試劑奠定基礎(chǔ)。JAK-STAT信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，包括參與腫瘤細(xì)胞的識別和免疫逃逸等過程[20-21]，在某些癌癥中，JAK-STAT信號傳導(dǎo)功能的異常，有可能啟動并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[22]。STAT5的異常表達(dá)主要與腫瘤的發(fā)生和擴(kuò)散有關(guān)[23]，特別是在一些實體瘤的發(fā)生過程，由于在腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的大量增加而造成JAK2-STAT5的過度激活[24-25]。目前，世界上仍未能成功分離ENTV-2，使得對病毒致病性研究甚少，其中又主要聚焦研究env基因，缺乏對gag基因的深入探究。本試驗研究發(fā)現(xiàn)gag基因能夠通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT5信號通路促進(jìn)腫瘤的生長，為今后系統(tǒng)研究ENTV-2感染如何激活腫瘤信號通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變過程，揭示信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的多種關(guān)鍵節(jié)點分子的功能與作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，并為細(xì)胞癌變的干預(yù)提供潛在有價值的靶標(biāo)。所以，本研究對ENTV-2的防控具有參考價值。

4 結(jié) 論

獲得了ENTV-2-FJ全基因組序列并對其進(jìn)行分析，制備并驗證了gag蛋白的多克隆抗體，探討了gag蛋白的作用機(jī)制，gag基因能夠通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT5信號通路促進(jìn)腫瘤的生長。