甘肅、青海和寧夏地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒Erns基因的變異分析

高閃電，王錦明，田占成，獨軍政，王建東，?；菔|，關(guān)貴全，李有全，殷 宏, 2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009；3.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，銀川 750002)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)，主要感染牛，導致腹瀉、呼吸道癥狀、流產(chǎn)或黏膜糜爛[1]。病毒基因組RNA包含5′UTR、開放閱讀框以及3′UTR保守的結(jié)構(gòu)，編碼C、Erns、E1、E2四種結(jié)構(gòu)蛋白和7～8種非結(jié)構(gòu)蛋白。Erns、E1、E2鑲嵌在病毒脂質(zhì)雙層囊膜上，與囊膜內(nèi)由C蛋白和病毒RNA構(gòu)成的衣殼共同組成完整的病毒粒子[2]。E2是BVDV最主要的抗原蛋白，在誘導宿主體液免疫和細胞免疫中發(fā)揮重要的作用，是決定疫苗免疫保護的關(guān)鍵蛋白。Erns為高度糖基化蛋白，具RNA酶活性，除參與病毒粒子組成，還可從感染細胞分泌至胞外。Erns作為瘟病毒特有蛋白，也可誘導中和抗體的產(chǎn)生，可作為病毒持續(xù)感染的標志物，廣泛用于BVDV持續(xù)與急性感染的鑒別診斷[3]，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)檢測Erns的免疫組織化學法或商品化試劑盒存在漏檢現(xiàn)象，表明Erns蛋白在毒株之間存在抗原差異[4]。

BVDV分離株間抗原性、基因組核苷酸存在較大差異，目前主要依據(jù)5′UTR、N基因核苷酸差異將其分為BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因型以及BVDV-1a～BVDV-1w、BVDV-2a～2d等基因亞型[5-6]。根據(jù)分離株的細胞培養(yǎng)特性，可將BVDV分為非致細胞病變(ncp)和致細胞病變(cp)兩種生物型，田間分離株多為ncp型且與牛急性感染、流產(chǎn)和持續(xù)性感染(PI)有關(guān)，cp型BVDV感染PI?？蓪е吗つげ?。在我國報道的BVDV分離株表現(xiàn)為較高的亞型多樣性，可分為13種基因亞型(BVDV-1：11種；BVDV-2：2種)及BVDV-3基因型[6-12]。目前我國BVDV流行株的抗原基因E2的多態(tài)性已初步闡明[13]，但關(guān)于毒株Erns基因的信息較少。為了系統(tǒng)了解我國BVDV流行株Erns基因的分子特征及遺傳演化規(guī)律，本研究測定分析了2013—2019年間我國甘肅、青海、寧夏省區(qū)主要BVDV流行株的Erns基因序列，以期進一步豐富我國BVDV的抗原變異基礎(chǔ)研究，為疫苗的分子設(shè)計提供必要的技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

2013—2019年，甘肅、青海、寧夏規(guī)?；鏊蜋z的疑似牛病毒性腹瀉發(fā)病牛的EDTA抗凝血150份(表1)，凍存于-80 ℃。致細胞病變生物型對照毒株BVDV-AV69 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，無BVDV污染的牛腎細胞(MDBK)、BVDV-1p基因亞型分離株Camel-5，由本實驗室保存，BVDV抗原檢測試劑盒為愛德士公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標記的豬抗BVDV多克隆抗體為美國VMRD公司產(chǎn)品，RNAsimple總RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，一步法RT-PCR試劑盒HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DH5α 化學感受態(tài)細胞、質(zhì)粒提取試劑盒為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品，Trans2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pMD18-T 克隆載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

表1 樣品信息及BVDV RT-PCR檢測結(jié)果

1.2 引物

根據(jù)GenBank中收錄的BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因組序列，設(shè)計引物ErnsF：5′-AGCATTGTTRGCRTGGGC-3′，E1R：5′-AACCAYAGTATRCCTTGYA-3′，用于擴增BVDV基因組Erns-E1區(qū)，預期目的片段為1 296 bp。同時合成引物5′UTRF(5′-CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA-3′)和5′UTRR(5′-CAACTCCATGTGCCATGTACAGCA-3′)，用于擴增BVDV基因組5′UTR區(qū)。

1.3 RNA提取及RT-PCR

參照RNAsimple 總RNA提取試劑盒說明書，分別從250 μL EDTA抗凝血和Camel-5株培養(yǎng)物提取總RNA。利用一步法RT-PCR試劑盒HiScript II One Step RT-PCR Kit，以50 μL反應體系擴增Erns-E1 DNA片段。電泳切膠回收后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，PCR鑒定并將陽性克隆搖菌，委托生工生物工程(上海)公司測序。同時選取測序正確的樣品RNA擴增5′UTR區(qū)并克隆測序。

1.4 病毒分離

根據(jù)愛德士BVDV抗原檢測試劑盒操作說明檢測抗凝血中BVDV抗原，參照文獻[14]，利用陽性抗凝血樣品制備牛淋巴細胞裂解液并接種至MDBK單層細胞，盲傳3代后，接種MDBK單層細胞，利用FITC標記的豬抗BVDV多克隆抗體進行免疫熒光檢測細胞培養(yǎng)物中的BVDV抗原。

1.5 序列分析

利用VecScreen、DNASTAR、BioEdit等軟件對獲得的序列進行分析。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的SD-15毒株(登錄號為M96751)的Erns基因和5′UTR區(qū)，以Clustal W方法比對獲得Erns基因和5′UTR區(qū)核苷酸信息。利用DnaSP 5.10、BioEdit 分析Erns基因核苷酸以及推導氨基酸序列的變異位點。利用BLAST在線分析序列與GenBank中收錄毒株Erns基因的同源性，并利用Mega7.0軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 基因克隆及序列測定

從150份抗凝血提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增病毒Erns-E1區(qū)(1 296 bp)，共獲得56份DNA，測序均為BVDV特異序列，總體陽性率為37.33%，其中甘肅省、青海省、寧夏回族自治區(qū)BVDV陽性率分別為37.68%、35.71%、40.00%。比對并去掉相同序列后獲得33條Erns序列，長度均為681 bp，無核苷酸插入或缺失，編號并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KY675201～KY675227、MW560180～MW560185。

2.2 病毒分離與相似性分析

GenBank中未收錄BVDV-1p亞型毒株的Erns序列，因此測定實驗室保存的Camel-5株Erns序列(登錄號為KY675228)并作為參考序列。分析發(fā)現(xiàn)這些流行株屬于9個基因亞型：BVDV-1a(2株)、BVDV-1b(5株)、BVDV-1c(1株)、BVDV-1d(3株)、BVDV-1m(11株)、BVDV-1o(1株)、BVDV-1p(4株)、BVDV-1q(4株)、BVDV-2a(1株)。利用BVDV抗原陽性抗凝血GS5、QH4、QH9、NX1、NX3、NX201902進行病毒分離，在MDBK細胞未見細胞病變，經(jīng)免疫熒光鑒定分離株均為非致細胞病變型，利用細胞培養(yǎng)物提取RNA并擴增Erns基因測序，與利用抗凝血樣品擴增測序結(jié)果一致。在這些亞型株中，BVDV-2a亞型NX3株Erns基因序列與美國分離株9231(登錄號：MH806437)相似性最高(97.75%)，高于國內(nèi)新疆分離株XJ04(FJ527854，94.73%)、山東分離株SD-1(MK599227，92.13%)以及吉林分離株JZ05-1(GQ888686，91.59%)。GS11、QH2、QH11、QH18株Erns序列相似性為89.4%～98.9%，與Camel-5株Erns基因核苷酸序相似性為90.0%～95.1%，同屬BVDV-1p基因亞型。NX2019/02株與GenBank中收錄的BVDV-1m亞型 SD-15 株Erns基因(登錄號：KR866116)核苷酸一致性為84.73%，其5′UTR與1v毒株EN-19(登錄號：MN417826)的核苷酸一致性為96.39%，因此暫定NX2019/02株為BVDV-1v基因亞型。各基因亞型株間Erns序列相似性矩陣結(jié)果表明，BVDV Erns核苷酸在1a～1d經(jīng)典亞型相似性較高(79.8%～85.9%)、在1m～1v較新亞型也表現(xiàn)為較高相似性(81.0%～87.3%)，以BVDV-1m和BVDV-1p流行株亞型間相似性最高(87.3%)，與作者前期在各亞型BVDV株E2基因比較結(jié)果類似[13]。Erns基因在經(jīng)典亞型組和新亞型組株間差異較大，以BVDV-1d亞型與BVDV-1p亞型流行株間相似性最低(76.7%)。BVDV-1v NX2019/02株與BVDV-1m～1q亞型BVDV株Erns序列相似性(82.0%～86.3%)高于經(jīng)典亞型BVDV-1a～1d(77.8%～80.7%)，表明BVDV-1m～1v等新出現(xiàn)毒株在起源上關(guān)系較為密切。

2.3 基因變異性分析

變異位點分析顯示流行株Erns基因核苷酸序列和推導的氨基酸序列變異位點分別為49.34%(336/681)和26.43%(60/227)，小于作者前期測定的BVDVE2基因(核苷酸和氨基酸變異位點分別為61.76%和60.69%)。在推導的Erns氨基酸序列，His30、His74、Glu75、Lys78、His79RNA酶活性位點以及139KKGK142dsRNA作用基序保守。在Erns蛋白存在7個N-糖基化位點，位于氨基酸第2、11、26、65、95、100、217位，其中第26位糖基化位點(26 NRSL)在BVDV-1m、1o、1p、1q、1v亞型株糖基化位點移位(24 NVSR)(圖1)。此外，在1m亞型GS25株、1p亞型QH2株參與鏈內(nèi)二硫鍵形成的第171位半胱氨酸發(fā)生變異，1 d亞型QH9株該位點半胱氨酸轉(zhuǎn)位至第181位。

圖1 各亞型BVDV株Erns N-糖基化位點(N95、N100、N217糖基化位點未顯示)

2.4 系統(tǒng)進化分析

利用Mega7.0對獲得Erns基因核苷酸序列與GenBank中收錄的參考株進行序列比對并進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明，在西北地區(qū)BVDV表現(xiàn)為區(qū)域亞型多樣性(甘肅省7種：1a、1b、1c、1m、1o、1p、1q基因亞型；青海省5種：1b、1d、1m、1p、1q基因亞型；寧夏區(qū)5種：1d、1m、1q、2a以及1v新基因亞型)。在3省區(qū)均存在1m、1q基因亞型BVDV株，以1m基因亞型株最為普遍(33.33%，11/33)，且1m 亞型株Erns基因相似性較高(93.5%～97.9%)，未發(fā)現(xiàn)明顯地域性差異；其次為甘肅及青海2省共存的1b亞型(5/33)和1p亞型(4/33)(圖2A)。為驗證基于Erns基因的系統(tǒng)進化分析結(jié)果，進一步擴增測定NX2019/02株等19條5′UTR序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2B)，證實NX2019/02株屬BVDV-1v新基因亞型。1p基因亞型雙峰駝分離株Camel5Erns基因與甘肅株GS11的Erns基因核苷酸相似性(95.1%)高于QH2、QH11等青海流行株(90.0%～90.4%)，1q基因亞型GS26株、QH5株、QH8株分別與Camel-6雙峰駝分離株以及SD0803豬源分離株存在較高Erns基因相似性(分別為98.3%和96.4%～98.6%)。利用Erns基因進化樹和5′UTR進化樹分析BVDV株親緣關(guān)系結(jié)果較一致，但5′UTR 進化樹揭示GS6株與青海分離株的進化關(guān)系效果略次于Erns基因進化樹(圖2A、B)。由于Erns基因在BVDV株間差異性略小于E2基因但顯著高于5′UTR區(qū)段，因此在精細定位BVDV株的進化關(guān)系中具有顯著優(yōu)勢。

圖2 基于Erns基因(A)和5′UTR核苷酸(B)的各亞型BVDV株系統(tǒng)進化分析

3 討 論

自1946年美國首次報道牛病毒性腹瀉，至今已有70余年。BVDV以牛為主要宿主，還可感染羊、豬、牦牛、鹿等家畜和多種野生偶蹄動物[15]。BVDV-1基因型在世界各地普遍流行，而BVDV-2 基因型在北美、南美、歐洲、亞洲流行，目前已發(fā)現(xiàn)BVDV-1a～1w、BVDV-2a～2d等基因亞型。BVDV-3基因型主要分布于巴西、泰國、意大利、孟加拉國、印度、阿根廷、土耳其等國家。相關(guān)研究表明，在我國牛BVDV總體抗體陽性率高達57%，RT-PCR陽性率約為27.1%[16]，但病毒抗原陽性率較低(0.71%～3.66%)[17-18]，流行株主要有BVDV-1a～1d、BVDV-1m～1q、BVDV-1u～1w、BVDV-2a～2b等亞型[6-12]。此外，在河南、山東省相繼報道山羊、綿羊以及肉牛因BVDV-3自然感染發(fā)病[19-20]。本研究利用疑似BVDV感染?？鼓獦颖狙芯坎煌瑏喰椭闑rns抗原基因的差異，RT-PCR總體陽性率(37.33%)和抗原陽性率略高于前期普查性研究。作者發(fā)現(xiàn)在西北地區(qū)1a、1b、1d、1q亞型BVDV流行態(tài)勢與前期報道類似[21-23]，但BVDV-1m亞型株目前流行最普遍。BVDV-1p基因亞型株最早于2007年分離于北京奶牛[7]，在我國江蘇和西南地區(qū)山羊以及西北區(qū)雙峰駝均有報道[24-26]，在本研究中發(fā)現(xiàn)其在西北省區(qū)其檢出率與1q株相當，僅次于BVDV-1m株。在寧夏首次檢出BVDV-2a基因型，但其與我國前期分離株的親緣關(guān)系相對較遠，與之類似近期北美商品血清來源的BVDV-2分離株的報道[27]，提示國外傳入BVDV-2株的風險不容忽視。

目前，BVDV分離株的亞型鑒定大多基于5′UTR、N基因核苷酸相似性，由于不同亞型株的基因重組可能造成BVDV株遺傳分析的偏差[28]。因此日本學者曾增加E2 N端編碼區(qū)、NS3基因片段、NS5B-3′UTR 的系統(tǒng)進化分析以提高準確性[29]?？乖幋a基因在BVDV株間變異最大，在揭示病毒遺傳演化規(guī)律中更具優(yōu)勢。與作者前期發(fā)表的BVDV流行株E2基因的分析結(jié)果類似[13]，本研究發(fā)現(xiàn)Erns基因也可作為研究BVDV遺傳演化的靶標基因，精細定位BVDV株進化關(guān)系。此外，我們發(fā)現(xiàn)RNA酶活性位點在BVDV不同亞型株高度保守，但1m～1q、1v等新亞型株Erns糖基化位點錯位，由于ErnsRNA酶活性位點、dsRNA結(jié)合活性位點、糖基化在影響病毒抗原性以及宿主細胞INF產(chǎn)生中具有重要調(diào)控作用[30-31]，國內(nèi)流行株Erns糖基化位點錯位是否影響毒株抗原性或宿主細胞IFN反應的差異，還有待深入研究。

近期研究人員提出了1f、1g、1h、1m～1o、1q亞型株進化的關(guān)聯(lián)性[32]，本研究聚焦于國內(nèi)流行株，首次全面獲取了BVDV Erns編碼基因信息，通過同源性分析進一步揭示了1m～1v亞型BVDV流行株的密切親緣關(guān)系。前期研究人員在山東奶牛[6]和黑龍江肉牛[33]報道了BVDV新亞型1v，本研究進一步發(fā)現(xiàn)在寧夏區(qū)奶牛中也存在同亞型流行株，這一結(jié)果提示1v亞型株在我國的時空分布規(guī)律及其在我國BVDV株演化中扮演的角色值得關(guān)注。

4 結(jié) 論

首次選用Erns靶標基因?qū)ξ鞅辈糠质^(qū)牛源BVDV株進行同源性及系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)10個基因亞型流行株，以1m亞型株最為普遍，1m～1q及1v等亞型BVDV株親緣關(guān)系密切。