鴨甲型肝炎病毒1型與3型雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

林夢(mèng)舟，吳 雙，徐建生，謝 軍，吳 植，姜 勇，朱善元*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；3.江蘇立華牧業(yè)股份有限公司，常州 213000)

近年來(lái)，隨著中國(guó)水禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，鴨常見(jiàn)的傳染性疾病不斷增多[1]，導(dǎo)致鴨病的發(fā)病率和死亡率居高不下，給臨床檢測(cè)和防控帶來(lái)了困擾，嚴(yán)重影響了水禽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis virus A，DHAV)引起的一種急性、高度接觸性的病毒性傳染病[3]，主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，剖檢時(shí)典型特征為肝腫大并帶有出血點(diǎn)[4]，可通過(guò)消化道和呼吸道感染[5]。DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三種不同的基因型[6]。2010年以前，國(guó)內(nèi)發(fā)病以DHAV-1型為主，2013年以后DHAV-3發(fā)病率明顯高于DHAV-1[7]；同時(shí)也存在混合感染的現(xiàn)象[8]，二者的臨床癥狀相似，僅憑剖檢病變難以進(jìn)行鑒別診斷[9-10]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有快速、高效、敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[11]，本研究中建立的DHAV-1和DHAV-3雙重TaqMan熒光定量PCR方法不僅能高效檢測(cè)混合感染情況，還可以準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)物組織的病毒載量。臨床疑似樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法適合臨床推廣、可適用于大規(guī)模樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病原和SPF雛鴨

DHAV-1、DHAV-3、新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)、番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨腺病毒3型(DAdV-3)、新城疫病毒(NDV)、鴨細(xì)小病毒(DPV)、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2-AIV)、鴨圓環(huán)病毒(DuCV)，其中NDV基因來(lái)源為新城疫Ⅳ系活疫苗(LaSota)，其余均由江蘇省生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定、分離和保存。SPF種鴨蛋購(gòu)自山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化至10日齡或出雛，SPF雛鴨轉(zhuǎn)移至隔離器飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自CWBIO，TE引物稀釋液、DNA稀釋液(熒光定量專用)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA 酶(TaKaRaTaqversion 2.0 plus dye)、Premix ExTaq(Probe qPCR)、Premix Taq PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、E.coliDH5α均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，克隆載體pGEM?T-easy 購(gòu)自Promega 公司，2000 bp DNA marker、50 bp DNA marker均購(gòu)自Solarbio，F(xiàn)astPrep-24TM5G 高速勻漿儀購(gòu)自美國(guó)MP公司，Veriti PCR儀和 QuantStudio 3 Real-time PCR System 均購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied biosystems)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

從NCBI/GenBank上下載DHAV-1(89株)和DHAV-3(35株)的基因序列，經(jīng)過(guò)BioEdit軟件分析，使用Gene Runner 和Primer Express軟件分別針對(duì)保守的VP1序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性標(biāo)準(zhǔn)品引物(表1)和一對(duì)特異性熒光定量PCR引物與探針(表2)，BLAST結(jié)果表明引物和探針具有良好特異性，引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品引物序列

表2 熒光定量PCR引物及探針序列

1.4 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

剪取常規(guī)PCR方法鑒定的DHAV-1、DHAV-3陽(yáng)性病料，與PBS按1∶9加入到2 mL研磨管中，使用FastPrep-24TM5G勻漿機(jī)將樣品勻漿，經(jīng)過(guò)10 min高速(10 000 g·min-1)離心后，吸出上清。參照Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒、PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，對(duì)DHAV-1、DHAV-3、NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV、DuCV進(jìn)行核酸提取與反轉(zhuǎn)錄。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以提取的DHAV-1、DHAV-3基因組為模板分別進(jìn)行VP1基因的PCR擴(kuò)增，體系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL、模板2 μL，無(wú)核酸酶的滅菌水補(bǔ)至終體積50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 5 min;-4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后切下與預(yù)期大小一致(DHAV-1為257 bp、DHAV-3為274 bp)的目的條帶，參照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit 凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收，得到目的片段后與 pGEM?T-easy 載體連接，再轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。涂布菌液于AIX板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行搖菌，經(jīng)菌液PCR鑒定及酶切鑒定正確的菌液送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。參照FastPure Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，用微量蛋白核酸定量?jī)x測(cè)定質(zhì)粒濃度，重組質(zhì)?？截悢?shù)由下式計(jì)算[12]：

質(zhì)?？截悢?shù)=(6.02×1023)×(質(zhì)粒含量×10-9)/(質(zhì)粒長(zhǎng)度×660)

將DHAV-1與DHAV-3的質(zhì)粒分別稀釋至2×109copies·μL-1后，合并為1×109copies·μL-1的混合質(zhì)粒，再作10倍梯度稀釋，制備得109～101copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.6 雙重 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

1.6.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過(guò)調(diào)整引物濃度、探針濃度和退火溫度，摸索雙重q-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)S型擴(kuò)增且無(wú)Ct值。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將測(cè)序正確的質(zhì)粒按拷貝數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，在建立DHAV-1和DHAV-3單重q-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上建立了DHAV-1和DHAV-3雙重q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 特異性試驗(yàn) 分別取 NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV、DuCV的DNA或RNA按照相同條件代替DHAV-1與DHAV-3進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，滅菌超純水為陰性對(duì)照，以驗(yàn)證其特異性。

1.6.4 敏感性試驗(yàn)

1.6.4.1 檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)粒的敏感性：將上述10倍梯度稀釋(105～101copies·μL-1)的標(biāo)準(zhǔn)品作為擴(kuò)增模板進(jìn)行q-PCR，確定其敏感性。

1.6.4.2 檢測(cè)病料的敏感性：提取新鮮病料的RNA并反轉(zhuǎn)錄，按已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。確定拷貝數(shù)后10倍梯度稀釋，用作模板驗(yàn)證敏感性。

1.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 使用106～104copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒來(lái)確定其重復(fù)性，組間及組內(nèi)變異系數(shù)均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)組織樣品檢測(cè)

為了初步驗(yàn)證臨床疑似樣品的檢出率，利用q-PCR 方法分別鑒定出僅含有DHAV-1或DHAV-3的2份陽(yáng)性病料，取出這2份陽(yáng)性病料進(jìn)行研磨、離心，將上清過(guò)濾后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚，收取尿囊液傳代5次。分別取第5代次尿囊液按照103ELD50的量經(jīng)腿部肌內(nèi)注射接種7日齡SPF雛鴨，設(shè)置PBS對(duì)照組，劑量均為0.2 mL·只-1，每組各3只。48 h后剖解，取其心、腦、脾、肝。核酸提取與反轉(zhuǎn)錄方法同“1.4”。利用已建立的雙重定量方法對(duì)各器官內(nèi)的病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

選取2017—2019年來(lái)自蘇中、蘇北地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)鴨場(chǎng)的40份疑似感染鴨肝炎病毒的組織樣品，處理方法同“1.7”，使用相同的DHAV1-105與DHAV3-94引物，應(yīng)用建立的q-PCR 方法與常規(guī) PCR 方法分別進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的陽(yáng)性率(陽(yáng)性數(shù)/總檢測(cè)數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1 雙重q-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

將引物和探針?lè)謩e稀釋至10 μmol·L-1，使用矩陣法尋找最優(yōu)引物用量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL)、探針用量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL)和退火溫度(57、58、59、60、61和 62 ℃)。DHAV-1反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，共40次循環(huán)；DHAV-3優(yōu)化后退火溫度為61 ℃，其余條件與DHAV-1一致。在此單重檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度后，得到雙重q-PCR反應(yīng)體系: 12.5 μL 2×Premix ExTaq(Probe qPCR)，0.5 μL 50×ROX Reference Dye，DHAV-1與DHAV-3上下游引物各0.6 μL，探針?lè)謩e為0.8與0.5 μL，1.0 μL DNA模板，滅菌超純水分別為9.0和9.3 μL。退火溫度為60 ℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

DHAV-1與DHAV-3分別選擇FAM和VIC為熒光基團(tuán)。使用濃度為1×108～1×103copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，按照已優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其中，DHAV1-VP1的線性關(guān)系表達(dá)式為Y1=-3.116X+42.385，R2=1，E= 109.36%；DHAV3-VP1的線性關(guān)系表達(dá)式為Y2=-3.147X+41.366，R2=0.999，E=107.876%。擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)良好，說(shuō)明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可靠性。

A.DHAV-3；B.DHAV-1

2.3 雙重q-PCR的特異性

應(yīng)用本研究建立的雙重TaqMan熒光定量PCR方法對(duì)DHAV-1、DHAV-3、NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV和DuCV的基因組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示，DHAV-1和DHAV-3出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性擴(kuò)增，其他病毒和陰性對(duì)照均為陰性擴(kuò)增，表明該檢測(cè)方法特異性優(yōu)良。

A.DHAV-3；B.DHAV-1；C.陰性對(duì)照及其他病毒

2.4 雙重q-PCR的檢測(cè)敏感性

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品PCR檢測(cè)的敏感性 采用本研究已經(jīng)建立的檢測(cè)方法，將105～101copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)品作為擴(kuò)增模板分別進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)與q-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3和圖4a，DHAV-1與DHAV-3的常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度分別為104、103copies·μL-1，q-PCR 檢測(cè)靈敏度均為10 copies·μL-1，比較兩種方法的結(jié)果，可見(jiàn)使用雙重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法比常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度分別提升了1 000倍和100倍，表明本研究建立的檢測(cè)方法可大大提高最低檢測(cè)限。

圖3 DHAV-1(左)與DHAV-3(右)常規(guī)PCR靈敏度(標(biāo)準(zhǔn)品)

2.4.2 病料PCR檢測(cè)的敏感性 將DHAV-1與DHAV-3的cDNA按已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，并分別稀釋至2×105后混合，再進(jìn)行10倍梯度稀釋得到105～101copies·μL-1的病料標(biāo)準(zhǔn)品。以病料標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖4b)與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一致，說(shuō)明本方法可以運(yùn)用于臨床檢測(cè)。

a.標(biāo)準(zhǔn)品(105～101 copies·L-1)；b.組織病料(105～101 copies·L-1)；A.DHAV-3；B.DHAV-1

2.5 雙重q-PCR的重復(fù)性

以106～104copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，同一批次做三個(gè)重復(fù)驗(yàn)證組內(nèi)變異系數(shù)，做三個(gè)批次驗(yàn)證組間變異系數(shù)，結(jié)果表明，DHAV-1、DHAV-3的組內(nèi)變異系數(shù)均小于0.76%，組間變異系數(shù)均小于0.61%，說(shuō)明建立的雙重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法有良好的重復(fù)性。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)組織樣品檢測(cè)

攻毒后24～48 h雛鴨均出現(xiàn)明顯角弓反張，并且很快死亡，剖解后取心、腦、脾和肝等臟器組織，用已建立的雙重q-PCR方法分別對(duì)DHAV-1與DHAV-3攻毒組鴨心、腦、脾、肝進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5，DHAV-1與DHAV-3感染病鴨的各器官內(nèi)均含有病毒，肝和脾內(nèi)病毒含量最高，DHAV-1感染量達(dá)到(7.0～7.3)×105copies·mg-1，DHAV-3感染量達(dá)到(2.5～2.6)×107copies·mg-1。

圖5 DHAV-1與DHAV-3攻毒組各器官病毒含量

2.7 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究中建立的雙重Taqman熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自蘇中、蘇北地區(qū)的疑似患病鴨的心、腦、脾、肝等臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，q-PCR的DHAV-1陽(yáng)性率為37.5%(15/40)，DHAV-3陽(yáng)性率為60%(24/40)，其中混合感染的陽(yáng)性率為7.5%(3/40)，總陽(yáng)性率為90%(36/40)；常規(guī)PCR方法的DHAV-1陽(yáng)性率為20%(8/40)，DHAV-3的陽(yáng)性率為52.5%(21/40)，總陽(yáng)性檢出率為(72.5%)。其中，q-PCR檢測(cè)中高Ct值(>35)的樣品使用常規(guī)PCR方法并不能檢出。臨床檢測(cè)結(jié)果顯示，鴨肝炎病毒的感染情況復(fù)雜，存在混合感染的現(xiàn)象，并且常規(guī)PCR的檢測(cè)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒篩查的全面覆蓋，因此建立靈敏、高度特異的雙重檢測(cè)方法尤為重要。

3 討 論

DHAV屬于小 RNA 病毒科，DHAV-1與DHAV-3是國(guó)內(nèi)流行的兩種基因型[13]，具有相同的基因組結(jié)構(gòu)[14]，大小約為7.7 kb[15]。其基因組主要由5′端非編碼區(qū)、開(kāi)放閱讀框、3′端非編碼區(qū)和Poly(A)尾巴構(gòu)成[16]。整個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼三種成熟的結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP1和VP3)和9種非結(jié)構(gòu)蛋白(A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D)[17]。

近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，鴨養(yǎng)殖量不斷增加，一旦暴發(fā)鴨病毒性肝炎，就會(huì)導(dǎo)致大量雛鴨死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)，同時(shí)存在DHAV-1和DHAV-3的流行，但由于這兩種病原引起的雛鴨發(fā)病癥狀和病理變化都非常相似，在臨床上難以區(qū)分[18]。此外，由于抗原性不同，經(jīng)中和試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)證實(shí)，DHAV-1與DHAV-3不能形成交叉保護(hù)[19]，實(shí)際情況下DHAV-1疫苗不能避免雛鴨感染DHAV-3。及時(shí)確診DHAV的發(fā)生和流行，并評(píng)估當(dāng)前的流行趨勢(shì)，有助于最大程度地減少損失。因此，建立針對(duì)該疾病的高效、精確、靈敏和特異的檢測(cè)方法十分重要，有助于確定病原的類型，并且對(duì)疾病的預(yù)防、治療和控制有重大意義。

目前，PCR是用于DHAV檢測(cè)的首選方法。但是，傳統(tǒng)的PCR測(cè)試需要多個(gè)步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且假陽(yáng)性率高、特異性差。q-PCR與傳統(tǒng)PCR相比更具優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)兼顧定性與定量[20]，并且時(shí)間成本更低，更適用于樣品的大規(guī)模檢測(cè)。在已報(bào)道的研究中，劉海燕等[21]建立的一種針對(duì)DHAV-1的單一q-PCR 檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為20 copies·μL-1；胡琴等[22]開(kāi)發(fā)了用于DHAV-3的q-PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)限為10 copies·reaction-1。試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的雙重q-PCR檢測(cè)方法同樣具有單一q-PCR 檢測(cè)方法的快速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

為了評(píng)估該方法，對(duì)7日齡雛鴨進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，以及對(duì)2017—2019年間來(lái)自蘇中、蘇北地區(qū)的40份疑似鴨肝炎病毒感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)。動(dòng)物試驗(yàn)中組織樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，DHAV-1與DHAV-3感染病鴨的肝和脾中病毒含量明顯高于其他臟器，分別可達(dá)到(7.0～7.3)×105copies·mg-1和(2.5～2.6)×107copies·mg-1。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，DHAV-1、DHAV-3和混合感染的陽(yáng)性檢出率分別為37.5%、60%和7.5%。以上結(jié)果驗(yàn)證了本研究中所建立方法的準(zhǔn)確性、靈敏性、重復(fù)性及可靠性。

4 結(jié) 論

本研究中建立的DHAV-1與DHAV-3 雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法在103～108copies·μL-1內(nèi)建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線且線性關(guān)系良好；DHAV-1與DHAV-3的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到10 copies·μL-1；證明建立的檢測(cè)方法檢測(cè)范圍廣，靈敏度高及特異性優(yōu)良。該雙重q-PCR檢測(cè)方法可作為一種診斷和檢測(cè)DHAV-1、DHAV-3及其混合感染的可靠工具，有助于對(duì)鴨肝炎病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。