奶牛分娩前后瘤胃代謝物變化規(guī)律及其代謝通路研究

張瑞雪，劉 欣，徐曉鋒，張 博，唐玉林，任 曼，郭延生

(寧夏大學農學院，銀川 750021)

圍產(chǎn)期是奶牛生產(chǎn)周期中一個重要的過渡期，從妊娠晚期到泌乳初期，奶牛在生理、營養(yǎng)和代謝等方面經(jīng)歷了巨大的變化。奶牛分娩前胎兒體積增大，能量需求急劇增加，而此時瘤胃空間被嚴重壓縮，分娩激素水平快速升高[1]，導致干物質采食量急劇下降，易出現(xiàn)能量負平衡。而產(chǎn)后泌乳啟動，會進一步加劇能量負平衡，脂肪大量動員，導致代謝性和炎癥性疾病頻發(fā)[2]。瘤胃及其微生物在反芻動物的消化代謝中占據(jù)極其重要的地位，瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸為機體供能。動物體內約90%的葡萄糖是由糖異生供給的，其中50%～60%的葡萄糖是由丙酸經(jīng)過肝糖異生作用生成的，因此，瘤胃代謝水平與能量負平衡密切相關。有研究指出，在分娩前后監(jiān)測反芻時間是預測奶牛泌乳早期疾病的有效方法[3]。可見，研究分娩前后瘤胃代謝物的變化規(guī)律對揭示圍產(chǎn)期奶牛的生理狀態(tài)擾動、產(chǎn)后營養(yǎng)調控和疾病的預防具有十分重要的意義。目前，國內外學者采用代謝組學技術對奶牛分娩前后血液代謝物的變化進行了較為詳細的研究[4-6]，如 Kenéz等[5]發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期奶牛血液代謝輪廓發(fā)生了明顯變化，分娩前第10天甘油磷脂類和鞘脂類代謝物含量較產(chǎn)前40 d明顯降低，而分娩后第3天這兩類物質含量較產(chǎn)后21 d也明顯降低。Luo等[6]發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩后血液中32種代謝物較產(chǎn)前21 d顯著升高，35種代謝物顯著降低，上升的代謝物與脂質代謝和能量代謝有關，下降的代謝物與氨基酸代謝有關。但目前關于奶牛分娩前后瘤胃代謝物的變化尚未見相關報道，因此，本試驗采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)代謝組學技術和代謝通路分析方法，研究奶牛分娩前后瘤胃小分子物質的代謝輪廓和通路的變化規(guī)律，旨在進一步揭示奶牛分娩前后的代謝狀態(tài)，為圍產(chǎn)期營養(yǎng)奶牛的調控和疾病預防提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器與試劑 超高效液相色譜(UPLC Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，日本島津)、色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm，美國)、離心機(Centrifuge 5424 R Eppendorf，德國)、LC-MS/MS質譜儀(6500 QTRAP UPLC SCIEX，美國)、串聯(lián)質譜(Tandem mass spectrometry，MS/MS，美國)。

甲醇(Merck，德國)、乙醇(Merck，德國)、甲腈(Merck，德國)、冰甲醇(Merck，德國)、標準品(BioBioPha/Sigma-Aldrich，美國)。

1.1.2 試驗動物的選擇、分組與采樣 在寧夏某大型集約化養(yǎng)殖場，選取產(chǎn)前7～10 d、胎次2～3次、體況評分3.2～3.5、體重(600±20)kg的健康待產(chǎn)荷斯坦奶牛10頭，統(tǒng)一用TMR混合日糧飼喂(見表1)，干物質采食量為(9.8±0.6)kg·d-1。分別于分娩前7～10 d(B組)晨飼前和分娩后當天未進飼前(D組)收集瘤胃液，方法是將帶有金屬過濾裝置的采集器一端插入瘤胃，用50 mL注射器將瘤胃液吸出，棄掉第一管瘤胃液，第二管瘤胃液作為待測樣品(采樣前用溫水充分沖洗采樣器，以最大限度地減少唾液污染)。收集到的瘤胃液經(jīng)4層粗棉布過濾后注入到15 mL 螺旋離心管，在4 ℃，12 000 r·min-1下離心15 min，然后取上清液于1.5 mL離心管，-80 ℃保存。產(chǎn)前7～10 d瘤胃液分別標記為B1、B2……B10，分娩當天瘤胃液分別標記為D1、D2……D10。

表1 奶牛產(chǎn)前TMR日糧配方表

1.2 試驗方法

1.2.1 瘤胃液預處理 瘤胃液冰上解凍，渦旋10 s后取50 μL于EP管中，加入150 μL含1 μg·mL-1的2-氯苯丙氨酸(內標)的冰甲醇渦旋3 min，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液到另一個新的EP管中，4 ℃條件下12 000 r·min-1再離心5 min，吸取上清液到進樣瓶內襯管中，用UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 UPLC-MS/MS檢測條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(1.8 μm, 2.1 mm*100 mm)；A流動相為超純水(0.04%的乙酸)，B流動相為乙腈(0.04%的乙酸)；采用梯度洗脫：0 min A/B腈(95:5(V/V))，11.0 min為5:95(V/V)，12.0 min為5:95(V/V)，12.1 min為95:5(V/V)，14.0 min為95:5(V/V)；

電噴霧離子源溫度：500 ℃，離子源氣體I：55 psi、氣體II：60 psi，質譜電壓正負極分別為：5 500 V和4 500 V，氣簾氣：25 psi，碰撞誘導電離參數(shù)設置為高，根據(jù)優(yōu)化的碰撞能和去簇電壓對每個離子進行掃描檢測[7]。

1.2.3 瘤胃代謝物的定性與定量 根據(jù)保留時間RT(retention time)、子母離子對信息及二級譜數(shù)據(jù)對瘤胃代謝物進行定性分析，利用三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM)進行定量分析[8]，在獲得樣本液質數(shù)據(jù)后，用MultiQuant軟件對所有代謝物的提取離子色譜峰分別進行峰下面積積分，并對其中同一代謝物在不同標本中的色譜峰進行積分校正，每個色譜峰的峰面積(Area)代表對應物質的相對含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用MateboAnanlyst 5.0在線軟件對UPLC-MS/MS原始數(shù)據(jù)預處理后，導入Excel建立包含代謝物編號、積分數(shù)值和代謝物名稱等信息的二維數(shù)據(jù)矩陣，采用無監(jiān)督模式的主成分分析(principal component analysis, PCA)考察分娩前后瘤胃代謝輪廓的變化，采用有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)，獲得變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)值，該值表示對應代謝物組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，大于或等于1表明代謝物在分類判別中有顯著影響，選取VIP≥1的代謝物，同時結合單變量分析的差異倍數(shù)值(Fold change, FC)，進一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05 的代謝物，視為分娩前后瘤胃差異代謝物。然后采用MateboAnanlyst 5.0在線軟件對差異代謝物進行通路分析。

2 結 果

2.1 奶牛分娩前后瘤胃代謝物的定性與定量分析

采用UPLC-MS/MS建立了奶牛瘤胃液MRM代謝物檢測多峰圖(圖1)，根據(jù)RT、子母離子對信息及二級譜數(shù)據(jù)從奶牛瘤胃液中鑒定出了557個代謝物，其中有機酸及其衍生物112個，氨基酸及其代謝物87個，核苷酸及其代謝物53個，碳水化合物及其代謝物36個，脂肪酸33個，磷脂11個，脂質5個，脂肪酰17個，輔酶和維生素18個，氧化脂質13個。對每個鑒定出的代謝物進行了色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積代表對應物質的相對含量。

不同顏色的色譜峰代表檢測到的不同代謝物，橫坐標為代謝物檢測的保留時間

2.2 奶牛分娩前后瘤胃代謝輪廓變化

采用PCA考察奶牛分娩前與分娩后瘤胃代謝輪廓的變化，如圖2A所示，奶牛分娩前與分娩后瘤胃樣品分別位于各自95%的可置信區(qū)間內，說明試驗牛的體況、胎次和生理狀態(tài)具有較好的一致性；與分娩前(B組)相比，分娩后(D組)奶牛瘤胃代謝輪廓發(fā)生了較大變化，說明奶牛分娩前與分娩后瘤胃內代謝物存在明顯差異。

2.3 差異代謝物的篩選結果

為了進一步篩選兩組瘤胃液的差異代謝物，采用有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)對兩組瘤胃液進行建模，OPLS-DA模型得分圖(圖2B)顯示，能夠明顯區(qū)分B組和D組。OPLS-DA模型評價參數(shù)Q2≥0.4和R2Y≤1時，模型被確定為穩(wěn)定和可靠。本試驗OPLS-DA模型驗證圖中R2X為0.281，R2Y為0.981，Q2為0.84，R2Y和Q2的P值均小于0.005(圖3)，說明所建的OPLS-DA模型對分娩前與分娩后奶牛瘤胃液具有良好的預測能力，且能明顯區(qū)分兩組瘤胃液。從該模型中選取VIP≥1的代謝物，視為兩組瘤胃液的候選差異代謝物。然后選擇單變量方差分析中的P<0.05，F(xiàn)C≥2或FC≤0.5的代謝物作為最終差異代謝物。結果顯示，奶牛分娩后瘤胃液中34種差異代謝物相對含量明顯低于分娩前，23種明顯高于分娩前。代謝物的名稱、VIP、FC、P值和變化趨勢詳見圖4、表2和表3。

表2 奶牛分娩后表達下調的代謝物及相關參數(shù)

表3 奶牛分娩后表達上調的代謝物及相關參數(shù)

圖2 分娩前(B組)對分娩后(D組)奶牛瘤胃液代謝物PCA 2D圖(a)和OPLS-DA得分圖(b)

橫坐標表示模型準確率，縱坐標是模型分類效果出現(xiàn)的頻數(shù)，即本模型對數(shù)據(jù)進行200次隨機排列組合試驗

圖中每一個點表示一種代謝物，橫坐標表示某代謝物在兩樣品中FC的對數(shù)值，縱坐標表示P值的負對數(shù)值。橫坐標絕對值越大，說明代謝物在兩樣品間的表達量倍數(shù)差異越大；縱坐標值越大，表明差異表達越顯著，篩選得到的差異表達代謝物越可靠。圖中綠色的點代表差異代謝物表達下調，紅色的點代表上調，黑色的點代表差異不顯著的代謝物

2.4 差異代謝物通路分析及驗證

采用MateboAnanlyst 5.0在線軟件對57個差異代謝物進行通路分析，結果顯示，奶牛分娩前后有9個代謝通路發(fā)生了顯著變化，包括?；撬岷蛠喤；撬岽x、精氨酸和脯氨酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、嘌呤代謝和維生素B6代謝(圖5)。57個差異代謝物中僅有12個代謝物參與了這9個主要代謝通路(圖6)。對上述12個代謝物進行聚類分析驗證，結果如圖7所示，這12個瘤胃差異代謝物能明顯將樣品聚類為B組和D組，說明篩選出的差異代謝物能夠很好地區(qū)分奶牛分娩前與分娩后瘤胃液。

圓圈代表代謝途徑。較深的圓圈表示相應路徑中的代謝物發(fā)生了顯著變化，而圓圈的大小表示路徑影響得分

(+)表示分娩過程中代謝物濃度升高；(-)表示分娩過程中代謝物濃度降低

圖7 奶牛分娩前后瘤胃12個差異代謝物聚類熱圖

3 討 論

瘤胃微生物菌群是一種微生物共生聯(lián)合體，主要包括細菌、真菌、原蟲和噬菌體等幾大類[9]，這些微生物能發(fā)酵碳水化合物飼料、合成B族維生素、將非蛋白氮合成機體所需的菌體蛋白質和發(fā)酵飼料纖維產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)為機體供能[10-11]。眾多研究表明，日糧結構對瘤胃微生物菌群組成和數(shù)量具有顯著影響，如高粗飼日糧條件下瘤胃中的優(yōu)勢種群為棲瘤胃普雷沃氏菌和丁酸弧菌，而飼喂高精料下，嗜淀粉瘤胃桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、反芻獸新月單胞菌和消化鏈球菌為優(yōu)勢種群[12]。瘤胃微生物組成和數(shù)量的差異可影響飼料消化率，因此，瘤胃內代謝物的含量變化可以間接反映瘤胃微生物組成和數(shù)量的相關情況。奶牛從產(chǎn)犢前10 d開始，干物質進食量從10 kg·d-1左右降低到產(chǎn)犢時的6 kg·d-1左右[13]，其瘤胃微生物組成和數(shù)量也必定發(fā)生巨大改變。因此，本試驗選擇相同TMR日糧飼喂條件下的待產(chǎn)奶牛10頭，分析產(chǎn)前7～10 d瘤胃液和分娩后未進食前瘤胃液代謝物的變化規(guī)律，旨在探討分娩因素對瘤胃微生物消化代謝飼料的影響。

奶牛圍產(chǎn)期受應激、神經(jīng)內分泌和激素變化等因素的影響，瘤胃內環(huán)境發(fā)生改變，導致奶牛瘤胃機能減弱，瘤胃微生物蛋白(microbial crude protein, MCP)合成量減少[14-15]。鳥嘌呤、腺嘌呤和次黃嘌呤是瘤胃微生物菌體蛋白合成的前體[16]，L-谷氨酸可經(jīng)過核苷酸代謝途徑生成腺苷酸和腺苷，而天冬氨酸是嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。本研究顯示，奶牛分娩過程中瘤胃內L-天冬氨酸、L-谷氨酸、腺苷和尿酸含量顯著升高，這提示MCP合成量在分娩過程中減少，其主要原因可能是奶牛在分娩過程中受應激、神經(jīng)內分泌和激素等一系列變化的影響，瘤胃微生物數(shù)量減少，以致MCP合成量降低。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中擬桿菌門是奶牛圍產(chǎn)前期瘤胃內的優(yōu)勢菌門，且其豐度與嘌呤代謝呈顯著正相關[17-18]。在嘌呤分解代謝中，鳥嘌呤和腺苷等在酶的作用下，幾乎全部氧化為尿酸。因此，奶牛分娩過程中瘤胃內尿酸含量明顯升高可能與擬桿菌門豐度增加相關。但鳥嘌呤的變化與L-谷氨酸、腺苷和尿酸不一致，其機制有待進一步研究。

目前，關于牛磺酸在瘤胃內的變化尚未見到相關文獻報道，牛磺酸是一種具有多種生理活性和功能的含硫氨基酸，其生產(chǎn)方法有微生物發(fā)酵法、天然提取法和化學合成法[19-20]，Joo等[21-22]研究發(fā)現(xiàn)，通過體外生物工程法可以利用谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生?；撬?。本試驗在奶牛瘤胃液中鑒定出了牛磺酸中間產(chǎn)物2-氨基乙烷磺酸-?；撬?，而且在分娩過程中逐漸升高，提示奶牛分娩過程中與?；撬岽x相關的瘤胃微生物數(shù)量可能增加，但目前參與?；撬岽x的具體瘤胃微生物尚不明確，有待進一步研究。?；撬釋μ荷窠?jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起到關鍵性的作用[23]，本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩過程中瘤胃?；撬岷匡@著升高，推測其可能原因是分娩過程中與?；撬岽x相關的瘤胃微生物數(shù)量應答性增加，以滿足妊娠末期胎兒大腦發(fā)育。

蛋白質在蛋白酶的作用下可分解成氨基酸，后者經(jīng)過脫羧作用可形成組胺、色胺、精胺和亞精胺等生物胺。有研究表明，生物胺的形成與微生物有密切關系，微生物在大量繁殖時可以形成蛋白酶[24]，從而分解飼料或食品中的蛋白質。微生物分解蛋白的能力因種類而異，真菌較細菌容易分解蛋白質，細菌中變形桿菌、嗜淀粉擬桿菌、棲瘤胃擬桿菌和牛鏈球菌等具有分解蛋白質的能力[25-26]。本試驗結果顯示，奶牛分娩過程中瘤胃內亞精胺含量明顯降低，這提示奶牛分娩前參與飼料蛋白質分解的微生物如真菌和細菌中的變形桿菌、嗜淀粉擬桿菌、棲瘤胃擬桿菌和牛鏈球菌等數(shù)量在分娩過程中逐漸減少。

瘤胃微生物具有合成維生素B族和K的能力[27-28]，因此，瘤胃中維生素B族含量的變化在一定程度上可以反映瘤胃微生物的活性。有研究表明，奶牛瘤胃中維生素B6的合成與瘤胃纖維降解菌(白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌)的活性密切相關[29]。VB6又稱吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺。本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩過程中瘤胃內吡哆醇和4-吡哆酸含量減少，這也間接表明奶牛分娩過程中與VB6合成相關的瘤胃微生物纖維降解菌(白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌)的活性明顯下降。VB6與多種代謝反應密切相關，尤其是氨基酸代謝和蛋白質代謝[30]，在氨基酸代謝中作為轉氨酶的輔酶主要參與轉氨基作用[31]，在蛋白質代謝中主要參與抗氧化反應[32]。除此之外，VB6還促進抗體蛋白的合成，提高機體免疫應答[33]。因此，奶牛分娩后適量添加VB6對提高氨基酸和蛋白質代謝、增強機體免疫應答具有一定促進作用。

淀粉是瘤胃微生物的重要能源和碳源，瘤胃中部分細菌、原蟲和真菌具有吞噬和分解飼料淀粉的能力，如原蟲中幾乎所有的內毛蟲和雙毛蟲、細菌中的嗜淀粉瘤胃桿菌、牛鏈球菌、溶淀粉琥珀酸單胞菌、雙歧桿菌和反芻獸新月單胞菌等和真菌中的大多數(shù)厭氧菌[34-35]。這些瘤胃微生物能產(chǎn)生α-淀粉酶，將淀粉水解為麥芽糖[36]，進而通過蔗糖和淀粉代謝和半乳糖代謝途徑生成葡萄糖和乳糖。另據(jù)報道，原蟲可限制細菌對淀粉的快速發(fā)酵，當原蟲數(shù)量不足時淀粉會被細菌發(fā)酵成乳酸，瘤胃pH急劇下降，導致瘤胃對纖維素消化能力下降或引起酸中毒[37]。因此，瘤胃中可溶性糖含量的高低可以間接反映瘤胃微生物的組成與數(shù)量。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩過程中瘤胃內麥芽糖、葡萄糖和乳糖含量顯著低于分娩前，表明奶牛分娩過程中能發(fā)酵淀粉的微生物原蟲、嗜淀粉瘤胃桿菌、牛鏈球菌、溶淀粉琥珀酸單胞菌、雙歧桿菌、反芻獸新月單胞菌和厭氧菌的數(shù)量逐漸減少。

奶牛分娩前后血液激素水平會發(fā)生較大擾動，部分激素會通過唾液進入瘤胃。本試驗通過代謝組學技術，發(fā)現(xiàn)奶牛分娩前后瘤胃內腎上腺素水平發(fā)生了明顯變化，分娩后明顯低于分娩前。分娩等應激因素可以刺激腎上腺素能系統(tǒng)和腎上腺-促腎上腺皮質軸，導致反芻動物飼料攝入量減少、瘤胃收縮功能和產(chǎn)奶性能下降[38]。因此，分娩前后瘤胃內腎上腺素的變化可能與分娩應激有關，分娩應激刺激腎上腺素能系統(tǒng)和腎上腺-促腎上腺皮質軸釋放大量腎上腺素進入血液，又經(jīng)過唾液進入瘤胃。腎上腺素除影響采食量和瘤胃蠕動外，還對瘤胃微生物區(qū)系的組成與數(shù)量產(chǎn)生一定影響。有研究報道，在飼料中添加β-腎上腺素能激動劑能影響瘤胃微生物在門水平的豐度，其中纖維桿菌門的豐度明顯升高[39]。因此，分娩過程中瘤胃內腎上腺素濃度的下降可能會導致纖維桿菌門的豐度降低，使纖維素分解能力下降，VFA減少，加之采食量和瘤胃蠕動機能下降，極易誘發(fā)產(chǎn)后能量負平衡。另據(jù)報道，腎上腺素可以促進瘤胃上皮細胞通過β2-腎上腺素受體吸收瘤胃內葡萄糖，從而降低瘤胃內葡萄糖的水平，減緩或防止瘤胃酸中毒的發(fā)生[40]。但本試驗結果顯示，奶牛分娩過程中瘤胃內腎上腺素和葡萄糖的濃度均呈減少趨勢，這與腎上腺素能刺激瘤胃上皮細胞吸收葡萄糖理論不一致。瘤胃內葡萄糖濃度的變化取決于其生成和吸收這兩個因素的影響，因此，本研究中奶牛分娩過程中瘤胃內葡萄糖濃度降低可能主要與參與淀粉發(fā)酵的微生物數(shù)量嚴重減少有關。

4 結 論

本試驗采用UPLC-MS/MS代謝組學技術和MetaboAnanlyst 5.0中的通路分析方法研究了奶牛分娩前后瘤胃代謝物及其代謝通路的變化規(guī)律，確定了57種差異代謝物，奶牛分娩后有34種差異代謝物含量降低，23種升高，導致?；撬岷蛠喤；撬岽x、精氨酸和脯氨酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、嘌呤代謝和維生素B6代謝發(fā)生顯著改變。說明奶牛分娩過程中與氨基酸、糖、核苷酸和維生素相關的瘤胃微生物菌群組成發(fā)生了應答性改變。