犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睪丸中的表達對比分析

閔星宇，楊麗雪，楊滿珍，胡宇磊，于海玲，楊璐瑜，李 鍵,2，熊顯榮,

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳育種資源保護與利用國家教育部重點實驗室，成都 610041；3.動物科學(xué)國家民委重點實驗室，成都 610041)

犏牛是牦牛(Bosgrunniens)與普通牛(Bostaurus)通過遠緣雜交得到的F1代，按生產(chǎn)功能可分為乳用、肉用和役用犏牛等。牦牛生產(chǎn)性能低下，普通牛又無法適應(yīng)青藏高原惡劣的高寒低氧環(huán)境，而犏牛具有顯著的雜種優(yōu)勢，其體格大、生長快，產(chǎn)奶和產(chǎn)肉性能與牦牛相比都具有顯著的優(yōu)勢，且具有良好的高原適應(yīng)性[1-3]，深受藏區(qū)牧民喜愛。但犏牛雄性不育的缺陷，使得無法通過橫交固定其雜種優(yōu)勢，這嚴重阻礙了雜種優(yōu)勢的利用[4-5]。因此，解析雄性犏牛不育對提高青藏高原畜牧生產(chǎn)水平、改善牧民生活品質(zhì)和發(fā)展青藏高原特色畜牧產(chǎn)業(yè)都具備巨大的潛在價值。

ESCO2是一種黏連蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，其主要功能是在S期介導(dǎo)黏連蛋白復(fù)合體中染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白2(SMC3)亞基的乙?；?，而黏連蛋白復(fù)合體在Sororin的作用下將姐妹染色單體束縛在一起，可確保它們在細胞分裂過程中準確對齊和分離[6-9]，是細胞分裂過程中黏連蛋白復(fù)合體乙?；椭z粒結(jié)合的必要條件[10]。人ESCO2基因的突變會導(dǎo)致一種常染色體隱形遺傳疾病——羅伯茨綜合征(Roberts syndrome, RBS)，其患者表現(xiàn)為出生前和出生后發(fā)育遲緩，顱面、小頭、肢體畸形和精神缺陷[11-12]。Hogarth等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ESCO2是哺乳動物有絲分裂到減數(shù)分裂過渡的潛在調(diào)節(jié)因子，在特異性敲除不孕小鼠卵巢[14]和低生殖力鯰魚性腺[15]中表現(xiàn)為下調(diào)。小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中，ESCO2通過與組蛋白H4結(jié)合并介導(dǎo)H4K16乙?；瘉碚{(diào)節(jié)紡錘體組裝檢查點(SAC)，耗竭ESCO2會導(dǎo)致極體的提前排出，并造成非整倍體卵的產(chǎn)生[16-18]。ESCO2能夠修復(fù)雙鏈染色體的斷裂，在雄性減數(shù)分裂中發(fā)揮重要的作用，其異常表達可引起精子發(fā)生障礙和雄性不育[16]。Mcnicoll等[19]的研究揭示，ESCO2是雄性配子發(fā)生過程中必不可少的調(diào)節(jié)因子，特異性敲除ESCO2導(dǎo)致雄性小鼠不育。然而，關(guān)于ESCO2基因的研究主要集中在小鼠和人，該基因近期在犏牛和牦牛上的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究以犏牛為研究對象，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得犏牛ESCO2編碼區(qū)完整序列，并對該序列進行生物信息學(xué)分析，同時采用qRT-PCR和IHC染色檢測其在犏牛各組織及不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達，以期為揭示ESCO2在減數(shù)分裂中的作用及調(diào)控精子發(fā)生機制提供參考，為進一步從分子水平解析犏牛雄性不育機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

動物樣品采自成都市周邊牦牛屠宰場，健康犏牛和牦牛宰殺后立即使用無菌剪采集心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉、脂肪和附睪組織，隨后采集睪丸組織，根據(jù)年齡分為胎牛時期(5～6月齡)、幼年時期(1～2歲)和成年時期(3～4歲)。以上所有樣本每組各取3頭為生物學(xué)重復(fù)，采集的樣本使用高壓滅菌處理的生理鹽水沖洗剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的組織塊，部分置于液氮罐中帶回實驗室，于-80 ℃保存?zhèn)溆茫徊糠质褂?%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 組織總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

犏牛和牦牛的組織經(jīng)液氮快速研磨后，使用Trizol Reagent(Invitrogen，美國)進行總RNA的提取，使用紫外分光光度計(Biospec-nano，日本)檢測RNA的濃度和純度，選取OD260 nm/OD280 nm介于1.8～2.0的RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，備用。根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)使用說明合成第一鏈cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計與基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取野牦牛(Bosmutus)ESCO2基因預(yù)測序列(登錄號：XM_005900074)和β-actin基因序列(登錄號：DQ838049.1)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物(表1)，并送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。以睪丸組織cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)在PCR儀(Applied Biosystems，美國)擴增犏牛ESCO2基因CDS區(qū)序列，PCR擴增體系為25 μL：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。使用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按照膠回收試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)說明對目的擴增產(chǎn)物進行純化回收，交由生工生物工程(上海)股份有限公司成都測序?qū)嶒炇覝y序。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.4 ESCO2生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找犏牛ESCO2克隆序列開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列，采用EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)在線軟件比對犏牛和牦牛ESCO2基因CDS區(qū)核苷酸序列。采用T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)在線軟件并結(jié)合Jalview軟件多重比較犏牛和牦牛與其他物種的氨基酸序列，通過MEME(https://meme-suite.org/meme/)在線工具分析查找具有高度保守性的基序，并用MEGA7軟件構(gòu)建ESCO2蛋白的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件進行ESCO2蛋白基本理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域和信號肽分析。通過SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)和STRING 11.0(https://string-db.org/)在線工具預(yù)測ESCO2蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和互作蛋白。

1.5 犏牛ESCO2基因的組織表達譜

以β-actin為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量儀(Bio-Rad，美國)檢測ESCO2基因在犏牛各組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉、脂肪、附睪和睪丸組織)中的表達量并進行表達譜分析，及其在不同時期(胎牛時期、幼年時期和成年時期)犏牛和牦牛睪丸組織中的表達量。20 μL反應(yīng)體系如下：2× NovaStart SYBR qPCR Super Mix plus 10 μL，cDNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，39個循環(huán)；熔解曲線為65～95 ℃每10 s增加0.5 ℃。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測ESCO2在犏牛及牦牛睪丸中的定位

將犏牛和牦牛胎牛時期、幼年時期和成年時期的睪丸組織從4%多聚甲醛組織固定液中取出，制作不同發(fā)育時期睪丸石蠟切片。依次將切片放入二甲苯中脫蠟，使用梯度酒精洗滌后，置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)的修復(fù)盒中，在微波爐中加熱進行抗原修復(fù)；切片自然冷卻后在PBS中晃動洗滌后放入3%雙氧水溶液中阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；3%BSA均勻覆蓋組織室溫封閉30 min后，滴加一抗(多克隆兔抗ESCO2，1∶100稀釋，博奧森)4 ℃孵育過夜；使用PBS洗滌玻片3次后，滴加相應(yīng)種屬的二抗(辣根過氧化物酶標記)覆蓋組織，室溫孵育50 min；PBS洗滌后滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，自來水沖洗切片終止顯色；蘇木精復(fù)染3 min 左右，復(fù)染細胞核；依次將切片放入梯度酒精和二甲苯脫水透明后，使用中性樹膠封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔCt法對qRT-PCR結(jié)果進行計算，所有試驗數(shù)據(jù)使用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。每組試驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 犏牛和牦牛ESCO2基因CDS區(qū)序列特征分析

本研究以犏牛和牦牛睪丸組織cDNA為模板，F(xiàn)1、R1為上下游引物，對ESCO2基因的CDS區(qū)進行擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)測序獲得犏牛2 742 bp的核苷酸序列，其犏牛ESCO2基因CDS長度為1 833 bp，可編碼610個氨基酸；牦牛2 690 bp的核苷酸序列，其牦牛ESCO2基因CDS長度為1 776 bp，可編碼591個氨基酸。犏牛與牦牛ESCO2基因CDS區(qū)核苷酸序列的比對結(jié)果顯示共有7處變化，同源性為96.6%，其中在第4處犏牛比牦牛多57個堿基，導(dǎo)致氨基酸序列N端第301～319位多編碼19個氨基酸，第2處C→T突變，編碼的亮氨酸變?yōu)楸奖彼?，?處G→A突變，編碼的甘氨酸變?yōu)樘於彼?，?處C→T突變，編碼的蘇氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，另?處均為同義突變。犏牛ESCO2蛋白的分子量、等電點和分子式分別為69 049.02、9.36和C3038H4890N852O927S27；牦牛ESCO2蛋白的分子量、等電點和分子式分別為66 781.62、9.48和C2947H4755N827O890S24。犏牛和牦牛ESCO2蛋白均不含信號肽且無跨膜結(jié)構(gòu)域。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準; 1.犏牛ESCO2基因擴增產(chǎn)物; 2.牦牛ESCO2基因擴增產(chǎn)物; 3.空白對照; 4.犏牛β-actin擴增產(chǎn)物

2.2 犏牛ESCO2蛋白的同源性分析

多重比較犏牛和其它14種哺乳動物ESCO2蛋白的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犏牛與黃牛的氨基酸序列同源性最高(100%)，依次為水牛(98.69%)、牦牛(96.39%)、山羊(96.23%)、抹香鯨(88.07%)、豬(84.80%)、單峰駝(84.31%)、家馬(84.20%)、灰熊(81.43%)、家貓(80.46%)、家犬(76.80%)、家兔(76.62)、智人(76.26%)和小鼠(67.59%)。通過MEME軟件在線分析獲得ESCO2蛋白最保守的3個 基序，分別位于犏牛ESCO2氨基酸序列N端第383～432、434～483和526～565位點，對比發(fā)現(xiàn)不同物種ESCO2蛋白對應(yīng)基序氨基酸序列具有高度保守性。使用MEGA7軟件分析15種哺乳動物的氨基酸序列并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)犏牛和黃牛聚為一支，在進化上與水牛、牦牛和山羊親緣關(guān)系較近，與其他物種較遠，這與同源性結(jié)果一致(圖2)。

圖2 ESCO2蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3 ESCO2蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

采用SOPMA預(yù)測ESCO2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，犏牛340個氨基酸(55.74%)形成無規(guī)則卷曲、125個氨基酸(20.49%)形成α螺旋、119個氨基酸(19.51%)形成延伸鏈和26個氨基酸(4.26%)形成β轉(zhuǎn)角(圖3A)；通過SWISS-MODEL預(yù)測到犏牛ESCO2蛋白分子三級結(jié)構(gòu)(圖3B)。采用STRING數(shù)據(jù)庫分析犏牛ESCO2潛在相互作用蛋白顯示，ESCO2可能與SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白存在相互作用(圖3C)。GO分析顯示，ESCO2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)能夠參與姐妹染色單體凝聚、減數(shù)分裂細胞周期、DNA修復(fù)、細胞分裂和染色體重構(gòu)等生物學(xué)過程。

A.犏牛ESCO2蛋白二級結(jié)構(gòu)；B.犏牛ESCO2蛋白三級結(jié)構(gòu)；C.犏牛ESCO2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 犏牛ESCO2基因的組織表達譜

以β-actin作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)檢測ESCO2基因在犏牛肌肉、脂肪、睪丸、附睪、心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃組織中的相對表達水平(圖4)。結(jié)果顯示，犏牛ESCO2 mRNA在各個組織中均有表達，其中睪丸組織表達最高，顯著高于其他組織(P<0.05)。

不同的字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.5 不同發(fā)育時期睪丸中ESCO2基因的表達

以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測犏牛和牦牛胎牛時期、幼年時期和成年時期睪丸中ESCO2基因的相對表達水平(圖5)。結(jié)果顯示，ESCO2 mRNA的表達在犏牛和牦牛不同發(fā)育時期睪丸中均呈上升趨勢；5～6月齡犏胎牛睪丸中的表達量低于牦胎牛，差異不顯著(P>0.05)，但1～2歲和3～4歲犏牛睪丸中ESCO2 mRNA的表達量顯著低于同時期牦牛(P<0.05)。

圖5 ESCO2 mRNA在不同發(fā)育階段牦牛和犏牛睪丸中的表達規(guī)律

2.6 犏牛及牦牛ESCO2蛋白的細胞定位

免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測ESCO2在犏牛和牦牛不同年齡階段睪丸組織中的定位和表達(圖6)，其中細胞著色為棕黃色或者黃色判定為陽性信號，顏色越深說明蛋白表達水平越高。結(jié)果顯示，ESCO2蛋白在犏牛各年齡段睪丸組織中均有表達。其中胎牛睪丸組織中，ESCO2蛋白主要定位于支持細胞(SC)，在精原干細胞(SSC)幾乎不表達，與同時期牦牛一致；幼年和成年時期犏牛睪丸組織中，生精小管發(fā)育不良，管徑小且管壁皺縮，無次級精母細胞(SS)和精子細胞，在支持細胞、精原細胞(SP)和間質(zhì)細胞(IC)檢測到ESCO2蛋白陽性信號，與同時期牦牛相比，犏牛初級精母細胞(PS)數(shù)量少且細胞核皺縮，無ESCO2蛋白陽性信號。

SP.精原細胞; PS.初級精母細胞; SS.次級精母細胞; SC.支持細胞; IC.間質(zhì)細胞; MC.肌樣細胞; RS.圓形精子細胞; ES.長形精子細胞

3 討 論

在哺乳動物精子發(fā)生過程中，蛋白質(zhì)的乙?；苷{(diào)控減數(shù)分裂，其異常會導(dǎo)致雄性生殖力下降[20]。其中ESCO2是一種非組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，能調(diào)節(jié)減數(shù)分裂過程中姐妹染色單體的分離，是哺乳動物配子發(fā)生所必須的[21-23]。因此，探索ESCO2 在睪丸中的表達規(guī)律對于解析犏牛雄性不育機制具有重要的研究價值。

本研究克隆獲得犏牛和牦牛ESCO2完整CDS區(qū)序列，并對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測和分析。對犏牛和牦牛ESCO2編碼區(qū)序列進行對比，發(fā)現(xiàn)犏牛增加了57個堿基并有3處錯義突變。基因的錯義突變能夠改變多肽鏈的氨基酸種類從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變并造成疾病，如白化病、鐮刀型貧血病和早衰癥等[24-26]，ESCO2基因的突變在人當中能夠造成羅伯茨綜合征[27]，而犏牛與牦牛ESCO2蛋白的差異是否改變蛋白功能有待進一步研究。鑒于ESCO2蛋白主要通過與相應(yīng)蛋白結(jié)合發(fā)生作用，本研究進一步分析犏牛ESCO2的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)與SMC3、SMC1A、PDS5A等10個蛋白存在相互作用。其中，SMC1A、SMC1B、SMC3、RAD21和STAG2是黏連蛋白復(fù)合體的組成亞基，有研究表明，ESCO2能夠介導(dǎo)SMC3的去乙酰化[6]，黏連蛋白復(fù)合體具有細胞分裂過程中凝聚姐妹染色單體的作用，姐妹染色單體內(nèi)聚力的過早喪失會導(dǎo)致染色體的錯誤分離[28-29]。Al-Jomah等[30]的研究表明，PDS5A和PDS5B是一種富含HEAT重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，可與黏附素結(jié)合并介導(dǎo)姐妹染色單體黏附，PDS5與WAPL直接相互作用，在有絲分裂過程中去除黏附素，它們的丟失會導(dǎo)致DNA損傷。精母細胞和卵母細胞中NIPBL與黏連蛋白復(fù)合體有相同的定位，人NIPBL基因的突變能夠?qū)е碌吕薀峋C合征[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，犏牛與牦牛ESCO2基因和編碼蛋白存在差異，并對其結(jié)構(gòu)和互作蛋白進行了預(yù)測，這些與犏牛ESCO2互作的潛在蛋白均在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂中扮演不同的角色，這對于下一步解析ESCO2在雄性犏牛不育中的分子機制提供了新的見解和思路。

組織表達譜分析顯示，ESCO2 mRNA在各組織中均有表達，其中睪丸、脾、大腸、小腸和胃中表達較高。該結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，已報道ESCO2在人睪丸、骨髓、各級消化道組織中表達較高，在褐家鼠睪丸、脾和胸腺中具有較高的表達量[33-34]。Chen等[35]研究揭示，ESCO2能夠抑制細胞增殖并誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，在大腸癌中亦可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[36]，而ESCO2在犏牛和人各消化道組織中高表達，推測能夠維持消化道細胞的正常功能，其具體作用機制有待進一步研究。ESCO2在人、褐家鼠、犏牛等物種睪丸中高表達，因此推測其在雄性生殖中發(fā)揮了重要作用。

本試驗發(fā)現(xiàn)，ESCO2在犏牛睪丸中的表達量隨著生殖發(fā)育呈上升趨勢，在各年齡階段犏牛睪丸中ESCO2的表達量均低于牦牛。有研究報道，在小鼠卵巢和睪丸中特異性敲除ESCO2能夠造成生殖力下降[14, 19]，在低生殖力動物的性腺中ESCO2也表現(xiàn)出低表達[15]，因此推測，雄性犏牛ESCO2的低表達也能造成生殖力的下降。為進一步探討ESCO2在睪丸中發(fā)揮的功能，利用IHC染色對比分析ESCO2 在犏牛和牦牛睪丸中的細胞定位和表達水平，觀察到雄性犏牛減數(shù)分裂阻滯于初級精母細胞，生精小管內(nèi)只能觀察到支持細胞、精原細胞和少量初級精母細胞，這與前人報道一致[2, 37-39]。Evans等[16]的研究表明，ESCO2蛋白定位于減數(shù)分裂Ⅰ期精母細胞染色體上，本試驗在牦牛初級精母細胞檢測到陽性信號，但犏牛初級精母細胞上未檢測到表達和定位，可能ESCO2在犏牛初級精母細胞上的缺失是造成減數(shù)分裂阻滯的原因之一。此外，在精原細胞、次級精母細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞中也檢測到ESCO2蛋白定位，推測ESCO2在雄性生殖中還發(fā)揮了多種生物學(xué)功能。山羊精原干細胞中過表達ESCO2基因能夠促進細胞進入減數(shù)分裂[40]，而犏牛精原細胞上ESCO2蛋白陽性信號也弱于牦牛，提示ESCO2蛋白在犏牛精原細胞上的低表達可能導(dǎo)致初級精母細胞減少。綜上推測，ESCO2是精子發(fā)生中重要的功能基因，而犏牛睪丸中的低表達可能是導(dǎo)致減數(shù)分裂阻滯的原因之一。

4 結(jié) 論

本試驗成功獲得了犏牛和牦牛的ESCO2基因序列，發(fā)現(xiàn)ESCO2基因在睪丸組織中表達最高，其在成年期睪丸中的表達量高于幼年期和胎牛期，犏牛睪丸組織中ESCO2 mRNA表達水平顯著低于同時期牦牛，該蛋白在犏牛和牦牛睪丸組織中存在差異定位，表明ESCO2基因與雄性生殖相關(guān)。本研究為進一步探討犏牛雄性不育的機制和ESCO2基因在雄性生殖系統(tǒng)中的調(diào)控機制提供了試驗依據(jù)。