基于Label-free技術比較馬和驢血清蛋白質組分差異

張鏻兮，韓雨薇，李 政，廖清超，湯 馳，鄧 亮

(沈陽農業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院，沈陽 110866)

馬和驢雖同屬于馬屬動物，但遺傳特征、生理和行為特點等多方面存在差異。血液是動物機體的一種重要體液，研究顯示，馬與驢的血紅蛋白結構和凝血類型均有所區(qū)別[1-3]。驢的紅細胞數(shù)、紅細胞壓積和血清總膽紅素水平顯著比馬的低，而驢的平均紅細胞體積和血清甘油三酯水平顯著高于馬[4-5]。馬和驢的血清/血漿中含有約7%的蛋白質[6]，這些蛋白質來源于機體的各種細胞和組織，發(fā)揮著維持血液的正常滲透壓、黏度和酸堿度以及免疫調節(jié)等重要功能，能夠直接反映機體的生理和病理狀態(tài)。

蛋白質組學技術是近年來生命科學領域興起的重要研究手段之一，利用該技術可以對血清/血漿蛋白質組成特征進行詳細分析，能夠有效推動新的蛋白質生物標記物的發(fā)現(xiàn)，利于提高疾病臨床診斷效率[7]。蛋白質組學技術已在馬屬動物的血清/血漿蛋白質組研究中取得一定進展。以往研究利用雙向凝膠電泳結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)方法建立了馬血清蛋白質圖譜[8-9]，評估了馬耐力運動前后血漿蛋白質的特征變化[10]。Han等[11]使用Label-free定量蛋白質組學方法揭示了健康驢血清蛋白質組成特征，但關于馬和驢血清蛋白質組成的精確特征差異仍不清楚。

本研究應用Label-free定量蛋白質組學技術對馬和驢血清蛋白質組成差異進行詳細比較分析，旨在探究馬屬動物血清蛋白質生物學特征，為進一步揭示馬屬動物種間生理特征差異和有效保障健康提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗在遼寧省大連市某集約化養(yǎng)殖場，根據體況評分與獸醫(yī)檢查記錄，選擇9匹蒙古馬和9頭 遼西驢[12]，雌性，年齡4～10歲，均處于正常發(fā)情周期的間情期，健康無病、精神狀態(tài)及采食狀況良好。馬和驢分別提供相同的飼養(yǎng)條件，日糧由玉米秸稈、谷草、玉米、麩皮、豆粕、礦物質、維生素和水組成，每日分3次飼喂。血液樣品在上午9:00—10:00點采集，每個個體采集1次。采用頸靜脈采血方式，使用10 mL無抗凝劑真空管(BD Vacutainer，美國)收集血液。在4 ℃以3 000×g離心10 min以分離血清，無黃疸、溶血、脂血現(xiàn)象發(fā)生，血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

裂解液、SDS(十二烷基硫酸鈉)、DTT(二硫蘇糖醇)、Tris-HCl(三氨基甲烷鹽酸鹽)、蛋白酶抑制劑、碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸、乙腈、氨水、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UA)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)。

1.3 血清蛋白質提取

為了避免個體差異對試驗結果的影響，將馬和驢的各9份血清樣品分別隨機分成3組，每組內的3份血清樣品均勻混合成1個生物學重復，從而馬和驢各獲得3個生物學重復的血清樣品(馬為H1、H2、H3，驢為D1、D2、D3)。

每個血清樣品中加入1 mL裂解液(4% SDS，100 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1Tris-HCl)裂解，對應加入1%體積蛋白酶抑制劑，混勻。4 ℃下2 000×g·min-1離心40 min，取上清液。使用BCA法進行蛋白質濃度定量，-80 ℃保存。

1.4 血清蛋白質酶解

每個樣品各取300 μg，加入終濃度為100 mmol·L-1DTT，沸水浴5 min，冷卻至室溫后迅速加入200 μL UA緩沖液混勻，轉入10 ku 超濾離心管中，12 000×g 離心15 min，棄濾液，再按相同條件重復離心并過濾一次。加入100 μL 50 mmol·L-1的IAA緩沖液，600×g振蕩1 min，室溫避光孵育30 min，12 000×g離心 10 min。加入100 μL UA緩沖液，12 000×g 離心10 min，重復離心兩次。加入100 μL NH4HCO3緩沖液，1 400×g 離心10 min，重復離心兩次。加入40 μL胰蛋白酶緩沖液(胰蛋白酶：NH4HCO3緩沖液=3 μg: 20 μL)，600×g振蕩1 min，37 ℃孵育16～18 h。換新收集管，12 000×g離心 10 min，收集濾液，加入適量0.1% TFA，酶解后的肽段使用C18 小柱脫鹽，真空凍干。酶解后的肽段干燥后用0.1%甲酸溶液復溶，肽段濃度測定，以備液相色譜-串聯(lián)質譜分析。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質譜分析血清蛋白質組分

酶解產物采用納升流速Easy nLC 1 200色譜系統(tǒng)進行分離。A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。每個樣品由自動進樣器上樣到捕集柱C18 trap column(100 μm×20 mm×5 μm)，再經過分析柱C18 column(75 μm×150 mm×3 μm)分離，色譜柱以95%的A液平衡，流速為300 nL·min-1。相關液相梯度：前2 min，B液線性梯度從5%到8%；90 min，B液線性梯度從8%到23%；100 min，B液線性梯度從23%到40%；108 min，B液線性梯度從40%到100%；最后12 min，B液維持在100%。酶解產物經毛細管高效液相色譜分離后，Q-Exactive Plus質譜儀(Thermo Scientific)進行質譜分析。過柱時長120 min，離子化后均帶一個單位正電荷；母離子掃描范圍：300～1 800 m·z-1。

1.6 血清蛋白質序列數(shù)據庫檢索與鑒定

使用Max Quant 1.6.0.16軟件對所得質譜數(shù)據進行分析，先對質譜數(shù)據進行從頭測序計算，然后再進行數(shù)據庫搜索。參數(shù)設置：酶解蛋白為胰蛋白酶；固定修飾選擇烷基化修飾，可變修飾為氧化修飾和乙?；揎棧荒鸽x子質量數(shù)最大容許誤差范圍為±20.0 ppm；數(shù)據庫為Uniprot，物種為Equuscaballus(馬)和Equusasinus(驢)；FDR值<1%，并至少含有1個以上肽段的蛋白質為成功鑒定蛋白質。

1.7 血清差異蛋白質篩選及功能分析

應用R語言等生物信息學分析軟件對馬和驢血清中的差異蛋白質進行篩選。當差異倍數(shù)達到1.5倍及以上(即上調≥1.5倍和下調≤0.66倍)，且經過顯著性統(tǒng)計檢驗其P值≤0.05時，才認定為顯著差異表達蛋白質。通過Perseus[13]軟件對顯著差異表達蛋白質進行GO(gene ontology)功能富集分析。利用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)pathway數(shù)據庫進行差異表達蛋白質信號通路富集分析。STRING(http://string-db.org)數(shù)據庫進行蛋白質互作分析。

2 結 果

2.1 馬和驢血清蛋白質濃度測定

通過BCA法結合酶標儀測定樣品吸光值，并計算出血清樣品蛋白質濃度。馬的血清樣品中H1蛋白質濃度最高，為12.49 μg·μL-1，H3蛋白質濃度最低，為11.54 μg·μL-1；驢的血清樣品中D2蛋白質濃度最高，為14.19 μg·μL-1，D3蛋白質濃度最低，為12.30 μg·μL-1，如表1所示。

表1 馬和驢血清樣品蛋白質濃度

2.2 馬和驢血清蛋白質鑒定

馬和驢的血清中共鑒定出361種蛋白質，其中馬的血清中鑒定出288種蛋白質，分子量范圍為1.52～511.24 ku；驢的血清中鑒定出244種蛋白質，分子量范圍為1.53～611.47 ku；馬和驢血清中鑒定出的相同蛋白質有171種。在鑒定出的361種蛋白質中，有121種蛋白質的分子量范圍為10～30 ku，96種為30～50 ku，55種為50～70 ku，40種為70～100 ku，33種大于100 ku以及16種小于10 ku(圖1)。

圖1 鑒定出的血清蛋白質分子量分布

2.3 馬和驢血清差異表達蛋白質

對鑒定出的蛋白質進行差異表達分析，共獲得231種顯著差異表達蛋白質(fold change≥1.5,P≤0.05)，驢比馬上調的血清蛋白質有99種，驢比馬下調的血清蛋白質有132種。231種顯著差異表達蛋白質中，109種蛋白質僅在馬血清中特異表達，69種 蛋白質僅在驢血清中特異表達。

2.4 馬和驢血清差異表達蛋白質的生物信息學分析

2.4.1 GO功能分析 GO對基因功能進行分類，共涵蓋3個基因本體，分別為生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。差異表達蛋白質共涉及到的生物學過程如圖2所示。差異表達蛋白質主要參與的生物學過程包括蛋白質激活(protein activation cascade)、補體激活(complement activation)、免疫應答(immune response)、凝血(blood coagulation)以及脂蛋白氧化調控(regulation of lipoprotein oxidation)等過程；細胞組分方面，差異表達蛋白質主要定位于胞外區(qū)域(extracellular region)、胞外區(qū)域部分(extracellular region part)、細胞外泌體(extracellular exosome)、胞外囊泡(extracellular vesicle)和胞外細胞器(extracellular organelle)等；差異表達蛋白質的分子功能有糖蛋白結合(glycoprotein binding)、細胞外結合基質蛋白(extracellular matrix binding)、poly—A-RNA結合(poly(A)RNA binding)、MHCⅡ類蛋白復合體結合(MHC class II protein complex binding)、糖胺聚糖結合(glycosaminoglycan binding)、肽聚糖結合(peptidoglycan binding)和果糖結合(fructose binding)等。

圖2 血清差異表達蛋白質的GO功能富集分析

2.4.2 KEGG通路分析 利用KEGG數(shù)據庫進行通路分析表明，差異表達蛋白質共涉及到14條通路，根據顯著差異P值排序前10條通路見圖3。富集最顯著的通路為補體和凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)，吞噬體(phagosome)，內質網蛋白質加工(protein processing in endoplasmic reticulum)，抗原加工遞呈(antigen processing and presentation)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝(glycine, serine and threonine metabolism)，癌癥蛋白多糖(proteoglycans in cancer)等。

圖3 血清差異表達蛋白質的KEGG通路富集分析

2.5 馬和驢血清差異表達蛋白質互作分析

利用STRING軟件對鑒定出的231種血清差異表達蛋白質進行蛋白質互作網絡分析，結果如圖4所示?；プ骶W絡被用來表示差異表達蛋白質之間的生物交聯(lián)，球形代表輸入的差異蛋白質，蛋白質間的關聯(lián)用線形表示，連線越多，代表該蛋白質處于相對重要的位置或該蛋白質的研究相對較多。血清差異表達蛋白質緊密相連富集最為顯著的功能模塊主要為代謝途徑、補體和凝血級聯(lián)、吞噬體，且這3個模塊與KEGG注釋結果重疊，表明馬和驢在其功能上的差異。大部分蛋白質至少與其中一個蛋白質存在相互作用，HSP90AA1、HSPA8、APOD、APOM、SERPING1、MASP1、CALR、TUBA1B、TUBB等處在關系互作網的重要節(jié)點。

圖4 血清差異表達蛋白質互作網絡

3 討 論

本研究應用Label-free定量蛋白質組學技術比較了馬和驢血清蛋白質組成特征差異，共鑒定出231種差異表達蛋白質，為今后深入研究馬屬動物種間生理特征差異提供了一定理論基礎。前期研究應用雙向凝膠電泳結合MALDI-TOF MS等方法，表明馬的不同品種之間[14]、馬屬動物不同物種之間的血清蛋白質組分具有不同特征。馬和驢雜交形成的馬騾，血清蛋白質組成特征更接近于驢[15]。Label-free 定量蛋白質組學技術，即光譜計數(shù)，根據二級質譜相關的每個蛋白質鑒定到的肽段總次數(shù)和所鑒定肽段的離子價位等信息進行定量分析，是一種相對更為精確的高通量蛋白質組分定量分析方法[16]。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類在哺乳動物中廣泛存在的內源性保護蛋白質，該蛋白質家族在引導新生蛋白質的初始折疊和部分變性結構的重折疊中發(fā)揮關鍵作用，能夠保護細胞免受應激損害[17-18]。HSP90和HSPA是熱休克蛋白家族中兩個高度保守的依賴ATP的分子伴侶，在遇到外界不利因素刺激和環(huán)境變化時主要通過促進蛋白質的合成和改變其空間結構來保護機體，直接或間接參與腫瘤的發(fā)生、免疫系統(tǒng)功能的調節(jié)、傷口愈合、細胞分化和轉運、生殖細胞活性調節(jié)等過程[19]。本研究結果顯示，HSP90和HSPA8僅在馬血清中特異性表達，且這兩個蛋白質顯著富集在內質網蛋白質加工和抗原加工遞呈等通路中，揭示驢對外界環(huán)境的刺激反應可能沒有馬強烈。事實上，與馬相比，驢對疼痛的反應和疾病臨床癥狀表現(xiàn)相對不明顯[20]，因此生產中更應注重對驢的健康管理。

脂蛋白(lipocalin)超家族是一類可以結合和運輸各種外源性和內源性配體的蛋白質。其中，載脂蛋白D(apolipoprotein D, APOD)是一種糖基化蛋白質，作為高密度脂蛋白的組成部分與脂質代謝和神經保護密切相關。APOD主要參與脂質運輸、食物攝取、炎癥、抗氧化反應和發(fā)育以及在不同類型癌癥中發(fā)揮作用[21-23]。載脂蛋白M(apolipoprotein M，APOM)是一種新型的抗動脈粥樣硬化蛋白質，主要存在于高密度脂蛋白(HDL)和微量低密度脂蛋白(LDL)中。研究表明，載脂蛋白通過逆轉膽固醇轉運在HDL代謝中發(fā)揮重要作用，對LDL氧化和動脈粥樣硬化具有保護作用[24-25]。APOM還與高脂血癥有關[26]。研究發(fā)現(xiàn)，驢的血脂異常比馬更為常見[27]。本研究結果表明APOD和APOM在驢血清中的表達量顯著高于馬，且主要參與脂蛋白氧化調控以及免疫系統(tǒng)反應等生物學過程，可能與驢比馬更易患高血脂癥有關，因此生產中更應注意驢對脂類物質的代謝調控與管理。

甘露聚糖結合凝集素絲氨酸肽酶1(mannan-binding lectin serine peptidase 1, MASP1)是補體系統(tǒng)中的核心蛋白酶之一，是凝集素途徑激活所必需的。據報道，MASP1可以增加促炎細胞因子(如IL-6和IL-8)的產生，并誘導趨化作用，從而促進中性粒細胞的功能。補體凝集素與中性粒細胞通過內皮細胞的協(xié)同作用可能是增強抗微生物免疫應答的有效途徑。MASP1可能也參與了百日咳等疾病過程[28]。絲氨酸G家族成員1(serpin family G member 1, SERPING1)是一種蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶家族，其中心功能是通過抑制其亞成分C1R和C1S的蛋白水解活性來調節(jié)C1，從而對補體級聯(lián)有下游效應。功能失調的SERPING1阻止了C1補體系統(tǒng)的自動激活，并減弱了纖溶酶、激肽釋放酶和凝血因子XIIa、XIIf和XIa等酶類的產生[29]。本研究結果顯示，MASP1和SERPING1顯著富集在補體和凝血級聯(lián)通路中，兩者在驢血清中的表達水平顯著高于馬，表明驢可能具有更強的免疫耐受機能。

鈣網蛋白(calreticulin, CALR)是一種多功能蛋白質，主要定位于內質網，參與內質網糖蛋白折疊和鈣穩(wěn)態(tài)，以及細胞增殖、吞噬和凋亡等功能[30]。微管蛋白(tubulin)是構成微管的結構單元，是細胞骨架的主要成分，對細胞內運輸、染色體分離和細胞遷移等許多細胞過程發(fā)揮重要作用[31]。微管蛋白包括α-、β-、γ-、δ-和ε-共5種不同形式的成員。微管蛋白α1b(tubulin alpha-1D chain, TUBA1B)，也稱為K-ALPHA-1，是一種蛋白質編碼基因[32]。I級微管蛋白(tubulin beta class I, TUBB)是β-微管蛋白編碼基因之一，在發(fā)育中的中樞神經系統(tǒng)和皮膚中廣泛表達[33]。本研究結果顯示，CALR廣泛富集于吞噬體、抗原加工遞呈和內質網蛋白質加工通路中，TUBA1B和TUBB在吞噬體通路中顯著富集。這幾種差異表達蛋白質都在馬血清中特異表達，推測這可能與馬和驢免疫調節(jié)差異有關。

4 結 論

本研究應用 Label-free定量蛋白質組學技術，分析比較了馬和驢血清蛋白質組分差異。從馬和驢血清中共鑒定出231種差異表達蛋白質，驢比馬上調的血清蛋白質有99種，驢比馬下調的血清蛋白質有132種。這些差異表達蛋白質具有明顯的相互作用，主要參與了補體和凝血級聯(lián)過程，并參與多種生物學途徑，表明馬和驢在生理條件下的血清蛋白質組成特征存在一定差異。綜上所述，本試驗結果為研究馬和驢的血清蛋白質組學特征提供了新的視角。該研究為進一步揭示馬屬動物種間生理特征差異和有效保障其健康提供數(shù)據支撐。