雪山草雞血管緊張素轉換酶2(ACE2)基因克隆、結構特性分析及其表達特征研究

陳清貽，從光雷，肖蘊祺，施壽榮*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，揚州 225125)

血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是一種發(fā)現(xiàn)于2000年的糖蛋白，它由信號肽、跨膜結構域及HEXXH鋅結合域3部分組成[1]。ACE2可有效地將血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)降解為血管緊張素1-7(Ang1-7)，發(fā)揮其舒張血管及抗增殖作用。Ang(1-7)通過與Mas受體結合，發(fā)揮血管擴張和抗細胞增殖等作用[2-6]。因此研究ACE2蛋白的病理學作用對于治療糖尿病、高血壓等疾病具有重要意義[7]，同時它還能作為一種生物標記物，在心血管疾病建立之前預測心血管風險[8]。ACE2廣泛存在于心、血管、腸道、肺(尤其是2型肺細胞和巨噬細胞)、腎、睪丸和腦[9-10]。ACE2受體能夠介導SARS-CoV、NL63和SARS-CoV-2三種冠狀病毒進入細胞[11]，測序發(fā)現(xiàn)，2019年新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)也是一種SARS-CoV[12]，因此ACE2也被認為是COVID-19的受體之一。經(jīng)溯源研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19可能已經(jīng)在蝙蝠中傳播了數(shù)十年[13]，并且在向人類傳播的過程中存在中間宿主，因此研究多種動物ACE2的差異對于疾病的傳播與控制而言十分重要。

目前對于ACE2基因的研究大多數(shù)都集中于嚙齒類動物和哺乳動物[14-15]，在禽類中也主要集中于水禽和國外白羽肉雞品系[16-17]，已經(jīng)通過多種技術手段對ACE2蛋白功能進行了研究[18-21]。對我國黃羽肉雞ACE2基因的研究還未見有報道。本試驗以中國黃羽肉雞的代表雪山草雞作為研究對象，采用分子生物學手段獲得雪山草雞ACE2基因編碼區(qū)序列，利用生物信息學方法對雪山草雞的ACE2基因序列進行分析，用絕對定量的方法對雪山草雞ACE2基因組織表達規(guī)律進行研究。旨在了解雪山草雞ACE2基因結構及表達特性，為后續(xù)研究ACE2基因在腸道組織中的功能奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院家禽科學研究所邵伯試驗基地進行。試驗選取體重相近的雪山草雞300只，公母各半。整個試驗期間，所有雞只自由飲水，常規(guī)光照和免疫。在45和90日齡時，公、母分別隨機選取6只屠宰，無菌采集心、肺、肝、氣管、膽囊(去除膽汁)、腎、十二指腸、盲腸、法氏囊、胸腺、空腸和回腸組織，PBS清洗后，快速放入2 mL進口無菌RNase-free EP管，置于液氮中速凍后，在-80 ℃保存用于組織基因表達研究。

1.2 主要儀器與試劑

TRIzol Reagent、反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit購自德國Qiagen公司；dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL5000、PCR切膠回收試劑盒、pMD19-T載體均購自大連寶生物TaKaRa公司；E.coliDH5α菌株由本實驗室保存。

超微量分光光度計購自美國Thermo公司；電泳槽購自中國北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank上公布的紅色原雞(Gallusgallus)ACE2基因的mRNA序列(登錄號：XM-416822.5)，使用Primer 5.0軟件設計引物。設計了ACE2基因CDS區(qū)克隆引物和熒光定量引物。具體的引物序列如表1所示。

表1 用于克隆及定量的引物序列

1.4 總RNA的提取與cDNA合成

采用TRIzol法提取各組織總RNA，加入DNase 1去除可能存在的基因組DNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.1，說明RNA純度較好；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見清晰28S、18S和5S rRNA條帶，且28S亮度約為18S亮度的兩倍，說明RNA未降解，可用于后續(xù)試驗。按照反轉錄試劑盒說明書，配置如下20.0 μL逆轉錄反應體系：2.0 μL的10×RT Buffer，0.8 μL的25× DNTP Mix(100 mmol·L-1)，2.0 μL的10× RT Random Primers，1.0 μL的MultiscribeTMReverse Transcriptase，4.2 μL的DEPC H2O，總RNA10.0 μL(100 ng·μL-1)。震蕩混勻后離心上述反應體系，置于普通PCR儀進行逆轉錄，反應條件為25 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min；4 ℃保存。

1.5 雪山草雞ACE2基因CDS區(qū)克隆

以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR反應，RT-PCR擴增雞ACE2基因CDS區(qū)，反應總體系為50 μL：cDNA模板2.0 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各自1.0 μL，Platinum?PCR SuperMix, High Fidelity 45.0 μL，ddH2O到1 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，38個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；最后4 ℃保存。PCR結束后，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，對PCR產(chǎn)物的特異性條帶切膠回收后，連接pGM-T載體，轉化高效化學感受態(tài)細胞DH5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

1.6 雪山草雞ACE2基因生物信息學分析

從NCBI網(wǎng)站中搜索并下載數(shù)據(jù)庫中常見動物的ACE2基因序列，使用dnastar軟件進行序列的整理編輯分析。利用UCSC基因組瀏覽器和NCBI基因組數(shù)據(jù)庫分析雞ACE2基因結構及定位。選擇常見的代表性物種，使用EMBL的多序列比對工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa)Clustal Omega 進行多序列比對及同源性分析。利用MEGA 10.0軟件(https://www.megasoftware.net/)采用基于距離參數(shù)的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)，自展分析Bootstrap 1 000次，構建常見脊椎動物ACE2基因的系統(tǒng)進化樹。使用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析；使用NetPhos 2.0 Server進行磷酸化位點預測。利用PSIPRED在線軟件(http://www.bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對ACE2蛋白進行二級結構分析。

1.7 雪山草雞ACE2基因組織表達分析

以cDNA為模板，按照QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(Qiagen公司，德國)說明書，配置反應體系：避光混合離心上述反應體系，進行實時熒光定量PCR反應。RT-qPCR反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。該反應在實時熒光定量PCR 儀中進行，每個試驗數(shù)據(jù)做3次 技術重復。利用Nano Drop 2000超微量分光光度計測定標準品濃度，根據(jù)如下公示計算其拷貝數(shù)，測定其拷貝數(shù)1.33×1010個·μL-1。將標準品進行10倍稀釋：濃度1.33×109、1.33×108、1.33×107、1.33×106、1.33×105、1.33×104個·μL-1和空白對照，以其為模板進行RT-qPCR測定，建立標準曲線，用絕對定量的方法來測定各組織中ACE2基因的表達變化。

1.8 統(tǒng)計與分析

結果采用絕對定量計算方法，使用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗分析，P<0.05為顯著性差異，P>0.05為差異不顯著。

2 結 果

2.1 雪山草雞ACE2基因克隆

對雪山草雞ACE2基因CDS區(qū)序列設計引物進行PCR，對產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，獲得了約2.5 kb的序列，進行測序分析后發(fā)現(xiàn)序列長度為2 427 bp，經(jīng)過比對分析，確認為雪山草雞ACE2基因序列。ACE2基因共編碼808個氨基酸殘基，位于1號染色體，有18個外顯子，17個內(nèi)含子。經(jīng)過與白羽肉雞ACE2基因進行比對后發(fā)現(xiàn)，二者序列長度均為2 427 bp。但是在黃羽肉雞序列中存在大量突變位點，其中127、146、510、540、575、1 180、2 048和2 165位的突變均使得編碼的氨基酸發(fā)生了變化。

圖1 雪山草雞ACE2克隆電泳圖

2.2 雪山草雞ACE2基因的生物信息學分析

2.2.1 雪山草雞ACE2基因序列理化性質(zhì)及同源性分析 通過NCBI在線網(wǎng)站對雪山草雞ACE2基因與其他物種的ACE2基因核苷酸序列進行理化性質(zhì)及同源性分析，發(fā)現(xiàn)雪山草雞的ACE2基因序列中含有丙氨酸(29.2%)、半胱氨酸(21.7%)、甘氨酸(25.1%)和蘇氨酸(23.9%)4種氨基酸，其分子式為C7 252H12 079N2427O3 009S527，分子量大小為180 ku。同源性分析結果見表2，與家禽的同源性要高于哺乳動物，與紅色原雞的同源性最高為99%，其次與綠頭鴨為88%，與哺乳動物的同源性為73%～76%，其中與人的同源性為76%。對常見物種的ACE2氨基酸序列構建分支進化樹，結果如圖2所示，雪山草雞先與紅色原雞聚為一支，然后再與其他禽類聚為一支，最后與哺乳動物聚為一支，這與同源性分析結果一致。

圖2 雪山草雞與不同物種ACE2分子進化樹

表2 雪山草雞ACE2基因同源性分析結果

2.2.2 雪山草雞ACE2蛋白二級結構及多參數(shù)分析 利用PSIPRED在線軟件對雪山草雞ACE2蛋白的二級結構進行預測，結果如圖3所示，該片段有452處α螺旋(56.01%)，20處β折疊(2.48%)。較多的α螺旋可以維持蛋白質(zhì)的剛性結構，使得ACE2蛋白更好地與冠狀病毒S糖蛋白的S1亞基內(nèi)的受體結合結構域CTD1結合。

圖3 雪山草雞ACE2蛋白二級結構分析

2.2.3 雪山草雞ACE 2蛋白信號肽分析 結果如圖4所示，圖框處OTHER值最大為0.946 8，SP值其次，CS值最高峰在第17～18氨基酸之間存在潛在的裂解位點。該蛋白此處D值為0.594 1，是分泌性蛋白，信號肽區(qū)域在第1～17氨基酸之間。

圖上有3種可能性概率，SP(Sec/SPI)，CS(裂解位點)和OTHER(序列沒有任何類型的信號肽)

2.2.4 雪山草雞ACE2基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點分析 統(tǒng)計結果見圖5，顯示雪山草雞ACE2蛋白有46處磷酸化位點，其中19處絲氨酸磷酸化位點(41.30%)，12處蘇氨酸磷酸化位點(26.09%)和15處酪氨酸磷酸化位點(33.61%)。較多的磷酸化位點暗示，ACE2蛋白功能發(fā)揮過程中受到多種磷酸化修飾。

A.ACE2蛋白氨基酸序列;B.磷酸化位點預測結果。T、Y、S分別表示蘇氨酸、酪氨酸和絲氨酸磷酸化位點，點代表非磷酸化位點

2.3 雪山草雞ACE2基因組織表達分析

2.3.1ACE2基因在雪山草雞不同組織中表達變化 由表3可知，小腸(十二指腸、空腸和回腸)中ACE2表達量顯著高于其它組織(P<0.05)。法氏囊、氣管、膽囊和脾中ACE2表達量較低，脾中表達量最低。

表3 ACE2基因在不同組織中的表達量

2.3.2ACE2基因在雪山草雞不同性別間的表達變化 由表4可知，母雞空腸、盲腸、脾和肺中ACE2基因表達量顯著高于公雞(P<0.05)。公雞腎和心中ACE2基因表達量顯著高于母雞(P<0.05)。

表4 ACE2基因在不同性別間的表達量

2.3.3ACE2基因在雪山草雞不同日齡間的表達變化 由表5可知，90日齡雪山草雞的十二指腸、空腸、肺、脾和回腸組織ACE2基因表達量均顯著低于45日齡雪山草雞(P<0.05)，在法氏囊和腎組織中結果呈相反趨勢(P<0.05)。

表5 ACE2基因在不同日齡間的表達量

3 討 論

3.1 雪山草雞ACE2基因的克隆及生物信息學分析

ACE2是一種參與機體心血管體液調(diào)節(jié)的跨膜糖蛋白，其基因改變能夠誘導如高血壓、代謝及行為功能障礙等疾病的發(fā)生[22-24]。該基因編碼蛋白是SARS和HCoV-NL63等人類冠狀病毒S糖蛋白的功能受體。故而在2019年COVID-19爆發(fā)后，ACE2基因就備受關注。已知冠狀病毒最早于1937年從雞中分離出來，它引發(fā)了禽類中傳染性極高的禽傳染性支氣管炎[25]，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟損失，故而研究雞ACE2基因具有重要意義。ACE2全長片段最早在2000年被克隆和報道[4-5]，自此之后相繼在山羊和豬中成功克隆ACE2基因的序列，而在家禽中的報道相較甚少。

楊維維等[14]在山羊腎組織中克隆得到ACE2基因的全長片段(2 415 bp，GenBank登錄號：KF921008.1)，其共編碼氨基酸805個，生物信息學分析預測山羊ACE2的蛋白屬于I型跨膜蛋白，第1～18氨基酸之間是其信號肽區(qū)域。肖航[15]克隆了仔豬的ACE2全基因序列(2 418 bp)，編碼氨基酸805個。生物信息學分析預測仔豬ACE2蛋白也是Ⅰ型跨膜蛋白，第1～17氨基酸之間是其信號肽區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，雪山草雞ACE2基因共編碼808個氨基酸，比對后發(fā)現(xiàn)，雖然與白羽肉雞序列同樣編碼808個氨基酸，但是卻存在大量的突變位點，其中8個位點的突變可以導致編碼的氨基酸發(fā)生變化，序列結構決定了功能，這可能是黃羽肉雞和白羽肉雞在免疫以及抵抗病毒侵襲方面差異的原因之一，下一步應對突變在這一過程中的作用加以重點研究。ACE2屬于Ⅰ型跨膜蛋白，信號肽區(qū)域位于1～17氨基酸之間。另外，其與紅原雞同源性高達99%。通過對該蛋白二級結構預測，發(fā)現(xiàn)其α螺旋比率達56.01%，另外，有46個磷酸化位點，其中有19處絲氨酸磷酸化位點(41%)，12處蘇氨酸磷酸化位點(26%)和15處酪氨酸磷酸化位點(33%)。這些分析結果與前人研究其它物種的結果相一致[16-17]。ACE2由808個氨基酸組成，是具有單一胞外催化結構域的I型跨膜糖蛋白。像ACE一樣，ACE2有2個結構域:氨基末端催化結構域和羧基末端結構域。催化結構域有1個活性位點—鋅金屬肽酶結構域。ACE2首先在結構上保守，這決定了其功能的保守性，即作為受體與冠狀病毒外殼S糖蛋白受體結構域結合，傳遞信號。ACE2被鑒定為SARS冠狀病毒基本受體，而在SARS中，ACE2的下調(diào)在病毒感染后嚴重肺衰竭的發(fā)病機制中起著重要作用。ACE2在多個物種中表現(xiàn)出結構上的保守性，預示著其在物種間發(fā)揮功能可能依賴著某種共有的模式。

3.2 雪山草雞ACE2基因組織表達差異

ACE2是ACE的同源物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，ACE2基因在心、腎、睪丸等器官中均有表達[4-5]，另外在肺和肝等組織中也均有表達[26]。目前，已明確人體小腸(十二指腸、空腸和回腸)、腎、心和睪丸中呈現(xiàn)高表達，其中以回腸中表達量最高，而在免疫器官和神經(jīng)器官中表達量較低[27-28]。本試驗選取13個組織進行ACE2基因表達量的檢測，涵蓋了免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及循環(huán)系統(tǒng)。試驗結果發(fā)現(xiàn)，雪山草雞機體ACE2基因表達量最高的3個臟器依次為回腸、空腸和十二指腸；脾和法氏囊等器官表達量偏低。腸道等消化系統(tǒng)器官ACE2基因表達量高的結果與前人研究結果一致，王珊珊等[29]對仔豬體內(nèi)ACE2基因克隆的研究也指明ACE2基因表達與胃腸道發(fā)育有關。Wong等[30]也證實，小鼠小腸ACE2基因表達量最高，且主要在腸道上皮細胞中表達，具有轉運物質(zhì)的作用。PubMed數(shù)據(jù)庫中公布了研究人員對來自27個不同組織的95個人的組織樣本進行了RNA-seq分析，該分析結果表明，ACE2蛋白在小腸和十二指腸中高表達，而在肺部組織中有較低的表達水平[31]。但是尤其值得注意的是，ACE2是病毒進入宿主細胞的受體，生物進程是與宿主病毒相互作用。按照推測，ACE2應該與免疫性狀密切相關，應該在免疫組織器官中有明顯的變化，而目前的研究均表明，其在小腸中有較高的表達，這提示ACE2基因或與雪山草雞的胃腸道生長發(fā)育有較大相關性。已有的研究表明，ACE2并不與腎中的氨基酸轉運蛋白結合，而是與腸道中的氨基酸轉運蛋白結合，故而在腸道中ACE2表現(xiàn)出高度表達，氨基酸被吸收[32]。而ACE2的這一功能與其肽酶活性無關，其肽酶活性不是與氨基酸轉運蛋白配對所必需。

本試驗選取相同日齡的公雞與母雞，對13個組織進行ACE2基因表達檢測。結果發(fā)現(xiàn)，肺、心、腎、盲腸、脾和空腸組織中ACE2基因表達量具有性別特異性。Cai[33]在新冠肺炎的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性的患病率略高于女性，但是差異并不顯著。Zhao等[34]在全球范圍內(nèi)采集大量數(shù)據(jù)，但結果發(fā)現(xiàn)不同性別肺組織ACE2基因表達量差異不顯著。本試驗結果與上述研究結果并不一致，這可能是試驗對象或生理不同造成的。而雪山草雞在肺、心和腎等組織中的表達差異可能是生殖激素造成的，后續(xù)還需進一步研究。婁麗麗等[35]使用全轉錄組測序法研究發(fā)現(xiàn)，在不同日齡小鼠組織中ACE2基因表達存在動態(tài)變化，提示年齡與ACE2基因表達具有一定相關性。Chen等[36]使用綿羊作為研究RAS發(fā)育的動物模型，發(fā)現(xiàn)新生羊ACE2基因的表達顯著低于成年羊，提示成人ACE2基因表達水平可能高于兒童。Xie等[37]研究發(fā)現(xiàn)，老年人的ACE2基因表達量低于青年人。本試驗分別選取45與90日齡雪山草雞進行比對，除了十二指腸、空腸與腎差異顯著外，肺和脾表達量也有差異。90日齡雪山草雞中ACE2基因表達量明顯小于45日齡，說明ACE2基因表達確實會隨著日齡的增長而降低，這與前人研究結果相似[38]。

本試驗中觀察到ACE2基因在小腸中表達量高于其他組織，其原因可能在于ACE2在小腸中與氨基酸轉運蛋白結合，促進氨基酸在腸道中的吸收，與腸道的生長發(fā)育有著密切關系[1]；但是必須指出的是，作為與冠狀病毒的外殼S糖蛋白結合的受體蛋白，它又充當著為病毒入侵宿主提供信號轉導的角色。這意味著一旦家禽感染傳染性支氣管炎等冠狀病毒類的疾病，由于ACE2角色的特殊性，必定先在腸道組織中產(chǎn)生癥狀，在家禽糞便中也就必定會存在大載量的病毒(2019年人新冠肺炎疫情中已經(jīng)被證實[39-40])，由于雞舍的環(huán)境條件，通過糞-口傳播的風險也更加高。這提示我們，在家禽生產(chǎn)中防治家禽傳染性支氣管炎時，要注意切斷這一傳播途徑，從而減少損失。

4 結 論

本研究以雪山草雞為試驗素材，通過克隆獲得了雪山草雞ACE2基因編碼區(qū)序列全長；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，雪山草雞ACE2基因在家禽中較為保守，ACE2蛋白屬于分泌型蛋白；ACE2基因表達規(guī)律呈現(xiàn)出在雪山草雞腸道組織中高于其他組織，母雞中高于公雞，隨著時間表達水平下降的趨勢。研究結果為開展ACE2基因在黃羽肉雞腸道中的功能研究奠定了試驗基礎。