環(huán)境中重金屬暴露對(duì)抗生素抗性基因演變影響研究進(jìn)展

邱文婕， 秦艷， 高品

東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院

抗生素是一類廣譜殺菌藥物，可預(yù)防細(xì)菌感染疾病，被廣泛用于治療人體疾病和促進(jìn)動(dòng)植物生長[1]。由于缺乏正確而科學(xué)的抗生素使用規(guī)范，大量抗生素藥物及其代謝產(chǎn)物被排入環(huán)境中，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生選擇性壓力[2]，使敏感性細(xì)菌逐漸對(duì)其產(chǎn)生抵抗性，進(jìn)而促進(jìn)抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的演變和傳播[3-4]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)菌抗藥性會(huì)隨著抗生素脅迫作用的消失而消失[5-8]。然而事實(shí)并非如此，即使在不使用抗生素的情況下，ARGs仍可穩(wěn)定存在。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬[9-10]、殺菌劑[11]、消毒劑及其消毒副產(chǎn)物[12-13]、農(nóng)藥[14]、去污劑[15]、離子液體[16]、納米顆粒[17]等對(duì)ARGs的環(huán)境行為同樣具有顯著影響。此外，微塑料和大氣顆粒物等固相介質(zhì)吸附攜帶的無機(jī)和有機(jī)污染物也會(huì)對(duì)ARGs產(chǎn)生重要影響[18-22]。由此可見，ARGs在環(huán)境中的存在、演變和散播是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過程，近年來在全球范圍內(nèi)已受到廣泛關(guān)注。

作為環(huán)境中常見的污染物之一，重金屬具有不可生物降解性，能夠在環(huán)境中穩(wěn)定存在，對(duì)生物體具有持久性脅迫作用，可通過食物鏈傳遞進(jìn)行富集，對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害。重金屬可直接作用于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也可通過改變環(huán)境條件(如pH等)間接影響細(xì)菌，進(jìn)而產(chǎn)生毒性效應(yīng)[23-25]。重金屬長期選擇性作用能夠激發(fā)細(xì)菌的自我防御機(jī)制，使其逐漸產(chǎn)生抵抗性[26]。有研究報(bào)道[27-29]，從重金屬Cu污染土壤中分離出來的細(xì)菌對(duì)抗生素脅迫的抵抗性要比Cu敏感細(xì)菌更強(qiáng)，表明重金屬可能會(huì)通過共選擇作用使其對(duì)抗生素產(chǎn)生抵抗性?；诖?，筆者針對(duì)環(huán)境中重金屬對(duì)ARGs環(huán)境行為的影響過程研究現(xiàn)狀，概述了細(xì)菌對(duì)抗生素和重金屬的協(xié)同抗性機(jī)制，重點(diǎn)論述了重金屬對(duì)ARGs豐度變化和水平轉(zhuǎn)移過程的作用影響，并對(duì)未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 細(xì)菌對(duì)抗生素和重金屬的抗性機(jī)制

1.1 抗生素抗性機(jī)制

細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性機(jī)制主要包括細(xì)胞膜滲透性改變、外排泵機(jī)制、細(xì)胞靶位點(diǎn)改變等(圖1)。其中，生物膜的形成是細(xì)菌抵御抗生素作用的主要途徑[30]，其分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)可形成天然屏障，減弱抗生素分子向細(xì)菌體內(nèi)部滲透[31]。外排泵也稱外排蛋白，細(xì)菌可通過外排泵機(jī)制將抗生素等對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)排出體外，降低其對(duì)細(xì)胞的損害[32]。細(xì)胞靶位點(diǎn)改變是指抗生素分子與細(xì)菌細(xì)胞相互作用的靶位酶基因發(fā)生突變，降低彼此之間的親和力，導(dǎo)致抗生素作用失效[32]。

圖1 細(xì)菌細(xì)胞對(duì)抗生素脅迫作用的抵抗機(jī)制Fig.1 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of antibiotics

1.2 重金屬抗性機(jī)制

重金屬可在生物體內(nèi)積累，其毒性作用可通過食物鏈傳遞并放大[33-34]。在重金屬脅迫作用下，細(xì)菌可通過以下3種方式削弱其毒性影響[35-37]： 1)通過分泌的EPS與重金屬發(fā)生絡(luò)合作用和離子交換等過程，降低重金屬的生物可利用性。EPS可為細(xì)菌提供許多重要功能，如促進(jìn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)育，增強(qiáng)細(xì)菌黏附力，以及提供保護(hù)性屏障等[38]，生物膜對(duì)抗生素的抵抗性主要源于EPS的保護(hù)作用，提高細(xì)胞對(duì)抗生素的耐受性，EPS也可作為運(yùn)輸屏障抑制細(xì)胞質(zhì)?；駾NA跨膜轉(zhuǎn)移[39]。2)在細(xì)胞內(nèi)可通過氧化還原等作用使對(duì)細(xì)胞具有顯著毒性效應(yīng)的重金屬降低毒性。3)細(xì)胞可通過改變細(xì)胞膜的滲透性，減少重金屬進(jìn)入細(xì)胞，也可通過外排泵系統(tǒng)將重金屬排出體外[40]，其外排泵機(jī)制與抗生素外排泵機(jī)制類似，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將重金屬離子泵出細(xì)菌細(xì)胞(圖2)。

圖2 細(xì)菌細(xì)胞對(duì)重金屬脅迫作用的抵抗機(jī)制Fig.2 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of heavy metals

1.3 抗生素與重金屬共抗性機(jī)制

協(xié)同抗性機(jī)制與交叉抗性機(jī)制是細(xì)菌抵抗重金屬和抗生素作用的主要共抗性機(jī)制[40]。協(xié)同抗性機(jī)制指重金屬抗性基因(metal resistance genes, MGEs)和ARGs同時(shí)位于整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等遺傳元件上[41]，交叉抗性機(jī)制是細(xì)菌利用同一系統(tǒng)同時(shí)對(duì)重金屬和抗生素產(chǎn)生抗性。在此條件下，細(xì)菌可對(duì)多種重金屬和抗生素具有抗性[42]。

Dickinson等[43]通過分析英國西北部某池塘沉積物中重金屬濃度，以及重金屬抗性和抗生素抗性情況發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)Zn的耐受水平與Zn濃度呈正相關(guān)，而耐Zn菌株占比與奧沙西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶抗生素抗性水平呈正相關(guān)，抗生素抗性與Zn污染密切相關(guān)。此外，從歷史數(shù)據(jù)分析可知，該池塘在使用抗生素之前，其沉積物中已檢出較高豐度的抗生素抗性細(xì)菌，表明重金屬污染對(duì)細(xì)菌的抗生素抗性產(chǎn)生具有重要影響。與單一抗生素或單一重金屬的選擇性作用相比，抗生素與重金屬協(xié)同作用對(duì)細(xì)菌的選擇性作用影響更大[44]。Knapp等[45]檢測(cè)分析了荷蘭不同區(qū)域土壤中ARGs豐度，結(jié)果表明，當(dāng)抗生素(包括四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺酶類)和重金屬(包括Cu、Ni和Zn等)同時(shí)存在時(shí)，土壤中ARGs豐度顯著高于僅抗生素或僅重金屬存在時(shí)的土壤，重金屬和抗生素協(xié)同作用對(duì)ARGs豐度的增殖具有促進(jìn)作用[46]。與抗生素相比，重金屬具有不可生物降解性，其對(duì)細(xì)菌的選擇性作用更為持久。Song等[24]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤中的Cu(≥365 mg/kg)和Zn(≥264 mg/kg)能夠顯著增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的抗性，但高濃度四環(huán)素(100 mg/kg)卻未有此效果，重金屬對(duì)抗生素抗性的選擇性作用更強(qiáng)，這主要是因?yàn)橹亟饘倬哂虚L期生物可利用度，而四環(huán)素本身會(huì)發(fā)生微生物轉(zhuǎn)化和降解，不會(huì)在土壤環(huán)境中長期穩(wěn)定存在，因此對(duì)土壤微生物的脅迫作用弱于重金屬。

2 重金屬對(duì)ARGs環(huán)境行為的影響

2.1 重金屬對(duì)ARGs豐度的影響

研究表明[47-50]，不同環(huán)境介質(zhì)中重金屬濃度與ARGs豐度具有顯著相關(guān)性，重金屬脅迫作用對(duì)抗生素抗性微生物具有共選擇效應(yīng)，造成ARGs豐度可維持在穩(wěn)定水平[51]。Stepanauskas等[25]研究發(fā)現(xiàn)，水中Cd暴露能夠富集氨芐青霉素抗性病原菌Ralstoniamannitolilytica，提高其抗生素抗性率。He等[52]研究表明，魚塘中Cu和Zn濃度與tetO、tetQ和sul3基因豐度顯著相關(guān)，Cu和Zn暴露能夠促進(jìn)ARGs增殖，四環(huán)素類和磺胺類ARGs總豐度分別提高約10%和27%。Ding等[44]同樣報(bào)道，Cu和Zn暴露對(duì)四環(huán)素抗性具有協(xié)同作用，當(dāng)Zn或Cu與土霉素同時(shí)存在時(shí)，培養(yǎng)體系中四環(huán)素抗性基因相對(duì)豐度分別為僅土霉素暴露時(shí)的1.5和1.2倍。Ji等[47]研究發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)場周邊土壤中ARGs豐度與其對(duì)應(yīng)抗生素濃度的相關(guān)關(guān)系不顯著，但與Cu、Zn和Hg等重金屬濃度顯著相關(guān)，重金屬對(duì)ARGs豐度具有重要影響。Hu等[53]研究表明，土壤長期(4～5年)Cu污染對(duì)ARGs的多樣性和相對(duì)豐度均會(huì)產(chǎn)生影響，當(dāng)土壤中Cu濃度為100～200 mg/L時(shí)，被檢出的ARGs數(shù)量最多，相比之下，潮土中ARGs相對(duì)豐度隨著Cu濃度的提高而升高，并在Cu濃度為800 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，這可能與土壤pH影響Cu生物可利用性密切相關(guān)。還有研究表明[54]，土壤長期Ni污染暴露會(huì)導(dǎo)致ARGs種類和豐度的升高，當(dāng)Ni濃度為400 mg/L時(shí)，潮土中ARGs數(shù)量從61～72顯著升至114～121，而紅壤中ARGs數(shù)量同樣從45～64升至116～126，這可能是由于Ni生物可利用性和可移動(dòng)基因元件的影響造成的。同樣地，Zhang等[55]通過對(duì)農(nóng)田土壤中重金屬和ARGs水平檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Zn和Cu濃度對(duì)sul1基因相對(duì)豐度具有顯著影響。

2.2 重金屬對(duì)ARGs水平轉(zhuǎn)移的影響

重金屬脅迫作用對(duì)ARGs的散播和轉(zhuǎn)移具有重要影響[54]。Wang等[51]研究報(bào)道，水中典型重金屬Cu能夠促進(jìn)RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的ARGs接合轉(zhuǎn)移，當(dāng)Cu2+濃度為0.05～0.5 μg/L時(shí)，ARGs接合轉(zhuǎn)移率隨Cu2+濃度的升高而升高，Cu2+濃度為5.0 μg/L時(shí)，ARGs接合轉(zhuǎn)移率比空白對(duì)照提高了16倍，這主要是因?yàn)镃u脅迫能夠造成供體細(xì)菌細(xì)胞損傷，促進(jìn)ARGs發(fā)生轉(zhuǎn)移。相比之下，當(dāng)Cd2+濃度為0.05～200 μg/L時(shí)，RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的ARGs接合轉(zhuǎn)移率隨Cd2+濃度的升高而降低，這與其刺激細(xì)菌細(xì)胞分泌EPS有關(guān)，EPS的大量生成可阻礙細(xì)胞之間相互接觸，抑制ARGs水平轉(zhuǎn)移。Lu等[56]研究發(fā)現(xiàn)，納米銀(AgNPs)和Ag+均可促進(jìn)RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的ARGs在不同細(xì)菌菌屬間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，在AgNPs濃度為0.1 μg/L條件下交配6 h后，RP4質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移至惡臭假單胞菌的效率提高了0.8倍。此外，當(dāng)Ag+濃度為0.01～10 μg/L時(shí)，RP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率隨Ag+濃度的升高而升高，當(dāng)Ag+濃度為10 μg/L時(shí)，其轉(zhuǎn)移率約為空白對(duì)照的2.4倍。AgNPs和Ag+暴露能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，造成細(xì)菌細(xì)胞膜損傷并作出應(yīng)激響應(yīng)，從而促進(jìn)RP4質(zhì)粒發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。細(xì)胞膜致密性是功能基因在細(xì)菌種屬間水平轉(zhuǎn)移的天然屏障，因此細(xì)胞膜損傷或破裂可促進(jìn)基因水平轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而導(dǎo)致ARGs的散播[57-59]。

在ARGs水平轉(zhuǎn)移過程中，全局調(diào)控基因korA、korB和trbA主要負(fù)責(zé)質(zhì)粒pCM184-Cm的轉(zhuǎn)移、復(fù)制和穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)移過程。Zhang等[60]研究表明，當(dāng)Cu2+、Ag+、Cr6+和Zn2+暴露濃度分別為0.01、0.01、0.1和0.05 mg/L時(shí)，korA、korB和trbA基因表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，其中korA基因表達(dá)水平下調(diào)程度分別達(dá)56.8%、33.2%、10.1%和44.3%。類似地，Pu等[61]研究發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度的Cd2+暴露可顯著提高RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移率，濃度為1～100 mg/L的Cd2+能夠顯著提高細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性，當(dāng)Cd2+濃度為100 mg/L時(shí)，交配導(dǎo)致形成基因trbBp的表達(dá)水平及DNA轉(zhuǎn)移水平顯著升高，促進(jìn)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移。

3 展望

目前，關(guān)于重金屬對(duì)ARGs環(huán)境行為的過程影響已有較多研究報(bào)道，但大多仍局限于重金屬與ARGs之間的相關(guān)性分析，及其對(duì)ARGs水平轉(zhuǎn)移率的影響，而針對(duì)其內(nèi)在影響分子機(jī)制等仍尚未明晰，相關(guān)研究也較少。因此，未來還應(yīng)在以下方面開展深入研究。

(1) 深入研究重金屬對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的ARGs水平轉(zhuǎn)移過程影響的內(nèi)在作用分子機(jī)制。

(2) 系統(tǒng)研究不同環(huán)境介質(zhì)中抗生素與重金屬對(duì)ARGs豐度和水平轉(zhuǎn)移的協(xié)同選擇性效應(yīng)，為研發(fā)有效的ARGs污染控制技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。