加味柴胡疏肝湯君臣配伍抗癲癇作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究?

盧 玲，胡躍強(qiáng)，廖現(xiàn)秋，李 歡，蔡 倫，刁麗梅△

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

癲癇是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］，伴有多種并發(fā)癥。它反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量。加味柴胡疏肝湯具有疏肝理氣、調(diào)暢氣機(jī)的功效，其君藥（柴胡）、臣藥（香附、川芎）皆屬肝經(jīng)，臨床上常辨證用于治療癲癇［2］。前期臨床實(shí)踐及基礎(chǔ)研究已證實(shí)加味柴胡疏肝湯具有抗癲癇作用［3-4］，但是加味柴胡疏肝湯中君臣配伍的抗癲癇作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)初步揭示加味柴胡疏肝湯君臣配伍抗癲癇的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 癲癇相關(guān)靶標(biāo)的篩選分別在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/）和Gene-Cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢得到癲癇相關(guān)的靶標(biāo)。并通過(guò)Venny在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到的癲癇靶標(biāo)取交集，得到與癲癇相關(guān)的靶標(biāo)。

1.2 加味柴胡疏肝湯中君藥和臣藥的有效成分及靶標(biāo)收集在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索得到加味柴胡疏肝湯中君藥（柴胡）和臣藥（香附、川芎）的所有成分及作用的靶標(biāo)。根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，且類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18進(jìn)行過(guò)濾。同時(shí)通過(guò)文獻(xiàn)挖掘補(bǔ)充不在篩選范圍，但已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)或臨床研究證實(shí)具有抗癲癇作用的有效成分。

1.3 加味柴胡疏肝湯君臣配伍抗癲癇作用的潛在靶標(biāo)將癲癇相關(guān)的靶標(biāo)與加味柴胡疏肝湯君臣配伍作用的靶標(biāo)導(dǎo)入在線軟件Venny進(jìn)行映射，得到加味柴胡疏肝湯君臣配伍抗癲癇作用的潛在靶標(biāo)。

1.4 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）可用于分析潛在靶標(biāo)基因之間的相互作用關(guān)系。將潛在靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，再將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)連接度（degree值）。

1.5 靶標(biāo)基因功能富集分析使用R語(yǔ)言軟件（版本：v.3.5.0）中clusterProfiler包對(duì)潛在靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)選取符合條件的前15個(gè)GO生物功能和KEGG信號(hào)通路。

1.6 構(gòu)建關(guān)鍵“成分-靶標(biāo)-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)對(duì)加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分、潛在靶標(biāo)、富集的前15個(gè)KEGG信號(hào)通路進(jìn)行數(shù)據(jù)編排，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建“加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分-抗癲癇潛在靶標(biāo)-KEGG通路”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的degree值，篩選出網(wǎng)絡(luò)中連接度最大的前3個(gè)核心靶標(biāo)，用于分子對(duì)接預(yù)測(cè)。

1.7 分子對(duì)接在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查詢加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分的化學(xué)式及2D、3D結(jié)構(gòu)信息。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）中收集癲癇相關(guān)的核心靶標(biāo)蛋白的3D結(jié)構(gòu)信息，并通過(guò)Autodock Vina實(shí)現(xiàn)加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分與癲癇核心靶標(biāo)的分子對(duì)接，用于判斷靶標(biāo)蛋白與藥物有效成分的結(jié)合性。

2 結(jié)果

2.1 癲癇相關(guān)靶標(biāo)的篩選從DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)得到癲癇相關(guān)的靶標(biāo)有1176個(gè)，Gene-Cards數(shù)據(jù)庫(kù)中癲癇相關(guān)的靶標(biāo)有5064個(gè)。兩者取交集，得到1074個(gè)癲癇相關(guān)的靶標(biāo)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中癲癇相關(guān)的1074個(gè)靶標(biāo)

2.2 加味柴胡疏肝湯抗癲癇作用的潛在靶標(biāo)通過(guò)在線軟件Venny對(duì)癲癇相關(guān)的1074個(gè)靶標(biāo)和加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分作用的204個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行映射。得到加味柴胡疏肝湯君臣配伍抗癲癇的潛在靶標(biāo)共37個(gè)。見(jiàn)圖2。

圖2 抗癲癇潛在靶標(biāo)韋恩圖

2.3 加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分及靶標(biāo)加味柴胡疏肝湯中君臣配伍的成分共有642種，包括柴胡349種、香附104種、川芎189種。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)去重后，得到加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分35種，其共作用于204個(gè)靶標(biāo)，結(jié)果表明：君藥和臣藥中可含有同一種有效成分。見(jiàn)表1。

表1 加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分基本信息

2.4 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將加味柴胡疏肝湯君臣配伍的37個(gè)潛在靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)連接度。結(jié)果表明除了靶標(biāo)CHRNA2外，其余靶標(biāo)基因之間均有直接或間接的相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖3。圖中顏色由黃色變紅色，圖形由小變大，代表節(jié)點(diǎn)的degree值增加；線條由細(xì)變粗代表節(jié)點(diǎn)的結(jié)合分?jǐn)?shù)變大；由此篩選出排名前10的靶標(biāo)基因，包括：AKT1、ESR1、IL-6、FOS、EGF、APP、IL-1B、MAPK1、CCL2、GJA1。

圖3 靶標(biāo)基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

2.5 基因功能富集分析使用clusterProfiler包對(duì)37個(gè)抗癲癇潛在靶標(biāo)進(jìn)行基因功能富集分析，結(jié)果表明：抗癲癇的潛在靶標(biāo)共富集了69個(gè)GO生物學(xué)功能，其中根據(jù)P值由小到大排名前15的包括神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、氧化還原酶活性、類(lèi)固醇羥化酶活性、細(xì)胞因子活性、配體門(mén)控離子通道活性、配體門(mén)控通道活性、受體激活活性、血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合、發(fā)射門(mén)控離子通道活性、發(fā)射門(mén)控通道活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性，見(jiàn)圖4。此外，潛在靶標(biāo)還涉及了113條KEGG信號(hào)通路，排名前15的為：糖尿病并發(fā)癥的年齡-憤怒信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、雌激素信號(hào)通路、南美錐蟲(chóng)病（美洲錐蟲(chóng)?。?、朊病毒病、鼠疫感染、結(jié)核病、百日咳、風(fēng)疹、C型凝集素受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、移植物抗宿主病、結(jié)腸直腸癌、縫隙連接。見(jiàn)圖5。

圖4 GO分析柱狀圖

圖5 KEGG分析氣泡圖

2.6 構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)把加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分、潛在靶標(biāo)以及富集的前15條KEGG信號(hào)通路進(jìn)行編排，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建得到“加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分-抗癲癇潛在靶標(biāo)-KEGG通路”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖6。計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的degree值，篩選出排名前3的核心靶標(biāo)AKT1、MAPK1、IL-6用于分子對(duì)接預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：加味柴胡疏肝湯君臣配伍通過(guò)多成分、多靶標(biāo)、多途徑發(fā)揮抗癲癇作用。AKT1、MAPK1和IL-6這3個(gè)核心靶標(biāo)不僅在“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，它們也是基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10的靶標(biāo)基因，也在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用。見(jiàn)表2。

表2 君臣配伍有效成分與核心靶標(biāo)分子對(duì)接基本信息

圖6 加味柴胡疏肝湯君臣配伍有效成分-抗癲癇潛在靶標(biāo)-KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對(duì)接結(jié)果為驗(yàn)證各有效成分與靶標(biāo)之間的結(jié)合性強(qiáng)弱，將篩選出的3個(gè)核心靶標(biāo)蛋白AKT1、MAPK1和IL-6分別與加味柴胡疏肝湯君臣配伍的有效成分小分子進(jìn)行兩兩對(duì)接，見(jiàn)表2。當(dāng)親合能＜-5.0 kJ/mol時(shí)，表明其結(jié)合性良好，結(jié)合能越小則分子間對(duì)接越好。結(jié)果表明：加味柴胡疏肝湯君臣配伍的抗癲癇有效成分均與核心靶標(biāo)具有良好的結(jié)合性。加味柴胡疏肝湯君臣配伍對(duì)癲癇的療效可能是多靶標(biāo)共同作用的結(jié)果，并且與君臣配伍有效成分和癲癇靶標(biāo)的良好結(jié)合性密切相關(guān)。

3 討論

中藥君臣配伍在方劑治療疾病中發(fā)揮著重要的作用［5］。加味柴胡疏肝湯善于疏肝解郁，化痰熄風(fēng)，是“從肝論治”治療癲癇的代表方劑之一。方中柴胡為君藥，具有疏肝解郁之效；香附疏肝理氣，川芎活血行氣，二藥相合，可助柴胡解肝經(jīng)之郁滯，并增行氣活血之效，共為臣藥［3］。研究證實(shí)，柴胡中柴胡皂苷、川芎中川芎嗪均有抗驚厥作用［6］；香附的黃酮類(lèi)成分能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有抗氧化作用［7］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出加味柴胡疏肝湯君藥、臣藥的有效成分，發(fā)現(xiàn)君藥和臣藥中可含有同一種有效成分。且在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中君臣共有的有效成分其節(jié)點(diǎn)連接度均大于單味藥物的有效成分。因此，加味柴胡疏肝湯君臣配伍發(fā)揮著重要的抗癲癇作用。

本研究篩選的AKT1、MAPK1和IL-6這3個(gè)核心靶標(biāo)不僅在“成分-靶標(biāo)-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，也在基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。PI3K/mTOR通路的激活和表達(dá)常見(jiàn)于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如癲癇等。AKT又稱蛋白激酶B-PKB，是一種由氧化應(yīng)激激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是PI3K/mTOR通路最重要的下游效應(yīng)因子之一，與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)［8］。而AKT的異構(gòu)體AKT1也被證實(shí)在癲癇的治療中起著重要的作用［9］。研究認(rèn)為，神經(jīng)炎癥在癲癇發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，而與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子的水平也被證實(shí)在癲癇發(fā)作時(shí)明顯升高［10］。此外，癲癇持續(xù)狀態(tài)后常出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，而絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）可介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬［11］。綜上，本研究篩選的核心靶點(diǎn)AKT1、MAPK1和IL-6均與癲癇密切相關(guān)，且可能參與到炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過(guò)程中。

基因富集分析的結(jié)果表明，潛在靶標(biāo)主要影響了神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、通道活性、氧化還原酶活性、細(xì)胞因子活性、受體激活活性、血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等69個(gè)GO生物學(xué)功能，這些生物學(xué)功能大部分均與癲癇的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生物學(xué)變化有關(guān)［12］。潛在靶標(biāo)涉及的前15條KEGG信號(hào)通路中，與癲癇的病理生理過(guò)程密切相關(guān)的主要有：雌激素信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。雌激素具有高度親脂的性質(zhì)，能夠通過(guò)血腦屏障到達(dá)神經(jīng)元組織，從而影響癲癇損傷的神經(jīng)元區(qū)域。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用雌激素可上調(diào)生存分子Bcl-2，發(fā)揮抗氧化潛能，保護(hù)神經(jīng)肽-Y中間神經(jīng)元，從而較少癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)元死亡［13］。雌二醇被證實(shí)可以通過(guò)抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用來(lái)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫和炎癥［14］。C型凝集素受體能夠與壞死細(xì)胞釋放的組蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致炎癥和組織損傷［15］。腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的炎癥在急性癲癇的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，它可以通過(guò)腫瘤壞死因子受1調(diào)節(jié)谷氨酸受體的運(yùn)輸，從而促進(jìn)興奮性突觸傳遞增加［16］。此外，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥也在炎癥反應(yīng)中扮演著重要的角色［17］。

本研究結(jié)果表明，君臣配伍有效成分均與核心靶標(biāo)結(jié)合性良好。并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步闡明了加味柴胡疏肝湯君臣配伍的抗癲癇作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示中藥復(fù)方的組方規(guī)律和療效。為加味柴胡疏肝湯在抗癲癇方面的臨床應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)，也為本課題組后期的實(shí)驗(yàn)研究打下了基礎(chǔ)。