Nrf2/HO-1、cAMP/PKA在TGR5減輕高糖、高脂誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制

李 熠，馮 健

糖尿病是目前威脅人類健康的主要疾病，長期高血糖、有氧代謝降低的環(huán)境可引起心肌細(xì)胞代謝與鈣轉(zhuǎn)運發(fā)生紊亂，凋亡增多，從而引起心室重構(gòu)、充血性心力衰竭，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制較復(fù)雜，至今仍未清楚[1]。心肌細(xì)胞肥大病人在高糖等多種病理性刺激下可引起心肌細(xì)胞的表面積增加、細(xì)胞蛋白含量上升，促肥厚基因CARK(Cardiac Ankyrin Repeat Kinase)等表達(dá)水平升高，目前認(rèn)為這種改變可能與相關(guān)受體異常表達(dá)有關(guān)[2-3]。G-蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled receptor for bile acids，TGR5或GPBAR1)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體(GRCP)家族，其激活后可改善機(jī)體脂質(zhì)、糖代謝紊亂與胰島素抵抗，減輕氧化應(yīng)激，防止糖尿病、代謝綜合征等[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖調(diào)節(jié)受損與2型糖尿病(T2DM)病人的血清TGR5水平較糖耐量正常人群下降，且在T2DM病人中男性血清TGR5較女性高，表明TGR5水平與糖代謝紊亂有一定關(guān)聯(lián)，但關(guān)于TGR5對心肌細(xì)胞損傷的影響研究甚少[5]。自胚胎大鼠心肌獲取的H9C2細(xì)胞系和原代乳鼠心肌細(xì)胞有高度相似性，常用于心血管疾病的基礎(chǔ)研究，本研究選擇大鼠H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并分析激活TGR5對高糖、高脂誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2心肌細(xì)胞1株(武漢博士德微生物公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基與多聚賴氨酸(Hyclone公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，光學(xué)顯微鏡(Nikon公司)，-80 ℃冰箱(Thermo公司)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar公司)，低溫高速離心機(jī)(Thermo公司)，齊墩果酸(Sigma公司)，澳洲胎牛血清(BOVOGEN公司)，葡萄糖(Sigma公司)，棕櫚酸(Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(GIBICO公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma公司)，TGR5 shRNA(上海漢恒生物科技有限公司，慢病毒包裝)，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)小干擾RNA分子(siRNA)慢病毒(吉凱基因科技有限公司)，血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制劑鋅原卟啉(ZnPP，百靈威有限公司)，SQ22536(美國MCE公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Biosharp公司進(jìn)口分公司)，活性氧熒光探針(DCFH-DA，Sigma公司)，小鼠橫紋肌輔肌動蛋白(α-actinin)及免疫組化試劑盒均購自武漢博士德微生物公司，胰酶、蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，放置在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2及37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞生長到約80%融合狀態(tài)時可用于實驗。將細(xì)胞分為對照組、高糖+高脂組、高糖+高脂+齊墩果酸組(TGR5受體激動劑)、干擾組[高糖+高脂+齊墩果酸+TGR5 shRNA(以TGR5干擾慢病毒包裝)]、Nrf2/HO-1組(高糖+高脂+齊墩果酸+Nrf2 siRNA病毒與ZnPP預(yù)處理)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)組[高糖+高脂+齊墩果酸+SQ22536(cAMP抑制劑)預(yù)處理]。對照組單純采用DMEM培養(yǎng)基(含2%血清、5.5 mmol/L葡萄糖的低糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h；高糖+高脂組采用含2%血清、33.0 mmol/L葡萄糖加入到0.15 mmol/L棕櫚酸的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h；高糖+高脂+齊墩果酸組采用含2%血清、33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕櫚酸、齊墩果酸30 μmol/L的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h；干擾組先采用TGR5干擾慢病毒包裝將細(xì)胞感染，后加入33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕櫚酸，培養(yǎng)48 h；Nrf2/HO-1組以Nrf2 siRNA與ZnPP 10μmol/L預(yù)處理高糖+高脂+齊墩果酸(病毒感染處理48 h，方法同TGR5干擾慢病毒，ZnPP處理1 h)；cAMP/PKA組以SQ22536 100 μmol/L預(yù)處理高糖+高脂+齊墩果酸3 h。

1.2.2 心肌細(xì)胞形態(tài)變化過程 采用小鼠α-actinin抗體經(jīng)免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞，在熒光顯微鏡下對心肌細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察。依次進(jìn)行細(xì)胞爬片、細(xì)胞固定、透膜、封閉、抗體孵育、核染色(DAPI染液)、封片、拍照，帶綠色熒光為α-actinin(即為心肌細(xì)胞)，藍(lán)色為通過DAPI染色后的細(xì)胞核。

1.2.3 MTT法測定心肌細(xì)胞活性 于避光環(huán)境中向各待測孔中加20 μL的MTT工作液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，后將反應(yīng)液棄去，各孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀低速震蕩10 min，選擇檢測波長為490 nm，測定此處熒光強(qiáng)度(OD)值，計算細(xì)胞活性率。

1.2.4 DCFH-DA測定心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 心肌細(xì)胞以5×105/mL密度接種于6孔板，每孔2 mL，心肌細(xì)胞貼壁培養(yǎng)72 h后可進(jìn)行實驗。去除6孔板的檢測孔中心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，加DCFH-DA(10 μmol/L)探針1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，20 min后以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)泡洗3次，每次1 min。胰蛋白酶消化各孔心肌細(xì)胞，采用PBS對細(xì)胞輕柔吹洗，重復(fù)洗滌3次后進(jìn)行離心以收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞DCFH-DA熒光強(qiáng)度。操作時嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 應(yīng)用圖像分析法測定各組心肌細(xì)胞表面積 將心肌細(xì)胞種在含載玻片的96孔板，采用冷D-Hanks液漂洗，以4%多聚甲醛進(jìn)行固定，15 min后開始心肌細(xì)胞免疫熒光檢測并攝像，應(yīng)用Image tool 3.0軟件對單個細(xì)胞的表面積進(jìn)行測量，每張玻片測定5個視野，對從每個視野選取的10～15 個細(xì)胞進(jìn)行測定，每組重復(fù)3次，取其平均值進(jìn)行分析。

1.2.6 采用BCA法測定蛋白含量 收集6孔板中的各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，對每孔的心肌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，沉淀細(xì)胞后加2～3倍體積細(xì)胞裂解液，促進(jìn)心肌細(xì)胞膜溶解，在離心后吸取上清并采用BCA法對心肌細(xì)胞的蛋白含量進(jìn)行檢測。

1.2.7 Nrf2、HO-1、PKA檢測 采用蛋白免疫印跡法(Westren Blot)檢測各組Nrf2、HO-1、PKA水平。按試劑盒的說明書進(jìn)行心肌細(xì)胞核總蛋白提取。取一定量的蛋白樣品，加緩沖液后震蕩混勻，隨后在沸水中煮沸5 min使之變性，儲存于-20 ℃冰箱中備用或現(xiàn)用。將玻璃板清洗后晾干，分別制備分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，在過夜后使用。取樣本50 μg加入樣本孔，樣本兩側(cè)均加4 μL的蛋白Marker，初始采用60 V電壓電泳，加樣本至分離膠時電壓增加到110 V，直至樣本達(dá)分離膠底部，結(jié)束電泳。后進(jìn)行聚偏二氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜，按海綿-轉(zhuǎn)膜濾紙-凝膠-PVDF膜-轉(zhuǎn)膜濾紙-海綿順序放置轉(zhuǎn)膜夾板，將轉(zhuǎn)膜夾板放至轉(zhuǎn)膜槽(黑對黑)，加入1×轉(zhuǎn)膜緩沖液。電流400 mA，冰冷條件下轉(zhuǎn)膜60 min，后進(jìn)行封閉、一抗與二抗孵育，顯色，經(jīng)凝膠圖像系統(tǒng)對圖像進(jìn)行采集，利用Quantity One軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.8 心肌損傷標(biāo)志物測定 采用比色法測定肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)水平，高效液相色譜法(HPLC)測定cAMP。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡心肌細(xì)胞變化 熒光顯微鏡下顯示，對照組心肌細(xì)胞核大，被染成淡藍(lán)色，內(nèi)部有深藍(lán)色顆粒，高糖+高脂組心肌細(xì)胞染色強(qiáng)度較對照組增加，大部分細(xì)胞核固縮甚至破裂，被染成強(qiáng)藍(lán)色，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組大部分心肌細(xì)胞恢復(fù)正常，僅少許細(xì)胞被染成強(qiáng)藍(lán)色，干擾組染色強(qiáng)度較高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組增加。高糖+高脂組染色強(qiáng)度高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組染色強(qiáng)度則高于高糖+高脂組，而干擾組染色強(qiáng)度高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組。詳見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下各組心肌細(xì)胞變化 (A為對照組；B為高糖+高脂組；C為高糖+高脂+齊墩果酸組；D為干擾組；E為Nrf2/HO-1組；F為cAMP/PKA組)

2.2 6組心肌細(xì)胞活性、ROS、細(xì)胞表面積、蛋白含量比較 6組心肌細(xì)胞活性、ROS、細(xì)胞表面積、蛋白含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，高糖+高脂組心肌細(xì)胞活性率下降，ROS水平、心肌細(xì)胞表面積、心肌細(xì)胞蛋白含量增加；高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細(xì)胞活性率高于高糖+高脂組(P<0.01)，ROS水平、心肌細(xì)胞表面積、心肌細(xì)胞蛋白含量低于高糖+高脂組(P<0.01)，與高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組比較，干擾組心肌細(xì)胞活性率下降(P<0.01)，ROS水平、心肌細(xì)胞表面積及心肌細(xì)胞蛋白含量增加(P<0.01)，高糖+高脂組與干擾組心肌細(xì)胞活性率、ROS、細(xì)胞表面積、蛋白含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細(xì)胞活性率、ROS、細(xì)胞表面積、蛋白含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2～圖5。

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖2 6組心肌細(xì)胞活性率比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖3 6組ROS水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖4 6組細(xì)胞表面積比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖5 6組蛋白含量比較

2.3 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高糖+高脂組Nrf2、HO-1、PKA水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA水平均低于高糖+高脂組，干擾組Nrf2、HO-1、PKA水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高糖+高脂組與干擾組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖6～圖8及表1。

圖6 Western Blot法檢測Nrf2水平(1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

圖7 Western Blot法檢測HO-1水平 (1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

圖8 Western Blot法檢測PKA水平(1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

表1 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較(±s)

2.4 6組CK、LDH、cAMP水平比較 6組CK、LDH、cAMP水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高糖+高脂組、高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組、干擾組CK、LDH、cAMP水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組CK、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂組，干擾組CK、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高糖+高脂組與干擾組CK、LDH、cAMP水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組CK、LDH、cAMP水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖9～圖11。

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖9 6組CK水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖10 6組LDH水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖11 6組cAMP水平比較

3 討 論

糖尿病為胰島β細(xì)胞功能受損、導(dǎo)致胰島素缺乏或相對缺乏而導(dǎo)致的疾病，隨著人們生活與飲食習(xí)慣改變，該病發(fā)生率呈逐年升高趨勢，且發(fā)病有逐漸年輕化趨勢[6]。糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥是其主要死因，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)最終可發(fā)展為有癥狀的心力衰竭，因而明確糖尿病與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系有重要意義[7-8]。TGR5是一種新型G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體，可于激活狀態(tài)下經(jīng)cAMP引導(dǎo)信號通路傳遞生物調(diào)節(jié)信號，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)控下游基因的表達(dá)，與糖代謝及脂代謝有密切關(guān)聯(lián)[9]，研究發(fā)現(xiàn)，TGR5在膽管癌細(xì)胞(RBE)中呈高表達(dá)，可能與膽管癌的進(jìn)展密切相關(guān)[10]，而激活的TGR5受體是否可經(jīng)過cAMP活化而對糖尿病發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用目前未見報道。

高糖、高脂誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷為糖尿病心肌病重要發(fā)病機(jī)制，這可能與高糖、高脂在體內(nèi)發(fā)生氧化導(dǎo)致ROS蓄積有關(guān)，因此，高糖、高脂可持續(xù)而穩(wěn)定地產(chǎn)生ROS，從而有效地模擬糖尿病時細(xì)胞所處氧化環(huán)境。大鼠心肌細(xì)胞H9C2有可傳代、易培養(yǎng)、實驗穩(wěn)定等特點，常用于心血管疾病的基礎(chǔ)研究。本研究采用高糖、高脂在體外誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，成功地建立氧化應(yīng)激損傷模型。經(jīng)熒光顯微鏡顯示，高糖+高脂組心肌細(xì)胞染色強(qiáng)度較對照組增加，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組大部分心肌細(xì)胞恢復(fù)正常，僅少許細(xì)胞被染成強(qiáng)藍(lán)色，干擾組染色強(qiáng)度較高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組增加，同時MTT法檢測也發(fā)現(xiàn)高糖+高脂+齊墩果酸組心肌細(xì)胞存活率高于高糖+高脂組，而干擾組心肌細(xì)胞存活率低于高糖+高脂+齊墩果酸組，這表明齊墩果酸可能經(jīng)激活H9C2心肌細(xì)胞TGR5受體明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡。既往也有研究表明，齊墩果酸可增加肝糖原的含量并使血清胰島素水平升高而降低血糖[11]。心肌對葡萄糖的利用減少及對脂肪酸攝取不平衡，能量的存儲發(fā)生改變，而由細(xì)胞器產(chǎn)生的氧化代謝增多，均可促使ROS產(chǎn)生增加，超出機(jī)體一定清除能力，無法及時清除ROS，繼而導(dǎo)致氧化應(yīng)激引起的生理性變化，最終ROS直接損傷細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。本研究中高糖+高脂組ROS水平及心肌細(xì)胞表面積、心肌細(xì)胞蛋白含量高于對照組，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細(xì)胞活性率則高于高糖+高脂組，心肌細(xì)胞表面積、心肌細(xì)胞蛋白含量低于高糖+高脂組，在予以TGR5 siRNA干擾后，干擾組心肌細(xì)胞活性率下降，ROS水平及心肌細(xì)胞表面積、心肌細(xì)胞蛋白含量增加，這與早期有關(guān)學(xué)者的報道結(jié)果[12]相近，表明齊墩果酸激活TGR5后可使心肌細(xì)胞中ROS含量明顯降低，從而減少心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，避免高糖、高脂對H9C2心肌細(xì)胞的損傷，減少糖尿病對心臟造成的損害，這可能是糖尿病心肌病病人重要的藥物治療靶點。TGR5激活可通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕胰島素抵抗及高脂反應(yīng)而緩解代謝炎癥[13]。Brighton等[14]研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸可將腸道內(nèi)的分泌L細(xì)胞的多種信號通路激活，但胰升糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)分泌主要取決于TGR5是否活化，功能性TGR大部分分布在L細(xì)胞的后基底部，膽汁酸或TGR5激動劑可促進(jìn)胰島素分泌需要通過腸道內(nèi)皮的吸收過程。Molepo等[15]也發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對脂質(zhì)代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運有一定影響；Li等[16]研究結(jié)果也提示TGR5可以減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，這些保護(hù)作用可能是通過蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3(protein kinase B/glycogen synthase kinase-3，AKT/GSK-3β)途徑實現(xiàn)的。因此，TGR5的激活對H9C2心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，當(dāng)然本研究也局限于體外細(xì)胞試驗，關(guān)于本研究結(jié)論有待后期進(jìn)一步在體內(nèi)動物實驗中進(jìn)行驗證。

Ding等[17]的研究指出，TGR5受體可介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠在接受垂直袖狀胃切除術(shù)(vertical sleeve gastrectomy，VSG)后相應(yīng)有益代謝作用消失，TGR5水平增加能明顯改善膽汁酸的水平及其組成，促使回腸及棕色脂肪組織中的TGR5信號增強(qiáng)，以較好地改善血糖和增加能耗。有研究發(fā)現(xiàn)，TGR5激活減輕高血糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞心肌肥厚，可經(jīng)刺激PKA增強(qiáng)而使受磷蛋白(phospho-lamban，PLN)磷酸化，從而激活SERCA2a將鈣從胞漿中移至肌漿網(wǎng)，并使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶與NFAT信號通路降低，從而減輕高血糖所致的心肌細(xì)胞肥大[18]。Kumar等[19]認(rèn)為，TGR可通過參與能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)而抑制炎癥反應(yīng)。這些研究均表明TGR5與糖尿病代謝密切相關(guān)。本研究中，高糖+高脂組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂組，干擾組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，提示激活TGR5對高糖、高脂誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能與Nrf2/HO-1及cAMP/PKA信號通路有密切關(guān)聯(lián)。在正常人體中，TGR5可表達(dá)于機(jī)體多種組織與細(xì)胞，生理狀態(tài)下TGR5作為跨膜蛋白其一端位于膜外感受器激動劑，另一端則位于胞漿中，可結(jié)合相應(yīng)分子通過cAMP介導(dǎo)的信號途徑進(jìn)行信號傳遞，啟動下游的轉(zhuǎn)錄因子[20]。TGR5激活后能較好控制血糖，調(diào)節(jié)血脂水平，從而使能量消耗提高并起到抗炎作用，有望成為較多代謝性疾病的藥物治療靶點[21]。一般而言，TGR5受體激活后，腺苷酸環(huán)化酶活性增強(qiáng)，引起cAMP水平升高，cAMP依賴的PKA磷酸化水平隨之升高，而PKA可導(dǎo)致AKT激活，促進(jìn)GSK-3β磷酸化而引起GSK-3β失活[22-23]，因而推測TGR5受體激活后導(dǎo)致PKA激活，繼而促進(jìn)AKT與GSK-3β磷酸化，引起Nrf2、Keapl解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)位在細(xì)胞核中，同抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)啟動子區(qū)域(AREs)調(diào)控的抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，如HO-1，繼而參與改善糖誘導(dǎo)的細(xì)胞功能紊亂，文星[24]的研究結(jié)果也表明，激活TGR5可明顯減輕G/GO模型誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，Nrf2/HO-1信號通路則可能參與TGR5減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的過程。本研究可為心肌損傷的藥物治療靶點研究及藥物開發(fā)提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，激活TGR5受體對高糖、高脂誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與Nrf2/HO-1、cAMP/PKA信號通路密切相關(guān)，有望成為改善糖尿病病人心肌損傷的藥物治療靶點。