炎性因子聯(lián)合CD4在炎癥性腸病患者中的表達(dá)及與腸道菌群的關(guān)系研究

楊文宏,孫惠芳,邱 方*

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 內(nèi)科ICU;2.秦皇島市第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科一科,河北 秦皇島066000)

炎癥性腸病是一種累及回腸、直腸及結(jié)腸的特發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括：潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病兩種[1]。目前，臨床上對于炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其發(fā)病多與環(huán)境、免疫因素、感染及遺傳有關(guān)，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及血便等[2]。既往研究表明[3]，炎癥性腸病的發(fā)生多與炎性因子、免疫水平有關(guān)，如：白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及T淋巴細(xì)胞等有關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，腸道菌群處于動態(tài)平衡，而當(dāng)機(jī)體免疫抵抗力降低、長期服用廣譜抗生素等，均會引起腸道菌群紊亂[4]。研究表明[5],腸道菌群異常常伴有腸道免疫耐受，可造成機(jī)體免疫功能異常，增加腸道炎癥發(fā)生率。但是，臨床上炎癥性腸病患者腸道菌群與機(jī)體炎性因子及免疫功能的關(guān)系研究較少。因此，本研究以炎癥性腸病患者及健康體檢者為對象，探討炎性因子聯(lián)合CD4在炎癥性腸病患者中的表達(dá)及與腸道菌群的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019年5月-2021年2月炎癥性腸病患者157例設(shè)為觀察組，根據(jù)疾病類型分為克羅恩病組和潰瘍性結(jié)腸炎組。克羅恩病89例，男51例，女38例，年齡(22-61)歲，平均(43.69±4.51)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(18-29)kg/m2，平均(23.52±3.26)kg/m2；病程(1-8)周，平均(4.27±0.41)周；潰瘍性結(jié)腸炎68例，男41，女27例，年齡(23-62)歲，平均(44.11±4.57)歲；BMI(19-30)kg/m2，平均(24.18±3.32)kg/m2；病程(1-9)月，平均(4.31±0.45)月；選擇同期健康體檢者53例設(shè)為對照組，男31例，女22例，年齡(24-66)歲，平均(45.64±6.42)歲；BMI(17-28)kg/m2，平均(24.97±3.31)kg/m2。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合炎癥性腸病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均經(jīng)臨床檢查確診；(2)均完成炎性因子、CD4及腸道菌群測定，且患者均可耐受；(3)具有較為完整的檢查報告單及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)精神異常、血液系統(tǒng)疾病或自身免疫系統(tǒng)性疾?。?2)其他炎性疾病或結(jié)腸切除術(shù)患者；(3)凝血功能異常、嚴(yán)重肝腎異常者。

1.3 方法

1.3.1炎性因子及CD4測定

(1)標(biāo)本采集。觀察組住院次日取外周空腹血3 ml，對照組健康當(dāng)天取3 ml外周空腹血，30 min離心，速度4 500 rpm，操作完畢后置于低溫下備用；(2)檢測方法。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定患者白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平；采用免疫比濁法測定患者超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平；采用流式細(xì)胞儀測定患者CD4+T淋巴細(xì)胞水平，試劑盒均購自于美國RayBiotech公司，所有操作均遵循儀器說明書完成[7]。

1.3.2腸道菌群測定

(1)腸道菌群測定。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測3組腸道菌群總負(fù)荷及2種腸道益生菌(如：雙歧桿菌、乳酸桿菌)及6種腸道致病菌(大腸桿菌、葡萄球菌、韋榮球菌、幽門螺桿菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌)水平。采集糞便300 mg(中段糞便)，根據(jù)糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自于北京天根生化科技有限公司)說明書完成糞便細(xì)菌DNA，并完成PC反應(yīng)，反應(yīng)引物參考文獻(xiàn)報道進(jìn)行設(shè)計，借助Blast在線完成特異性核實(shí)后，完成引物設(shè)計(限于實(shí)驗(yàn)室條件，引物設(shè)計由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成)。根據(jù)檢測內(nèi)容完成相關(guān)參數(shù)測定：30℃下操作10 min；42℃處理30 min；99℃下處理5 min；5℃下處理5 min，合計完成循環(huán)35個，最終10 min延長，溫度72℃。每次實(shí)驗(yàn)同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和陰性對照，反應(yīng)完畢后根據(jù)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，將最終獲得的產(chǎn)物置于濃度為1.5%瓊脂凝膠電泳，結(jié)果以細(xì)菌拷貝系數(shù)采用對數(shù)/g糞便表示[8-9]。

1.3.3相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析炎癥性腸病患者炎性因子、CD4與腸道菌群的關(guān)系，本研究的采用Pearson相關(guān)性分析軟件對其進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 3組炎性因子及CD4比較

克羅恩病組與潰瘍性結(jié)腸炎組CD4水平差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，但均低于對照組(P<0.05)；克羅恩病患者IL-6、TNF-α、hs-CRP水平均高于潰瘍性結(jié)腸炎患者(P<0.05)；觀察組IL-6、TNF-α、hs-CRP水平均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 3組炎性因子及CD4比較

2.2 3組腸道菌群比較

3組葡萄球菌、銅綠假單胞菌及韋榮球菌含量無統(tǒng)計意義(P>0.05)；觀察組雙歧桿菌及乳酸桿菌含量低于對照組(P<0.05)；大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌含量多于對照組(P<0.05)；克羅恩病雙歧桿菌及乳酸桿菌含量低于潰瘍性結(jié)腸炎(P<0.05)；大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌含量多于潰瘍性結(jié)腸炎(P<0.05)，見表2。

2.3 炎癥性腸病患者炎性因子、CD4與腸道菌群關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：炎癥性腸病患者炎性因子、CD4與葡萄球菌、銅綠假單胞菌及韋榮球菌含量無相關(guān)性(P>0.05)；炎癥性腸病患者炎性因子與大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌含量呈正相關(guān)性(P<0.05)；與雙歧桿菌及乳酸桿菌含量呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；CD4與大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；與雙歧桿菌和乳酸桿菌呈正相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

表2 3組腸道菌群比較(對數(shù)/g糞便，

表3 炎癥性腸病患者炎性因子、CD4與腸道菌群關(guān)系(r，P)

3 討論

炎癥性腸病是一種以腸道黏膜慢性、非特異性炎癥反應(yīng)為主要表現(xiàn)的腸道炎性疾病。目前，臨床上對于炎癥性疾病發(fā)生機(jī)制尚未闡明，普遍認(rèn)為與環(huán)境因素、飲食、遺傳及腸道菌群等有關(guān)[10]。研究表明[11]：炎癥性腸病的發(fā)生與炎性因子有關(guān)，且炎性因子表達(dá)越高，患者病變范圍越大、病情越重。本研究中，觀察組CD4水平低于對照組(P<0.05)；IL-6、TNF-α、hs-CRP水平均高于對照組(P<0.05)，從本研究結(jié)果看出，炎癥性腸病患者發(fā)病后常伴有炎性因子異常，且患者CD4T淋巴細(xì)胞水平降低。國外學(xué)者研究表明[12]：血清炎性因子對細(xì)胞功能和體內(nèi)生理平衡的調(diào)節(jié)具有重要的作用，促炎因子與抗炎因子表達(dá)失衡可加劇疾病的發(fā)生、發(fā)展。而CD4是人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，主要由輔助T細(xì)胞表達(dá)，是Th細(xì)胞TCR識別抗原的受體，能直接參與Th細(xì)胞抗原識別過程，其表達(dá)水平能反映機(jī)體免疫水平。從本研究結(jié)果看出，炎癥性腸病患者常伴有CD4水平降低，說明免疫調(diào)節(jié)能直接參與炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展。

近年國內(nèi)外研究結(jié)果證實(shí)，腸道微生態(tài)紊亂在炎癥性腸病患者中較為常見，患者發(fā)病后腸道菌群失衡能通過菌群-腦-腸軸影響神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)[13]。由于各種原因引起腸道菌群失衡后，則會引起多種疾病的發(fā)生，增加胃腸潰瘍、腦卒中等疾病發(fā)生。本研究中，觀察組雙歧桿菌及乳酸桿菌含量低于對照組(P<0.05)；大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌含量多于對照組(P<0.05)，說明炎癥性腸病患者伴有有益菌數(shù)量的減少和有害菌數(shù)量的增多。既往研究表明[14]：當(dāng)腸道微生態(tài)失衡、有益菌減少時，將會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，損害全身多個組織、器官，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害風(fēng)險。此外，腸道中有益菌的減少及有害菌群的增多，能對患者神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。為了進(jìn)一步分析炎癥性腸病患者炎性因子、CD4與腸道菌群的關(guān)系，本研究中對其進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：炎癥性腸病患者炎性因子與大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌含量呈正相關(guān)性(P<0.05)；與雙歧桿菌及乳酸桿菌含量呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；CD4與大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；與雙歧桿菌和乳酸桿菌呈正相關(guān)性(P<0.05)，從本研究結(jié)果看出，炎癥性腸病患者炎性因子聯(lián)合CD4與腸道菌群存在強(qiáng)相關(guān)性，加強(qiáng)患者炎性因子聯(lián)合CD4水平測定能評價患者疾病嚴(yán)重程度，預(yù)測患者腸道菌群紊亂情況，有助于指導(dǎo)臨床治療[15]。

綜上所述，炎性因子、CD4在炎癥性腸病患者中表達(dá)異常，二者存在緊密的聯(lián)系，且患者常伴有腸道菌群紊亂，從而提示炎癥因子水平改變與腸道菌群失衡有密切的關(guān)系，二者可作為有效免疫細(xì)胞因子，對臨床診療、評估疾病進(jìn)展具有重要意義。