魚(yú)皮生物活性肽的提取及功能活性研究進(jìn)展

游子娟 陳漢林 鄧輔財(cái)

（1.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)學(xué)院，茂名 525000；2.廣東石油化工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，茂名 525000）

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，每年水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚(yú)皮、魚(yú)鱗和魚(yú)骨等下腳料高達(dá)250萬(wàn)噸，其中，魚(yú)皮價(jià)格低廉，在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中占主導(dǎo)，約占魚(yú)類加工總量的7%-8%。目前，僅加工成魚(yú)飼料等低值化產(chǎn)品或者掩埋丟棄的方式處理魚(yú)皮等加工副產(chǎn)物，不僅造成資源浪費(fèi)，甚至可直接導(dǎo)致環(huán)境污染［1］。與陸生動(dòng)物性副產(chǎn)物資源相比，魚(yú)皮來(lái)源廣泛、易于加工、生物安全性高［2］。魚(yú)皮中蛋白質(zhì)含量豐富，可通過(guò)蛋白酶水解法、化學(xué)法或微生物發(fā)酵法等生產(chǎn)功能性生物活性肽［3］。由于肽的生物活性與其氨基酸組成及序列密切相關(guān)，不同的提取方法得到的產(chǎn)物功能活性不一［4］。魚(yú)皮生物活性肽豐富的疏水性氨基酸，使其具有一定的抗氧化性［5］、ACE抑制活性［6-7］。此外，魚(yú)皮生物活性肽還具有抗菌［8］、免疫調(diào)節(jié)［9］、抗癌［10］等功效。魚(yú)皮生物活性肽一般含有2-20個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量低于6 000 Da，屬于小分子肽。由于小分子肽更能抵抗內(nèi)源性消化酶的水解，與氨基酸和蛋白質(zhì)相比具有更高的生物可利用性［11］。因此，對(duì)水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚(yú)皮廢棄物中生物活性肽的提取、分離鑒定方法及其功能活性進(jìn)行深入探討，不僅有助于以之為基礎(chǔ)的新功能食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥品和化工產(chǎn)品等的開(kāi)發(fā)，提高其附加值，而且能將其變廢為寶，減少環(huán)境的污染，為魚(yú)類水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展提供更加廣闊的前景。

基于此，本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外魚(yú)皮來(lái)源生物活性肽的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其功能活性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行全面介紹，重點(diǎn)介紹生物活性肽在抗氧化性、ACE抑制活性、抗菌性、免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護(hù)活性與肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系，以期為我國(guó)水產(chǎn)魚(yú)皮廢棄物高值化功能性產(chǎn)品的深入打造提供理論指導(dǎo)和有力借鑒。

1 魚(yú)皮生物活性肽的提取

魚(yú)皮生物活性肽的常規(guī)提取方法主要有酶法、化學(xué)法及發(fā)酵法（表1）。酶法水解條件溫和、安全、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但生產(chǎn)成本較高；化學(xué)法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，但反應(yīng)過(guò)程會(huì)引入有毒物質(zhì)，安全性低，且部分氨基酸被破壞，應(yīng)用范圍受限；發(fā)酵法則具有增加產(chǎn)物風(fēng)味、去腥、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、可批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，其不足包括產(chǎn)率低、產(chǎn)物純化難、部分產(chǎn)酶菌存在一定的毒性。因此，可根據(jù)實(shí)際需求及所需產(chǎn)物的特性選擇不同提取方法。

表1 魚(yú)皮生物活性肽提取方法比較Table 1 Comparison of different extraction methods of bioactive peptides from fish skin

1.1 酶法

酶法是指蛋白質(zhì)在一定條件（溫度、pH、酶濃度等）下水解生成肽的方法。酶法生產(chǎn)條件溫和、安全、過(guò)程容易，反應(yīng)過(guò)程可以控制，且不會(huì)破壞蛋白質(zhì)中的氨基酸，目前在膠原蛋白肽制備中得到廣泛應(yīng)用［12-13］。酶法步驟包括材料前處理、蛋白酶的選擇、水解度的測(cè)定、均質(zhì)和加熱滅活蛋白酶等［16］。常用的商業(yè)化蛋白酶主要有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶等［17-18］。

酶法提取魚(yú)皮生物活性肽既可采用單一蛋白酶進(jìn)行，也可采用復(fù)合蛋白酶或分步酶解法配合進(jìn)行。酶的最適反應(yīng)濃度、pH值和溫度均因酶的種類不同而有所差異，酶濃度（0.001%-0.005%，W/W）、pH值（1.5-11）和溫度（35℃-60℃）是常用的制備條件［19］。秦倩倩等［20］以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH·）清除率為指標(biāo)，從5種蛋白酶中篩選出堿性蛋白酶為草魚(yú)皮膠原蛋白的最佳水解酶；通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化，得出最優(yōu)酶解條件為酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度46.5℃，用酶量7 025.2 U/g；在此條件下，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率達(dá)78.3%。此外，Himaya等［21］采用分步酶解法水解太平洋鱈魚(yú)（Gadus macrocephalus）皮，采用胃蛋白酶水解魚(yú)皮，再采用胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶雙酶法酶解，最終得到相對(duì)分子量為1 301 Da的寡肽，該酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。

為了提高酶解產(chǎn)率，需優(yōu)化蛋白酶的水解條件，如蛋白酶用量、水解pH值和溫度等［22］。靳書杰［23］以日本黃姑魚(yú)（Nibea japonicus）魚(yú)皮為原料，分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，以DPPH·清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果顯示中性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH·清除能力最大，而后選取中性蛋白酶為最優(yōu)酶，再進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到其最優(yōu)水解條件為酶解時(shí)間5 h、加酶量1 500 U/g、料液比1∶6、酶解溫度45℃和pH 7.0。

綜上所述，為了提高酶解生物活性肽的提取效率，首先應(yīng)選擇合適的蛋白酶或者復(fù)合蛋白酶水解魚(yú)皮，并對(duì)蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，提高蛋白酶的水解效率。

1.2 化學(xué)法

化學(xué)法包括酸法、堿法提取或者酸堿法混合提取，是通過(guò)強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿水解蛋白質(zhì)使肽鍵斷裂的方法。魚(yú)皮被堿水解后，特定的氨基酸，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸會(huì)被強(qiáng)堿破壞，因此在水解的過(guò)程必須嚴(yán)格控制反應(yīng)pH和溫度［4］。生物活性肽通過(guò)酸法、堿法提取的一般步驟包括：用堿液（一般為NaOH）對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行前處理，并在一定的溫度下攪拌一定的時(shí)間。重復(fù)3遍堿處理除去非蛋白物質(zhì)和色素等雜質(zhì)后，反復(fù)用酸液（一般為HCl，也可以是醋酸）處理。在酸、堿處理后，用蒸餾水將魚(yú)皮洗滌至中性，溶解于蒸餾水中65℃保持4 h。有些研究提取步驟還包括脫脂，如Jongjareonrak等［24］采用正丁醇脫脂處理24-48 h，每8 h換液一次，上清液用醋酸溶解并溫和攪拌24 h，通過(guò)脫脂處理可以提高活性肽的純度。上述步驟得到蛋白質(zhì)水解物后，采用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿使蛋白質(zhì)水解為生物活性肽。提取條件為6-12 mol/L HCl或者4 mol/L H2SO4、100-200℃，水解12-24 h；或者6 mol/L的NaOH或2 mol/L的Ba（OH）2、水解6 h，然后經(jīng)活性炭脫色，再通過(guò)701型樹(shù)脂除去酸和鹽［25］。Cole等［26］從比目魚(yú)（Pleuronectes americanus）表皮和黏液提取物中得到抗菌肽，從皮膚上刮取黏液，加入50 mL 0.2 mol/L Na2Ac，0.2% Triton X-100,1 mmol/L苯基甲基磺酰氟，均質(zhì)，勻漿，再以20 000×g離心20 min，將上清液進(jìn)一步純化，得到含有25個(gè)氨基酸殘基的抗菌肽，其氨基酸序列為：GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHY。

化學(xué)法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是相比于酶法提取，該法存在一定的不足：反應(yīng)過(guò)程難以控制，會(huì)引入有毒化學(xué)物質(zhì)，還會(huì)破壞特定的氨基酸結(jié)構(gòu)，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸［27］；同時(shí)，由于化學(xué)試劑裂解多肽化學(xué)鍵不具有特異性，導(dǎo)致化學(xué)法制備生物活性肽難以復(fù)制；水解產(chǎn)物成分復(fù)雜，應(yīng)用范圍受限等。因此酶法比化學(xué)法應(yīng)用更廣泛。

1.3 發(fā)酵法

發(fā)酵法是利用微生物菌種在生長(zhǎng)繁殖代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶來(lái)水解蛋白質(zhì)底物制備生物活性肽的方法。該法可有效回收或?qū)⑹称忿D(zhuǎn)化為酶、有機(jī)酸等高價(jià)值產(chǎn)品［28］。在發(fā)酵的過(guò)程中，生物活性肽在微生物和內(nèi)源性蛋白酶水解的過(guò)程中被釋放出來(lái)。

目前，用于發(fā)酵法制備生物活性肽的菌種主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、曲霉菌（Aspergillus）以及乳酸菌（Lactic acid bacteria）等［29］。Jemil等［30］通過(guò)一種蛋白水解菌枯草芽孢桿菌（B.subtilis）A26發(fā)酵幾種魚(yú)類蛋白質(zhì)，生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物。在發(fā)酵過(guò)程中，魚(yú)皮蛋白質(zhì)釋放出的一些生物肽和氨基酸在蛋白質(zhì)水解酶的作用下，可被菌株用作碳氮基質(zhì)增長(zhǎng)。吳海濱［31］利用米曲霉（Aspergillus oryzae）發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備生物活性膚，對(duì)米曲霉的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行活性肽發(fā)酵，分離得到較強(qiáng)抗氧化性和ACE抑制活性的肽。邢瀚文等［32］以羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）魚(yú)皮為原料，利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵（solid-state fermentation，SSF）制備膠原蛋白肽，發(fā)酵活性肽中含有7種必需氨基酸，分子量小于5 000 Da的肽段抗氧化性最強(qiáng)，清除羥基自由基（hydroxyl free radical，·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和DPPH·的IC50值分別為3.83、4.19和2.37 mg/mL，且具有較好的還原力。

發(fā)酵法的酶水解由微生物蛋白酶進(jìn)行，生物活性肽無(wú)需進(jìn)一步水解就可直接分離獲得。相比其他方法，發(fā)酵法操作較為簡(jiǎn)便，成本較低，適合批量生產(chǎn)，并且可以增加產(chǎn)物風(fēng)味、去腥。但是相比于酶法，發(fā)酵法的效率低，產(chǎn)物純化比較困難，部分產(chǎn)酶菌株可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒害作用、安全性低等限制了發(fā)酵法的廣泛應(yīng)用［15］，因而安全高效的發(fā)酵菌株的獲得及選擇顯得至關(guān)重要。

2 魚(yú)皮生物活性肽的分離鑒定

生物活性肽的生物活性是由其性質(zhì)決定的，比如分子量、電荷和疏水性等。因此，生物活性肽的分離純化是其活性與結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)，通常根據(jù)多肽的分子量、極性和等電點(diǎn)等性質(zhì)的不同來(lái)選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法［33］。基于分子量大小的多肽分離方法有超濾法（ultrafiltration, UF）［34］、納米超濾法（nano ultrafiltration, NF）和凝膠過(guò)濾法［35］。離子交換色譜基于多肽的電荷進(jìn)行分離，反向高效液相色譜（reverse high performance liquid chromatography,RP-HPLC）則根據(jù)生物活性肽的疏水性和親水性進(jìn)行分離［36］。從RP-HPLC分離出具有最高活性的生物活性肽組分，進(jìn)一步采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, HPLC-Q-TOF-MS）［6］、電噴霧離子質(zhì)量（electrospray ion mass, ESI）［37］、基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS）等進(jìn)行肽序列分析鑒定。此外，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）［38］、傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared, FTIR）［39］、Edman降解法、圓二色譜法及核磁共振法等也常用于生物活性肽結(jié)構(gòu)的鑒定。

為了獲得高純度和高活性的生物活性肽，通常采用多種方法相結(jié)合的方式進(jìn)行分離純化及鑒定，超濾膜過(guò)濾、凝膠滲透層析及高效液相色譜等進(jìn)行分離純化后，結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行肽序列鑒定。超濾一般用于活性肽組分的粗分離，常與其他方法相聯(lián)合來(lái)對(duì)粗組分進(jìn)行進(jìn)一步分離［40］。Azizah等［41］采用2%堿性蛋白酶從魚(yú)皮中提取膠原蛋白肽，利用超濾法分離＞30 kD、10-30 kD、3-10 kD和＜3 kD的肽段，不同分子量的肽段總抗氧化活性分別為（45.07±0.12）μmol TE/g、（45.85±0.04）μmol TE/g、（45.93±0.04）μmol TE/g和（45.98±0.04）μmol TE/g。牛瑞等［42］將鱈魚(yú)多肽依次通過(guò)超濾、凝膠過(guò)濾層析、陰離子交換層析（anion exchange chromatography, Q-FF）和RP-HPLC進(jìn)行分離純化，最終獲得具有較強(qiáng)抗氧化性的生物活性肽。Senphan等［43］采用超濾和SephadexTMG-15凝膠柱層析技術(shù)結(jié)合對(duì)石斑魚(yú)皮（Lates calcarifer）蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行處理，得到分子量為364 Da的抗氧化肽，其2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid）, ABTS）自由基清除能力最強(qiáng)。

雖然當(dāng)前已有大量的生物活性肽分離鑒定方法，但探索可獲得高純度及高活性的目標(biāo)產(chǎn)物仍是當(dāng)前迫切需要突破的難點(diǎn)。目前我國(guó)魚(yú)皮生物活性肽的研究發(fā)展非常迅猛，開(kāi)發(fā)出高效且精準(zhǔn)的魚(yú)皮生物活性肽分離鑒定技術(shù)，可推動(dòng)魚(yú)皮生物活性肽的健康有序發(fā)展［44］。

3 魚(yú)皮生物活性肽的功能活性

3.1 抗氧化活性

活性氧（ROS）和活性氮（RNS）分別為氧和氮代謝的常見(jiàn)產(chǎn)物。人體在新陳代謝的過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生·O2-、·OH和DPPH·等ROS，過(guò)量的ROS由于具有一定氧化性而會(huì)對(duì)人體細(xì)胞中的大分子如蛋白質(zhì)、脂類和DNA造成損傷，而肽類則由于結(jié)構(gòu)特性可以抵抗這些ROS的氧化損傷。而且，肽類由于具有更佳的穩(wěn)定性而被認(rèn)為是比游離氨基酸更有效的抗氧化劑［45］。據(jù)報(bào)道，肽的抗氧化性能大小與肽的種類、結(jié)構(gòu)位置和疏水性氨基酸密切相關(guān)［46］。魚(yú)皮中膠原蛋白含量豐富，而膠原蛋白中含有大量甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp），含有這些氨基酸的肽往往具有較強(qiáng)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性［47］。常見(jiàn)抗氧化活性研究方法包括DPPH·清除能力、氧自由基（ORAC）清除能力、·OH清除能力和鐵原子還原抗氧化劑能力（FRAP）分析等［48-50］。低分子量肽往往具有更高的ORAC值和金屬螯合作用，而高分子量肽則常被報(bào)道具有較高的FRAP和DPPH·清除能力［51］。

抗氧化活性肽往往大量存在于巴沙魚(yú)（Pangasius bocourti）、金槍魚(yú)（Thunnus albacares）、石斑魚(yú)（Lates calcarifer）等魚(yú)皮中［41,52-54］（表2）。Sae-Leaw等［54］從石斑魚(yú)皮中提取抗氧化肽，通過(guò)交聯(lián)葡聚糖G-25和RP-HPLC分離得到4個(gè)包含5-12個(gè)氨基酸的肽段，Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg（646.367 1 Da）、Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg（1 107.590 5 Da）、Val-Leu-Gly-Pro-Phe（532.313 0 Da）和Gln-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Val（780.461 4 Da）。其中Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg（646.367 1 Da）具有最高的抗氧化性［（81.41±0.34）mmol TE/μmol肽］。Zhang等［55］從羅非魚(yú)皮水解產(chǎn)物提取抗氧化肽，分離出具有較強(qiáng)抗氧化性的肽段，分別是Glu-Gly-Leu（317.33 Da）和Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr（645.21 Da），研究了·O2-、·OH和DPPH·清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Glu-Gly-Leu（317.33 Da）的羥基自由基清除能力（IC50，4.61 g /mL）較Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr（645.21 Da）（IC50，6.45 g/mL）高。蔡金秀等［56］進(jìn)行了馬面魚(yú)（Thamnaconus septentrionalis）皮膠原抗氧化肽的分離制備及穩(wěn)定性研究，探討了馬面魚(yú)皮的最佳酶解工藝，得到抗氧化活性較高的A組分，其清除DPPH·的IC50值為1.80 mg/mL。根據(jù)UPLC-MS分析推測(cè)A組分的氨基酸序列可能是Gly-Glu-Gly-Ala-Cys-Asn或Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly。

表2 魚(yú)皮生物活性肽抗氧化性Table 2 Anti-oxidative activities of bio-active peptides from fish skin

從以上結(jié)果可以看出，魚(yú)皮來(lái)源抗氧化肽分子量大部分小于1 000 Da，且大部分含有疏水性氨基酸，如丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）。魚(yú)皮膠原蛋白中含有豐富的抗氧化活性肽，是理想的抗氧化活性肽的來(lái)源之一，有望應(yīng)用在藥品、化妝品和食品中。不過(guò)，未來(lái)的研究方向應(yīng)該是魚(yú)皮生物活性肽在體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用效果。

3.2 ACE抑制活性

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE（EC 3.4.15.1）是一種金屬二肽酶，它在血壓的調(diào)整上具有必不可少的作用。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的一部分，可以將血管緊張素I（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）從C末端切除His-Leu，轉(zhuǎn)化成血管緊張素II（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe），而血管緊張素II可以使小動(dòng)脈收縮和加速心臟搏動(dòng)導(dǎo)致血壓升高。另一方面，ACE也是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的重要組成部分，它可以催化緩解激肽成為失活片段，從而加速機(jī)體血壓升高。因此，ACE抑制劑可以起到降低血壓的作用［57］。由于傳統(tǒng)的抗血壓藥物會(huì)引起一定的副作用，因此，尋找天然安全的具有抗血壓活性的生物活性肽成為研究的熱點(diǎn)。

ACE抑制活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚未確定，但有研究報(bào)道，大部分ACE抑制肽包含脯氨酸、賴氨酸或芳香族氨基酸，且受肽鏈C端的氨基酸序列影響，尤其是當(dāng)肽鏈C端為脯氨酸等疏水性氨基酸時(shí)，ACE抑制活性更強(qiáng)［58］。ACE抑制活性的檢測(cè)方法主要有分光光度法、RP-HPLC法［59］、熒光法［60］和毛細(xì)血管電泳法（CE）。其中，分光光度法和毛細(xì)血管電泳法主要原理都是ACE通過(guò)水解底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate,HHL）產(chǎn)生馬尿酸（HA）的量來(lái)確定ACE抑制率，抑制率大小一般通過(guò)半抑制濃度（IC50）表示。RPHPLC法采用C18柱檢測(cè)HA的成分，雖然省去了萃取HA的步驟，但需要消耗大量的流動(dòng)相，對(duì)樣品量多的情況不適用。

研究報(bào)道，魚(yú)皮來(lái)源的多肽的ACE抑制活性較強(qiáng)，其活性大小與肽的序列組成密切相關(guān)（表3）。Ngo等［61］從太平洋鱈魚(yú)皮中分離純化了ACE抑制肽，通過(guò)多種蛋白酶的水解比較，發(fā)現(xiàn)以胰蛋白酶（trypsin）水解得到肽的ACE抑制活性最高，采用超濾膜分離不同分子量（＜1 kD，1-5 kD，5-10 kD和＞10 kD）的多肽，ACE抑制活性最高是分子量小于1 kD的多肽，進(jìn)一步分離可得到GASSGMPG（662 Da）和 LAYA（436 Da）兩個(gè)ACE抑制肽，IC50分別是6.9 μmol/L和14.5 μmol/L。Yang等［6］通過(guò)酶解法從阿拉斯加鱈魚(yú)皮中得到具有較高ACE抑制性的生物活性肽，其肽序列為GPLGVP，IC50為108.5 μmol/L。Lee等［36］通過(guò)比較6種蛋白酶水解鰩魚(yú)（Rajiformes）皮得到的ACE抑制肽發(fā)現(xiàn)，a-胰凝乳蛋白酶水解肽的活性最高，進(jìn)而經(jīng)過(guò)分離純化得到兩個(gè)具有較高ACE抑制活性的肽段，分別是PGPLGLTGP（975.38 Da）和QLGFLGPR（874.45 Da），相應(yīng)的IC50分別為95 μmol/L和148 μmol/L，表明ACE印制活性與蛋白酶選擇有關(guān)，因?yàn)椴煌鞍酌杆馕稽c(diǎn)不同，從而得到序列不同的肽段，而肽的結(jié)構(gòu)序列及分子量大小決定ACE的抑制活性大小。Ngo等［62］從鰩科（Okamejei kenojei）魚(yú)皮中分離純化得到兩個(gè)具有ACE抑制活性的肽，分別是LGPLGHQ（720 Da）和MVGSAPGVL（829 Da），其IC50分別為4.22 μmol/L和3.09 μmol/L；計(jì)算機(jī)模擬結(jié)構(gòu)位點(diǎn)分析顯示，ACE分子對(duì)純化肽幾乎暴露出與卡托普利類似的ACE分子結(jié)合位點(diǎn)，ACE分子與純化肽的結(jié)合位點(diǎn)有很多殘基，包括Trp67、Asn68、Thr71、Asn72和Arg348，表明ACE分子上的純化肽可能有助于抑制ACE活性從而預(yù)防高血壓。

表3 魚(yú)皮生物活性肽ACE抑制性Table 3 ACE inhibitory activities of bioactive peptides from fish skin

由于人體內(nèi)腸道與體外的環(huán)境條件不同，因此要想了解ACE抑制肽在人體內(nèi)的實(shí)際效果，需首先建立一套模擬體內(nèi)消化系統(tǒng)的研究方法。一方面，未來(lái)的主流研究方向可能是基于電子計(jì)算機(jī)信息系統(tǒng)輔助建立腸胃消化酶系統(tǒng)模擬研究模型；另一方面，未來(lái)ACE抑制肽研究應(yīng)重點(diǎn)在其對(duì)腸胃消化酶的抑制活性以及細(xì)胞的可行性等方面［57］。

3.3 抗菌性

魚(yú)類生活環(huán)境一般都有大量致病微生物，它們經(jīng)常會(huì)直接接觸潛在的病原體。魚(yú)皮可直接為魚(yú)提供天然的物理屏障保護(hù)，也可通過(guò)天然免疫因子如抑菌肽（AMPs）作為化學(xué)保護(hù)屏障來(lái)間接保護(hù)自己［63］。AMPs的生物活性在很大程度上與其電荷、螺旋度、疏水性及序列等物理化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)［64］。

表4列舉了分離獲得的黃鰭金槍魚(yú)（Thunnus albacares）和鰹魚(yú)（Katsuwonus pelamis）皮來(lái)源的抗菌肽［65-66］。據(jù)報(bào)道，兩個(gè)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）相關(guān)的抑菌肽（YFGAP和SJGAP）具有同時(shí)對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜性，對(duì)兩種細(xì)菌的MECs值分別達(dá)到1.2-17.0 μg/mL和3.1-12.0 μg/mL。此外，該活性肽的抗菌活性還包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）3種魚(yú)類病原體。Cole等［26］從比目魚(yú)中分離鑒定得到了具有較強(qiáng)抗菌性的活性肽，其結(jié)構(gòu)包含25個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列為GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHY。Ennaas等［67］純化和鑒定了4種來(lái)自馬鮫魚(yú)（Scomberomorus niphonius）下腳料水解物的抗菌肽，通過(guò)RP-HPLC對(duì)4種抗菌肽的序列進(jìn)行鑒定，分別是SIFIQRFTT（P4）、RKSGDPLGR（P8.1）、AKPGDGAGSGPR（P8.2）和GLPGPLGPAGPK（P11）。在濃度為200 μg/mL時(shí)，P8.1、P8.2和P11只顯示部分抑菌性，而P4則可同時(shí)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。Ennaas［68］及其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，合成的魚(yú)皮膠原蛋白肽在1.88 mmol/L濃度時(shí)，可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，原因可能是由于這些肽的C端含有帶有正電荷的賴氨酸（Lys）的緣故。

表4 魚(yú)皮生物活性肽抗菌性Table 4 Antimicrobial activities of bioactive peptides from fish skin

綜上可知，部分魚(yú)皮來(lái)源的多肽具有一定的抗菌性，其抗菌性強(qiáng)弱與肽的序列、結(jié)構(gòu)、大小密切相關(guān)，將來(lái)有望應(yīng)用在食品保藏和化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域。

3.4 其他生物活性

魚(yú)皮來(lái)源生物活性肽還具有抗癌性［69］、抗高血糖性［70］、免疫調(diào)節(jié)性［71］、神經(jīng)保護(hù)活性［72］等其他功能活性（表5）。在各種膠原蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)，鮭魚(yú)（Oncorhynchus keta）皮膠原蛋白肽（MCPs）對(duì)窒息圍產(chǎn)期（PA）雌鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。行為測(cè)試顯示，MCPs通過(guò)減少PA雌鼠大腦中氧化損傷和抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性，增加海馬磷酸化c-AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）表達(dá)，促進(jìn)幼鼠的長(zhǎng)期學(xué)習(xí)和記憶［73］。Sasaoka等［74］報(bào)道了鱘魚(yú)（Acipenser sinensis）皮膠原蛋白水解物存在降血糖作用，通過(guò)交聯(lián)葡聚糖G-25、RP-HPLC分離鑒定及肽序列分析得知，每一個(gè)降血糖肽序列均為Gly-X-Y結(jié)構(gòu)（X、Y為可選擇氨基酸殘基）。Sae-Leaw等［75］發(fā)現(xiàn)石斑魚(yú)皮水解物具有免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為脂多糖刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-6（IL-6）和IL-1β顯著降低。Lu等［76］從鱈魚(yú)（Gadus Macrocephalus）皮中酶解得到的魚(yú)皮膠原蛋白肽具有抗光老化作用，通過(guò)分離純化得到兩種具有較強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP-1）抑制活性的肽段，GEIGPSGGRGKPGKDGDAGPK和GFSGLDGAKGD，其MMP-1抑制率分別為16%和15%。此外，由于每種水解物都是由不同的多肽混合組成，某些生物活性肽會(huì)表現(xiàn)出多種生物活性，而非僅僅具有一種功能活性［77］。

表5 魚(yú)皮生物活性肽的其他活性Table 5 Other activities of peptides from fish skin

4 總結(jié)與展望

通過(guò)酶法、化學(xué)法及發(fā)酵法等進(jìn)行提取，進(jìn)而利用超濾、HPLC、質(zhì)譜等對(duì)提取物進(jìn)行分離純化及鑒定，可以獲得廣泛功能的魚(yú)皮來(lái)源生物活性肽，如抗氧化性、抗血壓性、抗菌性和免疫調(diào)節(jié)性等。目前，圍繞魚(yú)皮來(lái)源生物活性肽功能活性的研究主要包括以下3個(gè)方面：（1）對(duì)不同種類魚(yú)皮來(lái)源活性肽進(jìn)行工藝提取研究，并優(yōu)化提取效率和產(chǎn)物質(zhì)量；（2）分離鑒定方法的創(chuàng)新；（3）活性肽的結(jié)構(gòu)與功能活性如抗氧化性、ACE抑制性及抗菌性等作用的關(guān)聯(lián)機(jī)制研究。

然而，目前魚(yú)皮生物活性肽提取方法單一，提取效率和分離純化效率較低，獲得的產(chǎn)物成分仍然較為復(fù)雜，導(dǎo)致其生物活性較低。在功能活性研究方面，其受試對(duì)象主要僅集中在人體外及動(dòng)物體內(nèi)，大部分活性功能在人體內(nèi)的真實(shí)生物活性未得到充分驗(yàn)證，如抗血壓活性急需驗(yàn)證體外ACE抑制活性與人體內(nèi)實(shí)際抗血壓效果；功能類型方面多集中在抗氧化性、抗血壓性和抗菌性等，對(duì)其他方面的功能如免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護(hù)作用、抗癌性等研究較少。

綜上所述，今后魚(yú)皮生物活性肽研究應(yīng)著重在如下方面：探索高效安全的提取方法，提高提取效率；開(kāi)發(fā)安全高效的發(fā)酵菌株；利用現(xiàn)代化信息技術(shù)，開(kāi)發(fā)高效、精準(zhǔn)的分離、純化及鑒定技術(shù)，提高活性肽的活性和利用率；開(kāi)展功能活性人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探明活性肽的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)聯(lián)機(jī)制；抗氧化肽的潛在免疫調(diào)節(jié)活性，即抗炎、抗過(guò)敏和調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)通路等值得進(jìn)一步關(guān)注。另外，當(dāng)前關(guān)注較少的生物活性如免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護(hù)作用、抗癌性等方面值得進(jìn)一步細(xì)致全面地探索，如對(duì)阿爾茨海默癥中觀察到的β相關(guān)神經(jīng)毒素性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用等。