復(fù)方板藍(lán)根顆粒標(biāo)準(zhǔn)研究與產(chǎn)品評(píng)價(jià)*

李 柯，戚建中，符國(guó)成，陳海剛，楊一棟，陳 丹

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.華潤(rùn)三九（郴州）制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

復(fù)方板藍(lán)根顆粒是由板藍(lán)根和大青葉兩種中藥材組成的中藥成方制劑，功能為清熱解毒，涼血。臨床用于溫病發(fā)熱、出斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎、腮腺炎等。

本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第十二冊(cè)，WS3-B-2377-97）[1]，由于歷史的原因，制藥工藝粗放，質(zhì)控技術(shù)落后，過(guò)程風(fēng)險(xiǎn)控制薄弱，這些因素制約了本品發(fā)展。經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查證，全國(guó)共有150家生產(chǎn)企業(yè)有本品批準(zhǔn)文號(hào)，真正銷售過(guò)億元的廠家不多，各企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量差別較大[2-3]。基于臨床需要“好藥”，產(chǎn)業(yè)需要“大藥”的理念，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，筆者前期進(jìn)行了制備工藝研究，變更了藥品處方中已有藥用要求的輔料；改變影響藥品質(zhì)量的生產(chǎn)工藝[4]。在工藝變更的基礎(chǔ)上，本研究以小試、中試及工藝驗(yàn)證21批產(chǎn)品為樣本，以精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸和靛玉紅為指標(biāo)性成分，建立薄層色譜鑒別方法；以尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷為指標(biāo)性成分，建立高效液相色譜含量測(cè)定方法并確定了三者總含量的限度。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以控制本品的質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XS204電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥復(fù)方板藍(lán)根顆粒[批號(hào)：1804001N，1804002N，1804003N，華潤(rùn)三九（郴州）制藥有限公司]，大青葉（批號(hào)：190301，產(chǎn)地：甘肅）購(gòu)自郴州凱程醫(yī)藥有限公司，板藍(lán)根（批號(hào)：20190201，產(chǎn)地：黑龍江）購(gòu)自安徽省亳州市醫(yī)藥供銷有限公司，兩味藥材經(jīng)檢驗(yàn)均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部藥材標(biāo)準(zhǔn)。鳥(niǎo)苷對(duì)照品（批號(hào)：111977-201501，含量93.6%），尿苷對(duì)照品（批號(hào)：110887-201803，含量99.5%），腺苷對(duì)照品（批號(hào)：110879-200202，含量100%），R,S-告依春對(duì)照品（批號(hào)：111753-201706，含量100%），以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院；甲醇[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，色譜級(jí)]；其他試劑均為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1氨基酸的薄層鑒別 取本品2 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取板藍(lán)根對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取L-脯氨酸、精氨酸、亮氨酸對(duì)照品，分別加乙醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。另外，根據(jù)處方比例分別稱取缺板藍(lán)根、缺大青葉藥材制成缺板藍(lán)根、缺大青葉的陰性溶液。照薄層色譜法《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部（通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液1 μL，對(duì)照品溶液1 μL，供試品溶液與陰性溶液2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品和缺大青葉陰性樣品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺板藍(lán)根陰性樣品無(wú)精氨酸對(duì)照品斑點(diǎn)，說(shuō)明精氨酸屬于板藍(lán)根專屬性成分。（見(jiàn)圖1）

圖1 復(fù)方板藍(lán)根顆粒中氨基酸的薄層色譜圖

2.1.2 靛玉紅的薄層鑒別[5]取本品30 g，研細(xì)，加水50 mL溶解，再加50 mL三氯甲烷，加熱回流1 h后，取三氯甲烷層溶液，濃縮至1 mL作為供試品溶液。另取靛玉紅對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部（通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5μL，對(duì)照品溶液5μL，供試品溶液10～15μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。（見(jiàn)圖2）

圖2 復(fù)方板藍(lán)根顆粒中靛玉紅的薄層色譜圖

2.2 成分的含量測(cè)定[6-8]

2.2.1 色譜條件Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～3 min，2%A；3～16 min，2%→5%A；16～20 min，5%→8%A；20～30 min，8%A；30～35 min，8%→20%A；35～42 min，20%→90%A；42～48 min，90%A；48～50 min，90%→2%A；50～60 min，2%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，流速為0.8 mL/min；柱溫為25℃，進(jìn)樣體積5 μL，理論塔板數(shù)按尿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春各20 μg及腺苷25 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。2

.2.4陰性對(duì)照溶液 按復(fù)方板藍(lán)根顆粒處方和制備工藝制備缺板藍(lán)根的陰性樣品、缺大青葉的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制成缺板藍(lán)根、缺大青葉的陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。（見(jiàn)圖3）

圖3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察取尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷對(duì)照品貯備液各1 mL，分別稀釋2、5、10、20、50倍，制備成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液。進(jìn)樣5 μL，測(cè)定，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的回歸方程分別為：Y=97.475-0.000、Y=162.308X-0.005、Y=505.581X-0.052、Y=138.411X-0.005。r值均為1.000，結(jié)果表明尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的濃度分別0.004～0.209、0.002～0.102、0.0008～0.0420、0.001～0.061μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)取同一份均勻供試品溶液（批號(hào)：1804001N），按照測(cè)定法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各指標(biāo)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD分別為0.3%、0.2%、0.9%、0.2%，表明本方法儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取已研細(xì)的本品（批號(hào)：1804001N）1.5 g，按照供試品溶液的制備方法制備，取供試品溶液分別于0、6、16、24、32、38、46、56、64 h分別進(jìn)樣5 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD值分別為1.7%、1.1%、1.9%、2.1%，表明4個(gè)成分在64 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同批號(hào)已研細(xì)的本品（批號(hào)：1804001N）1.5 g，精密稱定，按照供試品溶液的制備方法制備樣品，一式6份，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，計(jì)算含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的含量 分 別 為0.26、0.14、0.06、0.08 mg/g，RSD值 分 別 為2.2%、0.6%、0.9%、2.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的本品（批號(hào)：1804001N）0.75 g，一式6份，分別加入同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春及腺苷混合對(duì)照品溶液后，按照供試品溶液的制備方法制備，平行制備6份供試品。按照測(cè)定法測(cè)定，計(jì)算回收率（%）及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見(jiàn)表1～4。

表1 尿苷準(zhǔn)確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 鳥(niǎo)苷準(zhǔn)確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3 （R,S）-告依春準(zhǔn)確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表4 腺苷準(zhǔn)確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定及限度的確定

2.8.1 不同批次樣品含量測(cè)定及指標(biāo)成分的選定 按擬定的方法，分別對(duì)21批次復(fù)方板藍(lán)根顆粒[999R華潤(rùn)三九（郴州）制藥有限公司]進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷穩(wěn)定，（R，S）-告依春穩(wěn)定性不好，不適宜作為含量測(cè)定指標(biāo)。（見(jiàn)表5）

表5 21批次顆粒尿苷+鳥(niǎo)苷+腺苷總含量及（R,S）-告依春含量結(jié)果

2.8.2 不同廠家樣品含量測(cè)定及限度的確定 購(gòu)買了市場(chǎng)上銷量較大的17個(gè)廠家共32批次的復(fù)方板藍(lán)根顆粒，以尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷總量為測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明各個(gè)廠家尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷總含量差異較大，含有量限度按照平均值（4.40 mg/袋）下浮30%計(jì)算，建議規(guī)定本品每袋含板藍(lán)根以尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷總量計(jì)不得少于3.0 mg。（見(jiàn)表6）

表6 不同廠家復(fù)方板藍(lán)根尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷總含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表6：

3 討 論

板藍(lán)根藥材含量控制成分為（R,S）-告依春，且屬于板藍(lán)根特征性成分，但文獻(xiàn)報(bào)道該成分極不穩(wěn)定，無(wú)論在藥材、各類制劑中含量穩(wěn)定性均極差[9-10]，這與工藝驗(yàn)證3批復(fù)方板藍(lán)根顆粒穩(wěn)定性研究結(jié)果吻合，且按單位含量計(jì)（mg/g）在本品中含量低于萬(wàn)分之二，不適合選擇將其作為含量質(zhì)控成分；另板藍(lán)根顆粒與復(fù)方板藍(lán)根顆粒處方組成類似，工藝均為水提醇沉，2019年8月國(guó)家藥典委員會(huì)最新公示的板藍(lán)根顆粒中已取消（R,S）-告依春的測(cè)定，鑒于此，暫不考慮將（R,S）-告依春作為本品含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，同時(shí)鑒于3個(gè)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，均屬于核苷類成分，參照板藍(lán)根顆粒最新公示稿標(biāo)準(zhǔn)，以3個(gè)成分總量作為本品含量限度控制標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)市售32批復(fù)方板藍(lán)根顆粒中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷的總量測(cè)定，結(jié)果表明差異較大[2-3,11]，建議生產(chǎn)企業(yè)建立從藥材、中間體和成品的質(zhì)量控制體系，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。