氣相色譜法同時測定砂仁葉油中β-丁香烯與β-蒎烯的含量*

張怡評，施麗君，張紅紅，方 華，晉文慧，陳偉珠，李忠思，邱遠(yuǎn)望

（1.自然資源部第三海洋研究所/海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005；2.福建中特藥業(yè)有限公司，福建 泉州 362712）

砂仁葉油為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的新鮮葉片經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，為淡黃色澄清液體，味辣，氣辛而有砂仁香氣。砂仁葉具有行氣、健胃、消脹、止嘔等功效，可用于脾胃虛寒、脘腹脹痛、惡心嘔吐、消化不良等，收載于1977年版《中華人民共和國藥典》[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，砂仁葉油具有促進(jìn)家兔皮膚創(chuàng)面愈合[2]，促進(jìn)大鼠幽門結(jié)扎性潰瘍愈合[3]，以及清除超氧陰離子和羥自由基的作用[4]。臨床研究表明其具有治療潰瘍病、胃腸炎所引起的腹痛、嘔吐等作用[5]。同時，由砂仁葉油作為主要成分的制劑“砂仁驅(qū)風(fēng)油”有祛風(fēng)行氣、消炎鎮(zhèn)痛的功效，臨床用量較大[6]。砂仁葉油主要含偽檸檬烯、3-蒈烯、d-檸檬烯、桃金娘烯醇、β-丁香烯和β-蒎烯等多種成分[2，7]。然而，目前尚未見同時測定砂仁葉油中β-丁香烯與β-蒎烯方法的研究報道，對砂仁葉油的質(zhì)量控制缺乏定性定量檢測方法。研究發(fā)現(xiàn)，砂仁葉油中β-丁香烯與β-蒎烯具有抗菌、消炎、止咳化痰等功效[8-11]，可作為砂仁葉油中指標(biāo)性成分。本研究建立了砂仁葉油中β-丁香烯與β-蒎烯含量測定方法，為砂仁葉油質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器GC-6890氣相色譜儀（美國Agilent公司），配FID檢測器；HP-5毛細(xì)管色譜柱（美國Agilent公司）；SQP型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 材料砂仁葉油（本實驗室自制，砂仁葉采自漳州長泰，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃鳴清教授鑒定為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的新鮮葉）；β-丁香烯對照品（批號：111819-201703）、β-蒎烯對照品（批號：110897-201803）（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，TEDIA公司）；無水硫酸鈉（西隴科學(xué)股份有限公司，批號：180408）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件GC-6890氣相色譜儀和氣相色譜工作站，F(xiàn)ID檢測器；毛細(xì)管色譜柱為Agilent HP-5（30m×0.32mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；程序升溫為Agilent初始80℃，以8℃/min升溫速率升至200℃（保持5 min）；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為10∶1；載氣為高純氮；流速為1 mL/min；尾吹為30 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取β-丁香烯對照品與β-蒎烯對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含β-丁香烯為457.2 μg/mL、β-蒎烯736.3 μg/mL的混合對照品儲備液，搖勻，即得。

2.2.2 砂仁葉油供試品溶液的制備 取砂仁葉油50 mg置于10 mL容量瓶中，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各1 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示β-丁香烯與β-蒎烯與其他組分峰均能基線分離，分離度>1.5；β-丁香烯與β-蒎烯的理論塔板數(shù)均在5 000以上，色譜圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察取“2.2.1”對照品儲備液，依次稀釋，分別配置成含β-丁香烯分別為457.2、228.6、114.3、57.2、28.6、14.2、7.1 μg/mL和 含β-蒎 烯736.3、368.2、184.1、92.0、46.0、23.0、11.5 μg/mL的系列混合對照品溶液，各吸取1 μL分別注入氣相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。分別以β-丁香烯與β-蒎烯的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為β-丁香烯：Y=2.273 4X-13.360 0（R2=0.999 5），β-蒎烯：Y=1.604 1X-6.450 1（R2=0.999 7），由此可見β-丁香烯與β-蒎烯分別在質(zhì)量濃度為7.1～457.2 μg/mL和11.5～736.3 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗按照“2.4”項下方法，制備β-丁香烯與β-蒎烯質(zhì)量濃度分別為228.6 μg/mL和368.2 μg/mL的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示β-丁香烯與β-蒎烯峰面積RSD分別為0.88%（n=6）和0.45%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗按照“2.4”項下方法，制備β-丁香烯與β-蒎烯分別為228.6 μg/mL和368.2 μg/mL的混合對照品溶液，分別于0、3、6、9、12、18、24 h按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果β-丁香烯與β-蒎烯峰面積RSD分別為0.89%和0.96%。表明β-丁香烯與β-蒎烯在24 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗精密稱取砂仁葉油80 mg 6份，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取上述供試品溶液各1 μL，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果β-丁香烯與β-蒎烯的RSD分別為0.56%和0.70%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗取β-丁香烯與β-蒎烯適量，精密稱定，加入甲醇至刻度，配制成β-丁香烯與β-蒎烯質(zhì)量濃度分別為1.19 mg/mL和1.03 mg/mL混合對照品溶液。另取砂仁葉油40 mg 6份置于10 mL容量瓶中，精密稱定，分別加入1 mL的混合對照品溶液，用甲醇溶解并稀釋至刻度，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果β-丁香烯與β-蒎烯平均回收率分別為98.35%和98.64%，RSD分別為2.86%和1.82%。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 定量限與檢測限取β-丁香烯與β-蒎烯混合對照品溶液，適當(dāng)稀釋并檢測，獲得信噪比約為3或者10的對照品濃度值。結(jié)果表明β-丁香烯定量限和檢測限分別為0.51 ng和0.17 ng；β-蒎烯定量限和檢測限分別為1.22 ng和0.37 ng。

2.10 系統(tǒng)耐用性

2.10.1 不同升溫程序?qū)y定結(jié)果的影響 考察不同程序柱溫（70～190℃、80～200℃、90～210℃、100～220℃、100～200℃）對分離效果的影響。結(jié)果表明在不同柱溫下，β-蒎烯和β-丁香烯分離效果差異不大，但總體上80～200℃的峰形更優(yōu)，故選擇升溫程序80～200℃。

2.10.2 不同色譜柱對測定結(jié)果的影響 考察不同色譜柱（Agilent HP-5、Agilent DB-FFAP）對分離效果的影響，結(jié)果表明2種色譜柱理論塔板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，測定結(jié)果的RSD均小于1.0%，表明2種色譜柱均可用于砂仁葉油中β-蒎烯和β-丁香烯測定。

2.10.3 不同操作者影響 由3個不同操作者在同一實驗室采用同一設(shè)備進(jìn)行砂仁葉油中β-蒎烯和β-丁香烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，測定結(jié)果的RSD小于2%，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.11 含量測定精密稱取砂仁葉油80 mg 6份，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取上述供試品溶液各1 μL，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果砂仁葉油β-丁香烯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.16%，β-蒎烯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.28%。（見表2）

表2 砂仁葉油含量測定結(jié)果（%）

3 討 論

中藥砂仁一般以果實入藥，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效[12-13]，其主要的功效成分為砂仁揮發(fā)油，具有抗?jié)儭⒋龠M(jìn)胃腸蠕動、胃腸保護(hù)等藥理作用[14-15]。砂仁葉油具有與砂仁揮發(fā)油類似功效，臨床上曾用于治療消化性潰瘍、急性腸胃炎、惡心嘔吐、急慢性肝炎及手術(shù)等引起的腹脹、腹痛等，單方及復(fù)方制成香砂六君子丸均有療效[5,16]。砂仁葉油臨床單方應(yīng)用具有與砂仁相似的功效，其止嘔作用優(yōu)于止痛作用，并且其止痛作用優(yōu)于砂仁[5,17]。然而，由于產(chǎn)地不同，造成砂仁葉油化學(xué)成分組成及含量存在一定的差異，給臨床應(yīng)用造成一定的安全隱患[7]。研究發(fā)現(xiàn)，砂仁葉油中含有的β-丁香烯與β-蒎烯具有抗菌、消炎、止咳化痰等功效[8-11]，可作為砂仁葉油質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。本研究建立了砂仁葉油中β-丁香烯與β-蒎烯的含量測定方法，結(jié)果表明，該方法的專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、平均回收率及定量限等均符合《中華人民共和國藥典》要求，可作為砂仁葉油質(zhì)量控制的檢測方法。