小檗堿對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌模型小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路的作用研究

謝育霞，姚志雪，黃文緋，曹羅元

（1.寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院，福建 寧德 352100；2.寧德市閩東醫(yī)院，福建 寧德 352000）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其發(fā)病率和死亡率均高，其中85%的患者患有非小細(xì)胞肺癌[1]。肺癌的常規(guī)治療方法以手術(shù)、放射治療、化療和支持性護(hù)理（包括臨終護(hù)理）為主，多數(shù)患者的預(yù)后和生活質(zhì)量較差，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，易產(chǎn)生多藥耐藥，尋找新的預(yù)防和治療肺癌的藥物是當(dāng)前肺癌臨床治療亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[2-3]。小檗堿是中藥黃連的主要有效成分，研究證明，黃連除了具有抗菌、抗炎作用外，同時(shí)具有顯著的抗癌作用，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、食管癌、白血病等多種惡性腫瘤有抑制作用[4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、代謝和機(jī)體免疫應(yīng)答有著緊密的聯(lián)系，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)可能成為治療腫瘤的新途徑[5]。本研究采用烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，以PI3K/AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)探究小檗堿對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌預(yù)防作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)ICR小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0011。實(shí)驗(yàn)小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時(shí)換氣，保持12 h∶2 h光暗照明，食水不限。取血后麻醉處死全部實(shí)驗(yàn)小鼠。此實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：NDSYY-2018043。

1.2 藥物與試劑 小檗堿（上海一基實(shí)業(yè)有限公司，純度＞98%，批號(hào)：2086-83-1）；順鉑（批號(hào)：P4394）、烏拉坦（批號(hào)：P4394、U2500）（Sigma-Aldrich）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)：G1121）、中性樹膠（批號(hào)：G8590）、DAB顯色試劑盒（批號(hào)：DA1010）（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白定量試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BCA01）；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-M0232c）、癌抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-H0636c）（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；N-cadherin兔源單克隆抗體（批號(hào)：13116）、E-cadherin兔源單克隆抗體（批號(hào)：14472）、PI3K兔源單克隆抗體（批號(hào)：4249）、AKT兔源單克隆抗體（批號(hào)：4685）、磷酸化AKT（phospho-AKT，p-AKT）兔源單克隆抗體（批號(hào)：4060）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體（批號(hào)：5174）、羊抗兔二抗（批號(hào)：7074）（美國(guó)CST公司）。

1.3 主要儀器YLS-1A型多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；AE223型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；RM2245型切片機(jī)（德國(guó)徠卡）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；G:BOX型多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；TGL16MB型高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 將小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組，每組20只。除空白組外，其余各組小鼠給予烏拉坦溶液（600 mg/kg）腹腔注射，每周注射1次，持續(xù)10周，造模結(jié)束后通過(guò)直接觀察肺組織形態(tài)及肺組織病理切片確定造模是否成功，若肺組織表面出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)或肺組織HE染色切片出現(xiàn)明顯的核濃染、細(xì)胞密集增生及瘤區(qū)存在，證明造模成功[6]。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，順鉑組小鼠腹腔注射2 mg/kg順鉑，每周3次，小檗堿高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予150、100、50 mg/（kg·d）的小檗堿，空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，所有小鼠連續(xù)給藥19周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 生理指標(biāo)記錄與樣本采集 實(shí)驗(yàn)期間記錄各組小鼠的體質(zhì)量、自主活動(dòng)情況（使用小動(dòng)物自主活動(dòng)儀測(cè)出的5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)次數(shù)），每?jī)芍?次。給藥至第19周時(shí)，對(duì)小鼠摘眼球取血，血清在4℃冰箱中靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，置-80℃環(huán)境中保存；取小鼠肺組織，生理鹽水清洗至無(wú)血絲，計(jì)算肺癌發(fā)生率和肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并取平均值（肺癌發(fā)生率=荷瘤鼠數(shù)/檢測(cè)鼠數(shù)×100%；肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)=檢測(cè)鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)總和/檢測(cè)鼠數(shù)）。

1.6.2 HE染色檢測(cè)肺組織病理變化 取小鼠肺組織，置4%多聚甲醛中固定48h，清洗后置于不同濃度的酒精中梯度脫水、制作肺組織蠟塊并作組織切片（厚度為4 μm）。組織切片置于載玻片上，使用試劑盒進(jìn)行HE染色，封片后置于顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.6.3 ELISA法檢測(cè)血清CEA和CA125含量 取待測(cè)血清加入反應(yīng)孔，每孔100 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃孵育90 min，棄掉孔內(nèi)液體，加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄掉孔內(nèi)液體，洗滌3次，加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min后棄掉孔內(nèi)液體，洗滌5次，加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μL終止液，450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組小鼠血清CEA、CA125的含量。

1.6.4 免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平 肺組織樣本的采集和病理切片的制作同“1.6.2”。肺組織切片在二甲苯中脫蠟，置于梯度濃度的乙醇溶液中復(fù)水，隨后進(jìn)行修復(fù)抗原、封閉、4℃孵育一抗12 h，37℃孵育二抗0.5 h，沖洗后加DAB顯色液，蘇木精染細(xì)胞核，最后脫水、封片，置于顯微鏡下觀察。

1.6.5 免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測(cè)PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平 將小鼠肺組織剪碎后冰上研磨，離心取沉淀，沉淀中加入裂解液，提取肺組織蛋白，測(cè)定蛋白的濃度，隨后進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后置于PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶2 000）和p-AKT（1∶1 000）兔源一抗稀釋液中，4℃環(huán)境下孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗，37℃環(huán)境下加入羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育2 h，清洗后用加ECL發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0作圖。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較6組小鼠的體質(zhì)量均增加，模型組和順鉑組呈前期體質(zhì)量增加，后期呈緩慢下降趨勢(shì)；與模型組比較，小檗堿高、中、低劑量組小鼠體質(zhì)量均增加，以小檗堿中劑量組的小鼠體質(zhì)量增加最顯著；除空白組外，其余各組小鼠的自主活動(dòng)均呈下降趨勢(shì)，與模型組比較，小檗堿中劑量組小鼠自主活動(dòng)下降較少，趨于穩(wěn)定，以上指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見(jiàn)圖1～2）

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較±s，n=20）

圖2 各組小鼠自主活動(dòng)比較，n=20）

2.2 各組小鼠肺癌發(fā)生率和肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較 順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)均低于模型組（P＜0.05）；小檗堿中、低劑量組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)均高于順鉑組（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較

表1 各組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較

注：與模型組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）肺癌發(fā)生率（%）肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)（個(gè)）空白組 20 - - -模型組 20 - 100 36.00±2.21順鉑組 20 2 33.12±1.45a 8.10±1.58a小檗堿高劑量組 20 150 32.25±1.02a 8.31±1.79a小檗堿中劑量組 20 100 45.36±1.22a b 15.66±2.08a b小檗堿低劑量組 20 50 63.67±1.51a b 19.14±2.07a b

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)比較 空白組小鼠肺組織完好，無(wú)增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)較多核濃染、細(xì)胞密集增生現(xiàn)象，肺組織腫脹，肺泡正常形態(tài)消失，存在大面積瘤區(qū)；順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織形態(tài)有明顯改善，肺組織結(jié)構(gòu)基本清晰，較少出現(xiàn)細(xì)胞核密集增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，不同劑量小檗堿的作用呈明顯劑量依賴性。（見(jiàn)圖3）

圖3 各組小鼠肺組織病理變化情況（HE，×400）

2.4 各組小鼠血清CEA和CA125含量比較 模型組小鼠血清CEA和CA125含量均高于空白組（P＜0.05）；順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠血清CEA和CA125含量均低于模型組（P＜0.05），小檗堿中、低劑量組小鼠血清CEA和CA125含量均高于順鉑組（P＜0.05），小檗堿高劑量組小鼠血清CEA和CA125的含量與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組小鼠血清CEA和CA125含量比較（x±s）

2.5 各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比升高（P＜0.05），且呈明顯劑量依賴性。與順鉑組比較，小檗堿中、低劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表3、圖4）

圖4 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較（免疫組化，×400）

表3 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較s，%）

表3 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）N-cadherin E-cadherin空白組 20 - 5.36±1.12 71.15±4.27模型組 20 - 65.26±3.57a 8.27±1.21a順鉑組 20 2 10.19±1.56a b 63.24±3.96a b小檗堿高劑量組20 150 12.45±2.14a b 69.24±4.18a b小檗堿中劑量組20 100 26.77±2.89a b c 40.58±3.17a b c小檗堿低劑量組20 50 42.84±3.11a b c 21.91±1.93a b c

2.6 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。小檗堿中、低劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于順鉑組（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖5、表4）

圖5 各組小鼠肺組織中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)Western blotting圖

表4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）PI3K AKT p-AKT空白組 20 - 0.18±0.04 0.15±0.06 0.16±0.05模型組 20 - 0.95±0.09a 0.98±0.10a 0.99±0.12a順鉑組 20 2 0.25±0.04a b 0.24±0.04a b 0.25±0.03a b小檗堿高劑量組20 150 0.26±0.07a b 0.26±0.06a b 0.29±0.04a b小檗堿中劑量組20 100 0.45±0.05a b c 0.43±0.05a b c 0.49±0.07a b c小檗堿低劑量組20 50 0.69±0.07a b c 0.82±0.09a b c 0.85±0.09a b c

3 討 論

目前，肺癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥，惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易產(chǎn)生耐藥性，西醫(yī)療法可在一定程度上殺傷癌細(xì)胞，但其不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后，因此，尋找有效的肺癌預(yù)防與治療藥物是當(dāng)前肺癌臨床研究的關(guān)鍵[7-8]。研究顯示，多種中藥活性成分具有較好的抗腫瘤作用[9-12]。小檗堿是一種源于黃連的生物堿，已有多項(xiàng)研究證明小檗堿具有顯著的抗癌活性，然而小檗堿對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌的作用及機(jī)制仍有待闡明[13-14]。

本研究建立了烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，結(jié)果顯示，與模型組比較，小檗堿可顯著改善肺癌小鼠的生存質(zhì)量，降低烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌發(fā)生率和肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。其中，模型組，順鉑組和小檗堿高、低劑量組小鼠出現(xiàn)飲食減少，毛色無(wú)光澤，精神萎靡，自主活動(dòng)下降的情況，而小檗堿中劑量組未出現(xiàn)此類現(xiàn)象，可能的原因是中劑量小檗堿為小鼠能夠適應(yīng)的最佳治療劑量，在該劑量下，小鼠的生存質(zhì)量最佳，肺癌發(fā)生率和肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)能夠被顯著降低。肺組織病理切片結(jié)果顯示，小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本清晰，較少產(chǎn)生核濃染、核畸變等癌變現(xiàn)象，血清CEA、CA125的含量顯著降低，且高劑量小檗堿作用與順鉑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明小檗堿可抑制烏拉坦的誘癌作用。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程為腫瘤發(fā)生侵襲和遷移的一個(gè)特征，出現(xiàn)EMT轉(zhuǎn)化之后腫瘤細(xì)胞往往發(fā)生原位擴(kuò)散，侵襲進(jìn)入淋巴管和血管進(jìn)而出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，小檗堿可顯著減少肺組織中N-cadherin蛋白表達(dá)水平，增加E-cadherin蛋白表達(dá)水平，抑制烏拉坦誘導(dǎo)肺癌EMT過(guò)程，其作用呈顯著劑量依賴性，小檗堿高劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白和E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量與順鉑組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這提示小檗堿具有良好的肺癌預(yù)防作用，可抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。PI3K/AKT信號(hào)通路是一種密切參與到細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、運(yùn)動(dòng)、代謝和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，同樣也參與到了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，幾乎所有人類和動(dòng)物腫瘤疾病中均發(fā)現(xiàn)了其被活化的現(xiàn)象[16-17]。PI3K/Akt信號(hào)通路主要通過(guò)其上游和下游的諸多分子來(lái)調(diào)控多種細(xì)胞生物過(guò)程，如PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/NF-κB等信號(hào)通路已被證明與腫瘤的增殖侵襲密切相關(guān)[18]。MENG X等[19]研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過(guò)干擾PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可以誘導(dǎo)凋亡和自噬，從而可以作為治療難治性甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點(diǎn)。DUAN Y F等[20]通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖可通過(guò)抑制PI3K/Akt相關(guān)蛋白的磷酸化產(chǎn)生對(duì)肝癌的抵抗作用。與上述研究一致，本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織PI3K/AKT信號(hào)通路被激活，PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)被顯著上調(diào)，而小檗堿則可顯著降低肺癌小鼠肺組織中PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性，小檗堿高劑量組與順鉑組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明小檗堿可抑制肺癌小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路的活化。

綜上所述，小檗堿能夠改善烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌模型小鼠生存質(zhì)量和肺組織病理變化，降低肺癌小鼠血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125水平，抑制肺癌EMT過(guò)程，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化有關(guān)。