承逆縮脾顆粒制備工藝研究*

邱曉年，熊 丹，蔣翠平，陶葉琴，蔡小霞，袁 淼，張 鵬，謝宗明

（瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300）

肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌。西藥有一定療效，但存在耐藥性、毒副作用大、易復(fù)發(fā)等缺陷。中醫(yī)藥治療在改善患者臨床癥狀、恢復(fù)肝功能、保肝降酶、調(diào)節(jié)免疫及抗肝臟纖維化等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，且藥物副作用少，安全可靠[1-2]。承逆縮脾湯是我院王書杰醫(yī)生用于治療肝炎、肝硬化，中醫(yī)辨證為肝脾血瘀型肝病的自擬經(jīng)驗方，已在臨床應(yīng)用數(shù)十年，療效顯著。承逆縮脾湯由山藥、蒼術(shù)、醋鱉甲、柴胡、陳皮、枳殼、赤芍、大黃、厚樸、瞿麥、萹蓄、三棱、莪術(shù)及炙甘草組成，功能在于養(yǎng)臟通腑、軟堅散積、健脾疏肝、活血利水。用于肝脾血瘀所致脅肋刺痛，痛有定處，腹脹，肝脾腫大，蜘蛛痣，肝掌，倦怠乏力，惡心嘔吐，納差，煩躁易怒，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑、瘀點(diǎn)，脈弦澀或澀等肝硬化有上述見證者。承逆縮脾湯方以“養(yǎng)脾”為前提，采納平胃散（蒼術(shù)、厚樸、陳皮）健脾，脾得健運(yùn)而能化濕行水；四逆散（柴胡、白芍、枳殼）疏肝，肝氣得疏泄而理氣運(yùn)水，輔以大劑量山藥、鱉甲滋補(bǔ)肝腎，固本培元；以通腑為要務(wù)，瞿麥、萹蓄通利小便排出水飲，小承氣湯（大黃、厚樸）通腹瀉濁，濁邪可出，清氣得以上升營養(yǎng)臟腑；三棱、莪術(shù)、赤芍化瘀通絡(luò)，改善局部脈絡(luò)，以致于氣血運(yùn)行通暢。通過“臟腑辨證”聯(lián)合“氣血津液辨證”，改善慢性乙肝患者的臨床癥狀，提高體質(zhì)，增強(qiáng)抗病力，促進(jìn)免疫系統(tǒng)清除病毒，促進(jìn)疾病恢復(fù)。

本研究采用水提取工藝，以芍藥苷、橙皮苷轉(zhuǎn)移率和干浸膏率為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝，并對成型工藝的輔料種類、用量進(jìn)行考察，確定最佳成型工藝，以期為該制劑開發(fā)研究和質(zhì)量控制提供科學(xué)的試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器JY-202型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；HWS-26型水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BSA224SCW型電子天平（德國賽多利斯）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GENIUS4K型低速離心機(jī)（長沙鑫奧儀器儀表有限公司）；LC-10AT型高效液相色譜儀（島津）。

1.2 試藥 麩炒蒼術(shù)（批號：190501）、厚樸（批號：190301）、陳皮（批號：190301）、三棱（批號：190401）、莪術(shù)（批號：190801）、枳實（批號：181201）、醋柴胡（批號：190101）、白芍（批號：181201）、山藥（批號：190101）、大黃（批號：180901）、醋鱉甲（批號：190801）、炙甘草（批號：181201）、瞿麥（批號：190501）、萹蓄（批號：181201）均購自湖南省金實堂中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定均為《中華人民共和國藥典》2015年版（一部）收載品種；芍藥苷對照品、橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201943，10721-201818）；承逆縮脾顆粒溶液（自制）；色譜乙腈（德國默克股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備工藝的設(shè)計 為了確定承逆縮脾顆粒的制備工藝和生產(chǎn)條件，筆者結(jié)合該方中藥的性質(zhì)特征和前期研究基礎(chǔ)，擬定該方的提取工藝路線為蒼術(shù)、厚樸、陳皮、三棱、莪術(shù)、枳實6味藥水蒸氣蒸餾法提取[3-7]，藥液、藥渣和揮發(fā)油另存?zhèn)溆?；蒼術(shù)等6味藥渣與其余醋柴胡、白芍、山藥、大黃、醋鱉甲、甘草、瞿麥、萹蓄8味藥混合水提；揮發(fā)油提取備用藥液與水提取液混合，減壓濃縮，真空干燥，粉碎；加入輔料和潤濕劑，進(jìn)行濕法制粒、整粒，噴入揮發(fā)油，制備成顆粒劑[8]。承逆縮脾顆粒的制備工藝設(shè)計流程見圖1。

圖1 制備工藝設(shè)計流程圖

2.2 揮發(fā)油的提取工藝 揮發(fā)油提取采用單因素試驗法，參照《中華人民共和國藥典》規(guī)定的揮發(fā)油測定法甲法，以揮發(fā)油得率為評價指標(biāo)，對影響揮發(fā)油提取的浸泡時間、藥材粉碎度和提取時間、加水量進(jìn)行考察。

2.2.1 浸泡時間考察 稱取蒼術(shù)、厚樸、陳皮、三棱、莪術(shù)、枳實6味藥材共6份，置于3 000 mL燒杯中，各加10倍量水沒過藥材，密閉，室溫放置。分別浸泡10、20、30、40、50、60 min后，紗布過濾，稱取濕藥材的質(zhì)量，按下式計算各時間點(diǎn)藥材的吸水率，結(jié)果見表1。藥材的吸水率隨時間的延長而增高，30 min以后吸水率增高趨于平緩，60 min以后吸水率增高不明顯，說明藥材吸水已經(jīng)達(dá)到飽和。從生產(chǎn)實際出發(fā)，既要節(jié)省時間，又要充分浸泡，最終選擇藥材浸泡時間為30 min。

表1 浸泡時間考察試驗結(jié)果

2.2.2 粉碎度和提取時間考察 稱取蒼術(shù)、厚樸、陳皮、三棱、莪術(shù)、枳實6味藥材共2份。一份直接加10倍量水浸泡0.5 h，蒸餾7 h，于1、2、3、4、5、6、7 h記錄提油量；另一份將蒼術(shù)、厚樸、三棱、莪術(shù)、枳實5味藥材飲片粉碎成粗粉，然后與陳皮混合，其他操作同上。按下式計算揮發(fā)油得油率，結(jié)果見表2。在相同提取條件下，藥材粗粉組的揮發(fā)油提油量明顯高于藥材飲片組，且隨著時間的延長揮發(fā)油含量增多，當(dāng)提取時間達(dá)5 h時，藥材粗粉提油量含量幾乎無變化。綜合考慮節(jié)省能耗等實際因素，選擇藥材粗粉蒸餾提取5 h。

表2 揮發(fā)油提取時間和粉碎度考察結(jié)果（mL/g）

2.2.3 加水量考察 按處方量取三棱、莪術(shù)、陳皮、蒼術(shù)、厚樸、枳實藥材4份，分別加6、8、10、12倍量的水浸泡0.5 h，蒸餾5 h，記錄提油量，計算揮發(fā)油的提取率，結(jié)果見表3，當(dāng)加水量為10倍時，提取率增加不明顯，提油量達(dá)0.82 mL，達(dá)到12倍量所得揮發(fā)油（0.83 mL）的98.80%，基本完整提取揮發(fā)油，考慮到節(jié)省能耗等實際因素，將加水量定為10倍量。

表3 揮發(fā)油提取加水量考察結(jié)果

2.2.4 揮發(fā)油提取工藝的驗證 按單因素篩選試驗確定的各項最佳條件驗證3批含油飲片，結(jié)果見表4，驗證結(jié)果與試驗結(jié)果相接近，說明該工藝基本穩(wěn)定可靠。因此，優(yōu)選揮發(fā)油的最佳提取工藝為：將蒼術(shù)、厚樸、三棱、莪術(shù)、枳實5味藥材飲片粉碎成粗粉，然后與陳皮混合，加10倍量水，浸泡0.5 h，提取時間為5 h。

表4 揮發(fā)油提取工藝的驗證試驗

2.3 提取工藝研究

2.3.1 溶液的配制 芍藥苷對照品溶液的配制：精密稱定芍藥苷適量，加50%甲醇溶液定容，制成62 μg/mL對照品溶液。供試品溶液的制備：分別吸取正交試驗項目下9份供試樣品各20 mL，離心，過0.22 μm的微孔濾膜，得供試品樣液。芍藥苷陰性對照品溶液的配制：按照承逆縮脾顆粒的處方比例，制備缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。橙皮苷對照品溶液的配制：精密稱定橙皮苷適量，加甲醇溶液定容，制成0.416 mg/mL對照品溶液。橙皮苷陰性對照品溶液的配制：按照承逆縮脾顆粒的處方比例，制備缺陳皮和枳實的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.2 色譜條件

2.3.2.1 芍藥苷色譜條件 色譜柱：InertsilODS-3C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），按表5進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表5 芍藥苷梯度洗脫程序表

2.3.2.2 橙皮苷色譜條件InertsilODS-3C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），按表6進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表6 橙皮苷梯度洗脫程序表

2.3.3 正交試驗 取同一批承逆縮脾顆粒樣品，以浸泡時間（A）、液料比（B）和提取時間（C）為3個不同考察因素，設(shè)計3個不同水平，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗，因素水平見表7。以芍藥苷、橙皮苷轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)（綜合評分=干浸膏得率/干浸膏得率最大值×0.4+芍藥苷轉(zhuǎn)移率/芍藥苷轉(zhuǎn)移率最大值×0.3+橙皮苷轉(zhuǎn)移率/橙皮苷轉(zhuǎn)移率最大值×0.3）。試驗結(jié)果見表8～9。結(jié)果表明A、B、C因素差異均不顯著（P＞0.05），極差C＞B＞A（R=0.146＞0.123＞0.100），故實驗室結(jié)果的主要順序為C＞B＞A，即浸泡時間對綜合評分的影響最大，影響最小的是加水倍量，綜合生產(chǎn)實際情況，選擇最佳提取工藝為A3B3C3，即加10倍量水浸泡1 h提取1.5 h。

表7 水提正交試驗因素水平表

表8 正交試驗設(shè)計表及結(jié)果

表9 方差分析表

2.3.4 工藝驗證 為考察承逆縮脾顆粒優(yōu)選提取工藝的可靠性和穩(wěn)定性，按照最佳優(yōu)選方案分別對3批承逆縮脾方水提液進(jìn)行驗證，結(jié)果見表10。芍藥苷含量分別為0.96、0.94、0.97mg/g，橙皮苷含量分別為1.05、1.03、1.02 mg/g，出膏率分別為11.04%、10.87%和11.17%，符合預(yù)期設(shè)計。

表10 3批承逆縮脾顆粒驗證結(jié)果

2.4 成型工藝研究

2.4.1 填充劑種類的篩選 本品為干浸膏制粒，而干浸膏的吸濕性強(qiáng)，對制劑的制備和貯存都存在較大影響，為了降低吸濕性，考慮在制粒過程中加入適量的輔料。鑒于蔗糖口感純正、溶化性好，且便宜易得，既可作甜味劑，又可作填充劑，故首選蔗糖。糊精雖然口感較差，但防潮性好，價格便宜，且可溶于熱水，可適當(dāng)使用。故本品選用蔗糖、糊精作為成型輔料[9-10]。

2.4.2 輔料配比的篩選 按比例稱取浸膏粉與輔料的質(zhì)量比為1∶1.5，蔗糖和糊精質(zhì)量比為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，潤濕劑為85%乙醇，用量為30%，制軟材，過14目篩制粒，約60℃干燥，12目篩整粒。結(jié)果見表11，輔料配比為3∶1時，軟材適中，顆粒性狀和溶化性好，顆粒合格率高，故選擇輔料蔗糖和糊精的配比為3∶1。

表11 不同輔料配比的制粒結(jié)果

2.4.3 浸膏與輔料比例的考察 按比例稱取浸膏粉與輔料，擬定蔗糖和糊精比例為3∶1，按浸膏粉與輔料的質(zhì)量比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5及1∶2，潤濕劑為85%乙醇，用量為30%，制軟材，過14目篩制粒，約60℃干燥，12目篩整粒，以軟材情況、顆粒性狀、溶化性、顆粒合格率為評價指標(biāo)，結(jié)果見表12。浸膏與輔料的配比為1∶1.5時，軟材適中，顆粒性狀和溶化性好，顆粒合格率高，故選擇浸膏與輔料的配比為1∶1.5。

表12 不同浸膏和輔料配比的制粒結(jié)果

2.4.4 潤濕劑濃度選擇 取適量浸膏粉與輔料，擬定蔗糖和糊精比例為3:1，浸膏粉與輔料的質(zhì)量比為1:1.5，按潤濕劑為95%、90%、85%、80%乙醇，用量為30%，制軟材，過14目篩制粒，約60℃干燥，12目篩整粒，以軟材情況、顆粒性狀、溶化性、顆粒合格率為評價指標(biāo)，結(jié)果見表13。潤濕劑濃度為85%時，軟材適中，顆粒性狀和溶化性好，顆粒合格率高，故選擇潤濕劑濃度為85%。

表13 不同濃度潤濕劑的制粒結(jié)果

2.4.5 潤濕劑用量選擇 取適量浸膏粉與輔料，擬定蔗糖與糊精質(zhì)量比為3∶1，干浸膏粉與輔料比為1∶1.5，潤濕劑為85%乙醇，按用量為10%、20%、30%、40%，制軟材，過14目篩制粒，約60℃干燥，12目篩整粒，以軟材情況、顆粒性狀、溶化性、顆粒合格率為評價指標(biāo)，結(jié)果見表14。潤濕劑用量為30%時，軟材適中，顆粒性狀和溶化性好，顆粒合格率高，故選擇潤濕劑用量為30%。

表14 不同潤濕劑用量的制粒結(jié)果

2.4.6 濕顆粒干燥溫度的考察 取適量浸膏粉與輔料，擬定蔗糖與糊精質(zhì)量比為3∶1，干浸膏粉與輔料質(zhì)量比為1∶1.5，潤濕劑為85%乙醇，用量為30%，制軟材，過14目篩制粒，對濕顆粒選用不同溫度進(jìn)行干燥，干燥1 h，考察干燥情況。由于本品為干浸膏中加入糖粉制粒，干燥溫度過高，易黏結(jié)成塊，使顆粒質(zhì)地變硬，影響整粒。當(dāng)干燥溫度為50～60℃時，干顆粒水分合適，顆粒質(zhì)地適中，易整粒，故選擇干燥溫度為50～60℃。（見表15）

表15 濕顆粒干燥溫度試驗結(jié)果

2.5 工藝驗證 承逆縮脾顆粒由麩炒蒼術(shù)、厚樸、陳皮、枳實、三棱、莪術(shù)、醋柴胡、白芍、山藥、大黃、醋鱉甲、甘草、瞿麥、萹蓄共14味中藥組成?，F(xiàn)對本研究的制備工藝進(jìn)行3批中試放大生產(chǎn)，驗證工藝的可行性、穩(wěn)定性。麩炒蒼術(shù)、厚樸、陳皮、枳實、三棱、莪術(shù)6味藥材，加10倍量水，浸泡0.5 h，水蒸氣蒸餾5 h，收集揮發(fā)油；將蒸餾后的藥渣與其余醋柴胡等8味藥材加10倍量水，浸泡1 h，煎煮1.5 h，濾過，濾液與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮至相對密度約1.25（60℃）的清膏，真空干燥，加入輔料，混勻，14目篩濕法制粒，50～60℃干燥，12目篩整粒，取揮發(fā)油噴于顆粒中，混勻，即得。結(jié)果如表16～17所示，3批中試生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、可行，檢驗結(jié)果均符合規(guī)定。

表16 3批中試生產(chǎn)結(jié)果

表17 3批中試檢驗結(jié)果

2.6 顆粒臨界相對濕度的測定 本品為干浸膏加輔料制粒，吸濕性較強(qiáng)，對其臨界相對濕度進(jìn)行考察，為控制生產(chǎn)和貯存過程中環(huán)境濕度提供依據(jù)。將飽和鹽溶液放入干燥器中，將干燥器放入25℃的生化培養(yǎng)中平衡24 h，此時干燥器內(nèi)相對濕度依次為33.00%、42.80%、57.70%、75.30%、84.30%、92.50%、100.00%[10]。分別用已干燥至恒定質(zhì)量的稱量瓶精密稱定顆粒，在上述干燥器內(nèi)放置7 d，取出后精密稱定，計算平均吸濕率（n=3）。以相對濕度為橫坐標(biāo)，平均吸濕率為縱坐標(biāo)作曲線，曲線兩端變化最快的切線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)即為承逆縮脾顆粒的CRH。結(jié)果見表18、圖2，承逆縮脾顆粒內(nèi)容物的臨界相對濕度CRH為71%，即填充、分裝及貯存時，環(huán)境濕度必須控制在71%以下，以減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性的影響。

表18 承逆縮脾顆粒臨界相對濕度試驗結(jié)果

圖2 承逆縮脾顆粒臨界相對濕度曲線

2.7 制備工藝和日服用量的確定 最后確定的承逆縮脾顆粒制備工藝為：麩炒蒼術(shù)、厚樸、陳皮、枳實、三棱、莪術(shù)6味藥材，加10倍量水，浸泡0.5 h，水蒸氣蒸餾5 h，收集揮發(fā)油；將蒸餾后的藥渣與其余醋柴胡等8味藥材加10倍量水，浸泡1 h，煎煮1.5 h，濾過，濾液與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮至相對密度約1.25（60℃）的清膏，真空干燥，粉碎，加入1.5倍干膏粉的蔗糖和糊精（3∶1），混勻，14目篩濕法制粒，50～60℃干燥，取揮發(fā)油噴于顆粒中，混勻，12目篩整粒，即得。

該處方日服生藥材劑量為149 g，參考前期研究，藥材的出膏率約為10.96%，即每日服約16.3 g干浸膏，浸膏粉與輔料比約為1∶1.5，即加入輔料的量為24.5 g，日服成品量為41 g，若按3次/d，一次一袋的服用量，擬定每袋規(guī)格為15 g。

3 討 論

承逆縮脾顆粒用于治療肝炎、肝硬化，能夠有效改善肝硬化失代償期患者肝功能及凝血功能[11]。由于肝病的治療為一個循序漸進(jìn)的過程，服藥時間較長，而湯劑雖療效顯著。但需臨用新制，服用量大，不易儲存，不便攜帶，不方便患者使用。顆粒劑是在湯劑基礎(chǔ)上進(jìn)一步濃縮、精制而得，保留湯劑原有性質(zhì)，既保持了湯劑吸收快、作用迅速的優(yōu)點(diǎn)，又克服了湯劑易霉變，服用、貯存不便等缺點(diǎn)[12]。因此，本研究將該方制備成顆粒劑，以充分發(fā)揮藥效并方便患者使用。

該復(fù)方中的平胃散和四逆散在方中起主要治療作用，四逆散中白芍的芍藥苷通過抗氧化應(yīng)激和激活Nrf2，上調(diào)抗氧化蛋白的基因表達(dá)，降低肝纖維化程度[13]。張曄[14]研究表明，芍藥苷通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，減輕二甲基亞硝胺引起的大鼠肝纖維化，提高肝纖維化大鼠生存率。白芍總苷可以抑制免疫性肝損傷小鼠血清NO和TNF-α的產(chǎn)生，恢復(fù)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖，改善肝臟病理損傷程度[15]。平胃散中的陳皮和枳實中均含有橙皮苷，橙皮苷可通過有效降低TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和升高Smad7在HSC中的表達(dá)，從而對TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，發(fā)揮抗大鼠肝纖維化的作用[16]。橙皮苷對脂肪乳劑灌胃誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠有明顯的保護(hù)作用[17]。二者均對肝臟有明顯的藥理活性，因此選擇芍藥苷和橙皮苷作為含量測定的指標(biāo)成分。

在提取工藝研究中，通過查閱文獻(xiàn)[3-7]，綜合考慮處方中各藥味的理化性質(zhì)與治療肝炎的藥理活性成分，且原方為水煎服用，療效確切，故選定為水提取工藝，在盡量保留湯劑原有性質(zhì)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化制備工藝，對蒼術(shù)等含揮發(fā)油較多的6味藥材進(jìn)行水蒸氣蒸餾，提取揮發(fā)油，盡可能的保留藥物的有效成分，對柴胡等其余8味藥材，以芍藥苷轉(zhuǎn)移率、橙皮苷轉(zhuǎn)移率和干膏得率為考察指標(biāo)，采用正交試驗法進(jìn)行提取工藝篩選，確定最優(yōu)提取工藝為加10倍量水，浸泡1 h，提取1.5 h，再經(jīng)工藝驗證證明該提取工藝的可靠性、穩(wěn)定性，為中試生產(chǎn)提供依據(jù)。根據(jù)前期試驗經(jīng)驗、現(xiàn)有設(shè)備條件，確定最終濃縮工藝為減壓濃縮至相對密度約為1.25（60℃）；干燥工藝為真空干燥（0.06～0.07 Mpa，60℃）。

在成型工藝研究中，由于中藥浸膏粉均具有較強(qiáng)的吸濕性，故直接用浸膏粉進(jìn)行制粒具有一定的難度，加入適當(dāng)?shù)妮o料降低吸濕性進(jìn)而便于制粒。本試驗經(jīng)過篩選，確定選用糊精和糖粉經(jīng)適當(dāng)配比作為輔料，且成型容易，在制粒過程中，蔗糖與糊精質(zhì)量比為3∶1，干浸膏粉與輔料質(zhì)量比為1∶1.5，潤濕劑為85%乙醇，濕顆粒干燥溫度控制在50～60℃，所得顆粒劑成型性好、不易粘連，溶化速度快且靜置后無沉淀，為其后期的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)；臨界相對濕度是藥物吸濕性增加的臨界值，根據(jù)它控制生產(chǎn)過程中的環(huán)境濕度，成品的臨界相對濕度（RCH）約為71%，在生產(chǎn)和保存中，應(yīng)將環(huán)境濕度控制在71%以下，以減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性的影響。通過3批中試生產(chǎn)驗證該制備工藝的可行性、穩(wěn)定性，為本品的批量生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了科學(xué)的試驗依據(jù)。