杜仲治療股骨頭壞死分子機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

黎永華，尹 恒，譚仁霆，黃世福，邱金龍

（1.儋州市中醫(yī)醫(yī)院，海南 儋州 571700；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是好發(fā)于中青年的骨科難治性疾病，目前認為其發(fā)病主要與髖部外傷、酗酒、糖皮質(zhì)激素使用等因素相關(guān)[1]。股骨頭內(nèi)血流障礙，造成局部骨細胞、骨小梁壞死，逐漸發(fā)展并導(dǎo)致股骨頭生物力學(xué)性能失衡，發(fā)生塌陷，髖關(guān)節(jié)功能障礙，嚴重影響患者身心健康[2]。人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是ONFH晚期有效的治療方式，但遠期面臨關(guān)節(jié)翻修問題[3]。中醫(yī)藥治療早中期股骨頭壞死的療效肯定，并在緩解疼痛、改善功能、防止塌陷進展等方面開展了較多研究[4]。

股骨頭壞死屬于中醫(yī)學(xué)“骨蝕”范疇，其病因病機目前尚無統(tǒng)一觀點，多認為其發(fā)病與“虛”“痰”“瘀”等因素相關(guān)，主要辨證為肝腎虧虛、氣血虧虛、痰瘀阻絡(luò)、氣滯血瘀等證型[5-6]，補肝腎、化痰濁、行氣血等治法貫穿于股骨頭壞死的中醫(yī)藥治療。杜仲有補肝腎、強筋骨之功，在股骨頭壞死的中醫(yī)藥治療中被廣泛應(yīng)用[7-9]。現(xiàn)代藥理研究認為杜仲提取物能抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化，改善骨壞死內(nèi)部微循環(huán)[10-11]，但杜仲治療ONFH的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機制等目前尚未明確。逐一對杜仲具體成分進行實驗驗證必將消耗大量時間和精力。本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，篩選預(yù)測杜仲治療股骨頭壞死的活性成分及作用靶標，并對靶標進行富集分析，建立成分-疾病-靶標網(wǎng)絡(luò)，探究其潛在作用機制，旨在為后續(xù)實驗研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 杜仲活性成分與作用靶點預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)成分分析平臺（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/）對杜仲的活性成分及其對應(yīng)作用靶點進行預(yù)測。

BATMAN-TCM是由北京蛋白組學(xué)研究中心開發(fā)的中藥分子機理生物信息學(xué)分析工具，其主要功能包括：（1）中藥成分對應(yīng)靶標基因的預(yù)測；（2）靶標基因的生物學(xué)功能分析；（3）可視化分析中藥成分-靶標基因-生物學(xué)功能網(wǎng)絡(luò)；（4）對比分析多個中藥。BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫建立中藥成分-靶標基因互作預(yù)測模型，系統(tǒng)分析中藥成分三維化學(xué)分子結(jié)構(gòu)，將其與經(jīng)臨床或?qū)嶒烌炞C的藥物小分子交互對比，預(yù)測中藥成分潛在的作用靶標基因，不局限于已知的中藥成分作用靶標基因關(guān)系，以獲得更加全面的中藥成分作用關(guān)系數(shù)據(jù)，幫助全面系統(tǒng)理解中藥的多成分-多靶點分子作用機制[12]。

在BATMAN-TCM中以“Du Zhong”（杜仲）為檢索詞，“Herb”（草藥）為輸入格式，檢索Score Cutoff設(shè)置為20，以P＜0.05為有效靶點預(yù)測置信區(qū)間，檢索獲得杜仲的活性成分及其作用靶點信息，保存數(shù)據(jù)整理備用。1.2股骨頭壞死疾病靶標基因預(yù)測 分別在人類基因組數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）、基因關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（GAD，https://geneticassociationdb.nih.gov/）、基因?qū)W庫（Gene，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）等多個公認的匯集疾病遺傳組信息與治療靶點的在線數(shù)據(jù)庫[13]中，以“Osteonecrosis of the femoral head”或“ONFH”或“Femur Head Necrosis”為檢索詞運行檢索，預(yù)測ONFH的疾病治療靶標基因，保存數(shù)據(jù)整理備用。

1.3 杜仲活性成分-股骨頭壞死靶標基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將從BATMAN-TCM獲得的中藥杜仲活性成分作用靶點，與GeneCards、GAD、Gene等數(shù)據(jù)庫分別獲得的ONFH疾病靶標基因交集，獲得杜仲活性成分治療ONFH作用靶點。

利用蛋白互作在線工具STRING（https://string-db.org/）進行上述獲得的杜仲活性成分治療ONFH作用靶點的蛋白互作關(guān)系（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。在STRING中輸入獲得的全部靶標基因，物種限定為“Homo sapiens”（人類），運行分析，將分析結(jié)果與已獲得的杜仲活性成分對應(yīng)靶點信息匯總整理，導(dǎo)入至可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件Cytoscape 3.6.1中，通過軟件的Network Analyzer進行杜仲活性成分-股骨頭壞死靶標基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 靶標基因通路富集與基因本體論分析 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），包含大量基因組高通量測序數(shù)據(jù)，是目前公認的細胞、生物、生態(tài)系統(tǒng)功能信息數(shù)據(jù)庫，可獲取基因在各信號通路富集的信息[14]?；虮倔w論（Gene Ontology，GO），是廣泛應(yīng)用于描述基因產(chǎn)物的功能注釋與分類的系統(tǒng)，主要包括細胞組成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及生物過程（Biological Process，BP）3個部分[15]。

通過蛋白基因生物信息整合分析平臺DAVID Bioinformatics Resources 6.8[16]（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行杜仲活性成分治療ONFH靶標基因的KEGG信號通路富集與GO功能注釋分析。在DAVID在線網(wǎng)站輸入所有獲得的靶標基因，物種限定為“Homo sapiens”（人類），運行分析后下載保存數(shù)據(jù)結(jié)果。對數(shù)據(jù)進行篩選，以P＜0.05認為該富集通路或注釋功能具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲活性成分及其治療股骨頭壞死靶標基因 于BATMANTCM進行杜仲活性成分條件性檢索，最終獲得杜仲活性成分38個，包括松脂醇（Pinoresinol）、木黃酮（Genistein）、己六醇（Dulcitol）、可布酮（Kobusone）等。（見表1）

表1 杜仲活性成分

由于杜仲各活性成分化學(xué)名稱較長，故以代替名稱如DZ1等進行編號，方便后續(xù)網(wǎng)絡(luò)分析。上述38個杜仲活性成分共作用于856個疾病靶標基因，通過與GeneCards、GAD、Gene等數(shù)據(jù)庫獲得的股骨頭壞死疾病靶標基因取共交集，最終獲得杜仲活性成分治療ONFH目標靶標基因17個，包括NOS1、IL10、IL4、FGF2、PPARG、HIF1A、ABCB1、SOX9、TP53、TNF、F2、CTNNB1、BMP2、SREBF1、APOA1、TGFB1、CYP3A4。

2.2 杜仲活性成分作用靶點網(wǎng)絡(luò)可視化 將BATMAN-TCM獲得的杜仲38個活性成分及其對應(yīng)疾病作用靶點856個之間的作用關(guān)系以Excel格式導(dǎo)入至Cytoscape 3.6.1軟件中，運行Network Analyzer進行杜仲活性成分與作用靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的可視化分析。圖中黃色三角形節(jié)點分別代表杜仲38個活性成分，紫色圓形節(jié)點代表活性成分作用靶點，節(jié)點間連線代表彼此間存在作用關(guān)系，所有節(jié)點與連線共同構(gòu)成杜仲活性成分作用靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。（見圖1）

圖1 杜仲活性成分-疾病作用靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.3杜仲治療股骨頭壞死靶標基因互作網(wǎng)絡(luò)可視化 將獲得的17個杜仲治療ONFH靶標基因上傳至STRING網(wǎng)站，運行分析，將靶標基因互作關(guān)系結(jié)果保存下載，導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1中，運行Network Analyzer，使用cytoHubba插件對靶標基因進行Degree值計算，根據(jù)Degree值對各靶標基因之間的互作關(guān)系進行可視化分析。（見圖2）

cytoHubba基于網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)對靶標基因進行Degree值與連接度計算分析，以此揭示靶標基因在互作關(guān)系中的重要性與聯(lián)系強度[17]。Degree值越大，則認為該靶標基因重要性越顯著，連接度越高則認為靶標基因間互作關(guān)系越強。圖2中各圓形節(jié)點分別代表不同的靶標基因，節(jié)點顏色各不相同。靶標基因Degree值越大則節(jié)點直徑越大，其顏色越接近于暖色系，反之則Degree值越小，節(jié)點直徑越小，代表色接近冷色系。不同節(jié)點間根據(jù)聯(lián)系強度以不同顏色粗細的連線相聯(lián)系，連接度越大，連線則越粗，顏色越接近于暖色系。結(jié)果顯示，TNF、TP53、FGF2、PPARG、TGFB1依次為Degree值大小排名前5名的靶標基因，TNF與NOS1、ABCB1，TP53與CYP3A4之間存在較強的連接度。

圖2 杜仲治療股骨頭壞死靶標基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 杜仲活性成分-股骨頭壞死靶標互作網(wǎng)絡(luò)可視化 將上述獲得的38個杜仲活性成分中與17個治療ONFH靶標基因有直接作用關(guān)系的成分，與STRING獲得的靶標基因互作關(guān)系整理后導(dǎo)入至Cytoscape 3.6.1中，運行Network Analyzer，將杜仲活性成分之間作用于ONFH的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)可視化。在杜仲38個活性成分中，與股骨頭壞死靶標基因存在直接作用關(guān)系的成分有8個，分別為異麥芽糖、咖啡酸二甲醚、靈貓酮、銀松素、去氧甘草次酸、γ-谷甾醇、三十烷醇、表奎尼丁。在網(wǎng)絡(luò)圖中以內(nèi)圈的黃色三角形節(jié)點表示，外圈綠色圓形節(jié)點為17個ONFH靶標基因，節(jié)點間以連線連接表示其作用關(guān)系。（見圖3）

圖3 杜仲活性成分-股骨頭壞死靶標互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶標基因通路富集結(jié)果分析 將獲得的17個杜仲治療ONFH靶標基因上傳至DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫，運行KEGG通路富集分析，最終獲得125個富集通路，經(jīng)過檢驗統(tǒng)計篩選出104個通路有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。對這104個通路根據(jù)P值從小到大進行排序，將排名前5位的通路富集結(jié)果通過開放式通路分析軟件FunRich3.1.3[18]以柱狀圖呈現(xiàn)。圖中橫坐標展示多配體蛋白聚糖介導(dǎo)信號通路（proteoglycan syndecan-mediated signaling events）、磷脂?；嫉鞍拙厶蔷W(wǎng)絡(luò)（glypican 1 network）、凝血酶/蛋白酶激動受體信號通路（thrombin/protease activated receptor pathway）、PAR1介 導(dǎo) 凝 血 酶 信 號 通 路（PAR1-mediated thrombin signaling events）、磷脂酰肌醇聚糖信號通路（glypican pathway）5個富集的KEGG信號通路，縱坐標表示在該通路上富集的基因占總的輸入基因比例，各富集通路P值標注于柱形圖上。（見圖4）

圖4 靶標基因通路富集柱狀圖

2.6 靶標基因的基因本體論結(jié)果分析 清空DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫KEGG運行結(jié)果，繼續(xù)行靶標基因的基因本體論GO分析，將所有GO分析結(jié)果保存下載。最終共獲得196個GO功能注釋結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，獲得14個具有統(tǒng)計學(xué)差異的GO功能注釋，將此結(jié)果以可視化形式呈現(xiàn)。圖中縱坐標分別表示具有統(tǒng)計學(xué)意義的GO注釋功能，如生長因子活性（growth factor activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）等，橫坐標表示功能注釋的P值，橫縱坐標交匯節(jié)點表示各功能注釋，該功能注釋上富集的基因越大則節(jié)點越大，P值越小則其顏色越接近紅色。（見圖5）

圖5 靶標基因的基因本體論結(jié)果可視化圖

3 討 論

骨組織結(jié)構(gòu)破壞與生物力學(xué)性能失衡，是股骨頭壞死的重要表現(xiàn)，晚期將出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨破壞塌陷。保髖手術(shù)、人工髖關(guān)節(jié)置換是目前中晚期ONFH的重要治療方式[19]。中醫(yī)藥在治療早中期ONFH方面?zhèn)涫芸隙?，并仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。杜仲為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，其味甘，性溫，入肝腎經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱之“主腰脊痛，補中益精氣，堅筋骨，強志，除陰下癢濕，小便余瀝”，將杜仲列為上品。杜仲在ONFH的臨床治療中被廣泛應(yīng)用。本研究立足于杜仲治療ONFH的臨床療效，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)成分分析平臺BATMAN-TCM，基于平臺對杜仲活性成分與疾病靶標基因互作模型預(yù)測，獲得杜仲有效活性成分38個，疾病作用靶標856個。

BATMAN-TCM是功能強大的中藥分子機理生物信息學(xué)分析工具，其獨特的中藥成分分子作用靶標預(yù)測模型可幫助獲得藥物分子與未知的疾病靶標基因潛在互作關(guān)系，獲得系統(tǒng)全面的中藥分子作用靶標基因網(wǎng)絡(luò)。目前同類型研究中常用的TCMSP數(shù)據(jù)庫[20]主要基于中藥分子的藥代動力學(xué)特性如口服生物利用度等指標進行中藥活性成分的篩選，但該數(shù)據(jù)庫僅支持注冊的中草藥數(shù)據(jù)檢索，部分動物源中藥（如龜甲、鹿角等）則無法提供藥理數(shù)據(jù)分析。BATMAN-TCM提供基于中藥成分三維化學(xué)結(jié)構(gòu)的疾病作用靶標基因預(yù)測，同時收錄有更加全面的中藥單味藥、復(fù)方、單體及其靶標數(shù)據(jù)，并可在線可視化分析靶標基因的基因本體論、信號通路富集結(jié)果，功能全面。

將BATMAN-TCM預(yù)測的杜仲成分靶標基因與各人類基因組數(shù)據(jù)庫篩選獲得的ONFH疾病靶標基因相映射，最終獲得杜仲的咖啡酸二甲醚等8個活性成分與17個股骨頭壞死靶標基因存在直接作用關(guān)系。從杜仲活性成分-股骨頭壞死靶標互作網(wǎng)絡(luò)圖可知，咖啡酸二甲醚、靈貓酮、表奎尼丁等多個活性成分能作用于多個ONFH靶標基因，而TNF、TGFB1、SOX9等靶標基因能同時與多個杜仲活性成分相聯(lián)系，杜仲活性成分治療ONFH可能存在著協(xié)同作用，通過不同信號通路的不同靶點發(fā)揮共同的治療作用。

從杜仲治療ONFH的17個靶標基因互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可知，杜仲治療ONFH的機制復(fù)雜，不同靶標之間存在直接或間接的協(xié)調(diào)調(diào)控作用，TNF、TP53、FGF2、PPARG、TGFB1等是網(wǎng)絡(luò)中Degree值最高的前5位靶標，是網(wǎng)絡(luò)中的核心靶標，在ONFH疾病治療的生物學(xué)過程中發(fā)揮著多通路協(xié)作調(diào)控的重要作用。如腫瘤壞死因子（TNF）具有炎癥介導(dǎo)作用，YUAN L等[21]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-10等細胞因子基因突變與漢族人ONFH易感性密切相關(guān)；PPARG基因與類固醇代謝、血管生成等生物過程相關(guān)。研究[22]認為PPARG高表達是ONFH的危險因素；轉(zhuǎn)化生長因子β1是調(diào)控細胞生長分化的重要因子，在TGF-β/Smad信號通路調(diào)控前體細胞成骨分化、抑制破骨細胞活性的過程承擔(dān)重要作用[23]，與ONFH的骨修復(fù)重建相關(guān)。

機體的組織、細胞、代謝因子等物質(zhì)之間存在復(fù)雜的信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，互相協(xié)作或抑制以發(fā)揮相應(yīng)功能，這與中醫(yī)核心理念“整體觀念”相契合。從KEGG通路富集結(jié)果來看，杜仲治療ONFH的17個靶標基因共富集于125個信號通路，其中有104個經(jīng)檢驗具有統(tǒng)計學(xué)差異，這些信號通路主要集中在細胞的增殖凋亡、癌癥相關(guān)、血管生成及凝血相關(guān)、免疫、炎癥、代謝等生物學(xué)過程。（1）調(diào)控骨代謝：成骨細胞-破骨細胞耦聯(lián)的骨重建-骨吸收穩(wěn)態(tài)平衡是ONFH治療的關(guān)鍵點之一，破骨細胞分化（osteoclast differentiation）、調(diào)控干細胞多能性的信號通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、細胞周期（cell cycle）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK signaling pathway）均有較顯著的富集。Wnt信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化、抑制成脂分化[24]；研究[25]表明激活MAPK信號通路通過提高ALP、BMP2等成骨相關(guān)蛋白表達，促進成骨細胞礦化過程；破骨細胞分化、細胞增殖凋亡周期調(diào)控與成骨細胞-破骨細胞穩(wěn)態(tài)平衡關(guān)系密切，杜仲活性成分可能通過相關(guān)信號通路恢復(fù)ONFH的骨重建-骨吸收失衡，促進骨重建，抑制骨吸收，修復(fù)骨壞死。（2）血管生成調(diào)控：ONFH發(fā)病與股骨頭血液循環(huán)欠佳密切相關(guān)，缺氧缺血是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HIF-1α信號通路耦聯(lián)血管生成與骨代謝平衡，可作用于生長板軟骨細胞促進血管內(nèi)皮生成因子表達從而促進血管生成[26-27]。杜仲活性成分可能有改善ONFH病程中股骨頭局部微循環(huán)、促進血管新生的作用。（3）炎癥代謝調(diào)控：改善ONFH局部特殊炎癥環(huán)境對其治療轉(zhuǎn)歸具有重要意義。NF-kappa B、T細胞受體等信號通路是重要的炎癥介導(dǎo)與免疫調(diào)控通路。炎癥因子誘導(dǎo)NF-κB活化，促進破骨細胞增殖活動[28]；T細胞受體信號通路調(diào)控機體免疫應(yīng)答、炎癥因子釋放、殺傷靶細胞等生物學(xué)過程[29]；杜仲苷、杜仲醇提物可抑制NF-κB、T細胞受體通路，減輕局部炎癥[30]。以上可能是其治療ONFH的潛在機制。

從靶標基因富集的GO生物學(xué)過程來看，杜仲治療ONFH主要與藥物反應(yīng)、核酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子活性、酶結(jié)合、細胞代謝因子活性等聯(lián)系緊密，與前述各富集的信號通路調(diào)控機體的生物學(xué)活動相吻合，是進一步探索杜仲活性成分治療ONFH潛在機制的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，杜仲治療ONFH存在多成分、多靶點、多通路等特點，各活性成分、靶標基因存在一定協(xié)同調(diào)控或拮抗調(diào)控作用，主要涉及的骨代謝平衡、血管生成、炎癥免疫調(diào)控等信號通路之間存在復(fù)雜相互作用，可能在股骨頭局部、機體全身發(fā)揮調(diào)控作用。杜仲治療ONFH的潛在分子機制復(fù)雜，本研究初步對相關(guān)機制進行總體探索，希望為后續(xù)具體實驗驗證提供思路與方法。