HPLC法同時測定復(fù)方川芎片中6種化學(xué)成分的含量

雷秀星，劉利利，倪丹鳳

（1.六安市中醫(yī)院，安徽 六安 237006；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；3.六安市人民醫(yī)院，安徽 六安 237005）

復(fù)方川芎片是由川芎和當歸2種中藥經(jīng)過一系列現(xiàn)代提取工藝加工制備而成的中成藥。該復(fù)方制劑具有活血化瘀、通脈止痛的功效，現(xiàn)代臨床上主要用于冠心病穩(wěn)定型心絞痛屬心血瘀阻證者。復(fù)方中的川芎為川產(chǎn)道地藥材之一，其性味溫、辛，主入肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品之一，入藥歷史悠久[1-4]；當歸是中藥組方中使用頻率最高的一味中藥，歷來素有“十方九歸”的說法，其性味溫甘辛，具有活血止血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的作用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被稱為“血家之圣藥”[5-8]，二者在復(fù)方中協(xié)同發(fā)揮功效?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，川芎含有多種化學(xué)成分，不同化學(xué)成分產(chǎn)生不同的藥理作用，對心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肝腎功能等方面均有一定的保護作用，可有效改善冠狀動脈血流量、抗血小板聚集和血栓形成、抗氧自由基、降血壓，如苯酞類化合物（藁本內(nèi)酯）、有機酸類化合物（阿魏酸、咖啡酸）、生物堿類化合物（川芎嗪）等，是川芎中主要的活性成分，也是川芎藥材常用的定性定量指標性成分；當歸藥材中主要有揮發(fā)油、多糖、氨基酸、有機酸和黃酮等有機成分；阿魏酸、綠原酸、金絲桃苷等，其中綠原酸和金絲桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[9-14]。兩味藥材中均含有阿魏酸，且《中華人民共和國藥典》2015年版一部中阿魏酸均為兩味藥材的定量指標性成分，復(fù)方中二者協(xié)同作用，共同發(fā)揮治療效果。筆者查閱相關(guān)文獻知，目前對該復(fù)方制劑中指標性成分的含量進行測定的報道鮮見，因此本次實驗研究旨在對該復(fù)方中6種指標性成分進行定量分析。

據(jù)文獻報道[15]，對復(fù)方制劑中單一指標性成分的含量進行測定難以確保其有效性與質(zhì)量穩(wěn)定性的統(tǒng)一。因此，目前亟需在以臨床用藥安全和有效的前提下，建立復(fù)方川芎片中多指標成分的含量測定方法。本研究則采用HPLC-DAD法建立了同時檢測該制劑中阿魏酸、咖啡酸、藁本內(nèi)酯、川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分含量的方法，為該復(fù)方的質(zhì)量控制與評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括DAD二極管陣列檢測器，四元梯度泵，Empower Pro色譜工作站）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；Milli Pore Advantage A10自動純水機（美國）。

1.2 試藥 對照品：阿魏酸（批號：110773-201012）、咖啡酸（批號：110885-200102）、藁本內(nèi)酯（批號：111737-201305）和金絲桃苷（批號：111521-200303）純度均≥98.0%；川芎嗪（批號：110817-200305，純度≥99.9%）；綠原酸（批號：110753-201415，純度≥96.2%），6種對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。5批復(fù)方川芎片（批號：20180712，20180810，20180909，20181212，20181227，均為市售品，每素片重0.4g）均為各大藥店購買；屈臣氏蒸餾水；乙腈（色譜級，Merk公司）；其他試劑（分析純，天津化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；洗脫程序為：0～12 min，10% A，12～30 min，10%→20% A，30～50 min，20%→40% A；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；檢測波長：320 nm。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品阿魏酸2.42 mg、咖啡酸3.62 mg、藁本內(nèi)酯2.82 mg、川芎嗪3.12 mg、綠原酸2.65 mg和金絲桃苷2.29 mg，置于25 mL的棕色容量瓶中，緩慢滴加甲醇至刻度線，超聲使溶解充分，分別制成質(zhì)量濃度為94.86、141.9、110.5、124.7、102.0、89.78 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方川芎片粉末0.2 g，置于50 mL的錐形瓶中，加25 mL甲醇溶液，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，取出，冷卻，稱質(zhì)量，加甲醇溶液補足失質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 將已制備好的混合對照品溶液和供試品溶液按照既定的HPLC-DAD條件進樣測定，記錄50 min的色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，阿魏酸、咖啡酸、藁本內(nèi)酯、川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷6個色譜峰的分離度均大于1.5，表明所建立的HPLC-DAD方法滿足本次實驗要求。

圖1 混合對照品與供試品HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL的阿魏酸（濃度為94.86 μg/mL）、咖啡酸（濃度為141.9 μg/mL）、川芎嗪（濃度為124.7 μg/mL）、藁本內(nèi)酯（濃度為110.5 μg/mL）、綠原酸（濃度為102.0 μg/mL）、金絲桃苷（濃度為89.78 μg/mL）混合對照品溶液，置于5 mL的棕色容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液至刻度線，即可得到一系列質(zhì)量濃度的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液，按照已定的HPLC-DAD色譜條件分別依次進樣測定，計算含量。即分別以阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液的質(zhì)量（X，μg）為橫坐標，其各自的峰面積（Y）為縱坐標，分別得出標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，在一定的線性范圍內(nèi)，6種指標性成分的線性關(guān)系良好。儀器的檢測限以3倍的信噪比（S/N=3），定量限以10倍的信噪比（S/N=3）計算。（見表1）

表1 6種指標性成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712），按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，同一樣品溶液連續(xù)重復(fù)進樣6次，計算各指標性成分的含量。結(jié)果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷的含有量RSD分別為1.31%、1.25%、1.02%、1.55%、0.95%、1.43%，表明本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取精密度測試的樣品溶液，分別在第0、2、4、6、8、12 h時進樣測試。結(jié)果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷各成分的峰面積RSD分別為1.03%、1.20%、1.33%、0.34%、0.93%、1.22%，表明在12 h內(nèi)供試品溶液中的6種指標性成分具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712），共制備6份樣品溶液，按照既定樣品制備方法和HPLC-DAD色譜方法進行測試。結(jié)果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷的含有量RSD分別為1.15%、1.21%、1.03%、0.85%、0.99%、1.02%，表明本次試驗方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712）0.1 g，平行精密稱取9份，置于50 mL錐形瓶中，每組分別加入阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液，按照樣品含有量的50%、100%和150%加入，按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，計算各自的回收率值，結(jié)果顯示6種指標性成分的平均回收率為阿魏酸99.82%（RSD=1.10%）；咖啡酸100.79%（RSD=1.20%）；川芎嗪100.07%（RSD=0.43%）；藁本內(nèi)酯98.98%（RSD=1.51%）；綠原酸101.22%（RSD=1.23%）；金絲桃苷100.99%（RSD=1.31%），結(jié)果顯示6種指標性成分的加樣回收率良好，基本符合試驗方法學(xué)要求。

2.10 含量測定 取5批復(fù)方川芎片，按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，分別進樣檢測分析，記錄各成分的峰面積，計算阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷各自含量。（見表2）

表2 5批樣品中6種化學(xué)成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=5）

3 討 論

復(fù)方川芎片是經(jīng)過一系列現(xiàn)代提取工藝加工制備而成的中成藥，該方中川芎和當歸協(xié)同發(fā)揮治療疾病的作用。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合該復(fù)方的藥理實驗結(jié)果，綜合選擇可能發(fā)揮療效的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分為該制劑的定量指標，并采用HPLC-DAD法對該6種指標性成分的含量進行了同時測定。結(jié)果顯示，6種指標性成分在既定樣品制備方法和HPLCDAD色譜方法下分離度均良好。故本實驗選擇同時定量分析阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分，能保證該復(fù)方制劑臨床的有效性與質(zhì)量的穩(wěn)定性。

筆者經(jīng)文獻研究可知，阿魏酸、咖啡酸、藁本內(nèi)酯分別在波長320 nm處有吸收，川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷分別在波長280 nm或254 nm處有吸收，筆者通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷在波長320 nm處也有明顯的吸收，故實驗選擇320 nm為阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷6種化學(xué)成分的檢測波長。研究還分別考察了不同的流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水），結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分均能達到良好的效果?？疾炝瞬煌瑴囟龋?5℃、30℃、35℃）和不同體積流量（0.8、1.0 mL/min）對各色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示，30℃的柱溫、1.0 mL/min的體積流量，色譜基線平穩(wěn)、分離度和峰形均有較好的改善。考察了不同廠家和品牌的色譜柱[Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]對色譜峰的影響，結(jié)果顯示，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷的色譜峰在Thermo BDS-C18柱上具有良好的分離度。實驗采用單因素考察的方法對樣品提取溶劑（無水乙醇、80%乙醇和60%乙醇，甲醇，80%甲醇，60%甲醇，正丁醇）、提取方法（加熱回流、浸提和超聲提?。?、提取時間（10、20、30、45、60 min）等影響因素進行了考察，結(jié)果顯示，采用甲醇超聲提取30 min可使樣品中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷提取完全。

本研究建立了HPLC-DAD法同時測定復(fù)方川芎片中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、綠原酸和金絲桃苷含量的方法。通過對高效液相色譜分離參數(shù)的考察，最終選擇最理想的HPLC-DAD檢測條件，該方法能較快速、準確地對不同指標性成分的含量進行有效測定，可作為有效評價復(fù)方川芎片內(nèi)在質(zhì)量的方法之一，保證了臨床用藥的安全性和有效性。精確對制劑中藥有效成分含量的測定，不僅為其他中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制與評價起到借鑒作用，而且也為中藥現(xiàn)代化的實現(xiàn)和國際標準的建立奠定了實驗基礎(chǔ)。