基于血熱證探討銀屑病病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建*

楊大偉，賈 穎，張皎皎

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

銀屑?。╬soriasis）是一種以紅斑、鱗屑損害為主的慢性炎癥性皮膚病。西醫(yī)對銀屑病的病因認(rèn)識尚不明確，臨床治療有限，而中醫(yī)通過辨證論治，對證治療，使銀屑病逐漸成為中醫(yī)治療的優(yōu)勢病種。臨床研究與科學(xué)研究是相輔相成的，已知的銀屑病動物模型，單純以模擬病理特征為目的，廣泛存在造模時間長、皮損不典型、持續(xù)時間短、技術(shù)要求高等問題[1]。病證結(jié)合動物模型的建立一定程度上改善了先前模型存在的問題。它將西醫(yī)疾病模型和中醫(yī)證候因素相結(jié)合，即西醫(yī)疾病+中醫(yī)病因，模型兼顧西醫(yī)的病理特征和中醫(yī)的證候表現(xiàn)，更加符合臨床實際情況[2]。現(xiàn)國內(nèi)文獻報道銀屑病病證結(jié)合動物模型有血瘀證[3]、脾虛證[4]、濕熱證[5]，尚無血熱證相關(guān)研究。故本實驗立足于血熱證，以中醫(yī)病因?qū)W說為指導(dǎo)，采用復(fù)合多因素方法探討銀屑病血熱證大鼠模型的建立，并嘗試對模型進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡雄性SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量230～250 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。用代謝籠單只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（23±2）℃，濕度55%～65%，12 h光照/黑夜循環(huán)，自由飲水、飲食。醫(yī)學(xué)實驗動物處理遵循實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 鹽酸普萘洛爾（商品名：心得安，上海賢鼎生物科技有限公司，CAS號：318-98-9）；乳劑基質(zhì)（廣州市歐妍化妝品有限公司）；干姜、炙甘草（山西維康堂中藥飲片有限公司）；大鼠血清T3試劑盒（上海泛柯實業(yè)有限公司，批號：F3512-A）；大鼠血清T4試劑盒（上海泛柯實業(yè)有限公司，批號：F3458-A）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（上海泛柯實業(yè)有限公司，批號：F3056-A）；大鼠白介素-17（IL-17）試劑盒（上海泛柯實業(yè)有限公司，批號：F2964-A）。干姜和炙甘草臨床每人每天用最大劑量為20 g/60 kg[6]，按人與動物體積表面積折算的等效劑量比值進行換算，配置成濃度1 g/mL煎煮液備用；將5 g的普萘洛爾加入95 g的乳劑基質(zhì)，均勻攪拌，配成5%的心得安乳劑備用。

1.3 主要儀器JCS-11001C型天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；體溫計（山西吉泰和寧科技有限公司）；紫外線光療儀（天津市合普科技有限公司）；H5501型光學(xué)顯微照相系統(tǒng)（日本尼康株式會社）；病理切片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；LeicaEG1150H型石蠟包埋機（德國Leica公司）；SM600型酶標(biāo)儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 分組與造模 采用隨機數(shù)字表將30只SD大鼠分為空白組、銀屑病組、銀屑病血熱證組，每組10只。空白組大鼠正常進食、進水。銀屑病組大鼠用電子推在大鼠背部剪出2 cm×2 cm的無毛區(qū)，將5%心得安乳劑按照0.3 g/cm2均勻涂抹，厚度約為1.0 mm，3次/d，共21 d[7-8]。銀屑病血熱證組仿照銀屑病組，在大鼠無毛區(qū)涂抹5%心得安乳劑，同時自抹藥之日起，灌服干姜、甘草煎煮液，劑量為1 mL/100 g，1次/d，共21 d。另外將銀屑病血熱證組大鼠置于固定器中，放置紫外燈光療儀燈具下方，垂直距離30 cm，1次/d，1 h/次，共21 d[9]。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 中醫(yī)血熱證癥狀的觀察 參照《中醫(yī)診斷學(xué)》[10]血熱證標(biāo)準(zhǔn)，大鼠出現(xiàn)急躁好斗、口干多飲、納呆食少、小便少而黃、大便少而硬等表現(xiàn)屬于血熱證的基本要求。具體指標(biāo)有大鼠每日的進食量、飲水量、排便量和性狀、排尿量和性狀，以及造模前后的體質(zhì)量和肛溫的變化。

1.5.2 背部皮膚皮損形態(tài)觀察 肉眼觀察大鼠背部皮膚有無紅斑、鱗屑多少、浸潤肥厚的情況。

1.5.3 背部皮膚組織病理學(xué)觀察 采用腹腔注射10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）進行麻醉，3 min后腹主動脈采血8～10 mL，離心后取上清備用。脊柱脫臼法處死大鼠，迅速剪取大鼠背部皮膚，置于4%多聚甲醛溶液固定，后進行石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光鏡下逐一觀察背部皮膚的病理變化。參照Baker法[11]進行組織病理評分。

1.5.4 大鼠T3、T4及炎癥細(xì)胞因子的檢測 采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒操作檢測大鼠血清三碘甲狀腺氨酸（T3）、四碘甲狀腺氨酸（T4）及炎癥因子TNF-α、IL-17的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠背部皮膚皮損形態(tài)觀察 空白組大鼠毛發(fā)正常有光澤，無異?；顒颖憩F(xiàn)；銀屑病組大鼠毛發(fā)雜亂晦暗，?；厥咨ψテp，表面覆蓋鱗屑，有少量的紅斑和丘疹；銀屑病血熱證組大鼠毛發(fā)雜亂，頻頻回首搔抓皮損，表面覆蓋大量鱗屑，鱗屑掉落有出血現(xiàn)象，有明顯的紅斑和丘疹，表皮肥厚。（見圖1）

圖1 各組大鼠背部皮膚形態(tài)觀察

2.2 各組大鼠背部皮膚組織病理學(xué)觀察 空白組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮與真皮界限清楚，角質(zhì)層薄，顆粒層明顯，棘層肥厚；銀屑病組和銀屑病血熱證組大鼠表皮明顯增厚，可見不同程度的過度角化，角化中可見Munro微膿腫形成，棘層肥厚，顆粒層變薄，真皮淺層血管擴張充血水腫伴炎細(xì)胞浸潤。銀屑病血熱證組和銀屑病組大鼠Baker評分均高于空白組（P＜0.01）；銀屑病血熱證組大鼠Baker評分高于銀屑病組（P＜0.05）。（見圖2、表1）

表1 各組大鼠造模后Baker評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠造模后Baker評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） Baker評分空白組 10 1.23±0.45銀屑病組 10 5.36±0.67a銀屑病血熱證組 10 6.19±0.54a b

圖2 各組大鼠背部皮膚組織病理切片圖（HE，×40）

2.3 各組大鼠中醫(yī)血熱證癥狀觀察 銀屑病血熱證組大鼠造模后出現(xiàn)進食量減少，飲水量增多，排便量減少且顏色為亮黃色，排便量減少且干硬，體質(zhì)量減輕、肛溫升高等明顯的血熱證表現(xiàn)，與空白組和銀屑病組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與空白組比較，銀屑病組大鼠進食量減少，飲水量增多（P＜0.05），但排便量和排尿量與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2～4）

表2 各組大鼠造模前后體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組大鼠造模前后體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 造模前 造模后 差值空白組 10 264.7±5.74 317.70±7.70 53.00±8.34銀屑病組 10 263.2±5.39 239.60±4.67-23.60±6.40a銀屑病血熱證組10 265.7±6.40 228.00±4.27-37.70±5.70a b

表3 各組大鼠造模前后肛溫比較（±s，℃）

表3 各組大鼠造模前后肛溫比較（±s，℃）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 造模前 造模后 差值空白組 10 37.99±0.14 38.12±0.15 0.13±0.25銀屑病組 10 38.13±0.13 38.48±0.14 0.35±0.23a銀屑病血熱證組 10 38.05±0.14 39.19±0.15 1.14±0.24a b

表4 各組大鼠造模后進食量、飲水量、排便量、排尿量比較（±s）

表4 各組大鼠造模后進食量、飲水量、排便量、排尿量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

糞便 尿液排便量(g) 性狀 排尿量(mL)性狀空白組 10 18.72±1.10 26.21±1.49 10.76±1.48濕潤11.83±0.90淡黃銀屑病組 10 16.80±0.65a 29.21±1.48a 9.44±0.49干小10.54±0.45米黃銀屑病血熱證組10 15.50±0.78ab 32.42±3.06ab 8.61±0.63ab干硬8.97±0.96ab亮黃組別 動物數(shù)(只)進食量(g) 飲水量(mL)

2.4 各組大鼠T3、T4及炎癥細(xì)胞因子水平測定 銀屑病血熱證組和銀屑病組大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平均高于空白組（P＜0.01），銀屑病血熱證組大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平高于銀屑病組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） T3 T4 TNF-α IL-17空白組 10 0.96±0.17 36.82±6.76 1.34±0.18 0.97±0.18銀屑病組 10 1.68±0.43a 44.10±3.41a 1.85±0.64a 1.62±0.33a銀屑病血熱證組10 2.09±0.75ab 58.21±9.62ab 2.23±0.43ab 2.56±0.65ab

3 討 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病與體質(zhì)存在相關(guān)性，血熱證集中在陰虛體質(zhì)[12]?；诖耍覀儏⒖疾⒈容^了其他實驗研究[13-14]，選擇體質(zhì)偏于虛熱的雄性SD大鼠作為實驗動物。

銀屑病血熱證的形成無外乎“外因”和“內(nèi)因”的影響，外受于風(fēng)熱毒邪，內(nèi)嗜食辛辣炙煿致使脾胃積熱，內(nèi)外邪熱交爭，蘊結(jié)肌表傷津耗血。故本研究造模方式遵循并模擬銀屑病血熱證的發(fā)病規(guī)律，即外涂抹心得安乳劑和照射紫外線燈，內(nèi)灌服干姜、甘草煎煮液。心得安乳劑屬于中醫(yī)“藥毒”范疇，中醫(yī)辨證多從風(fēng)熱論治[15]。故本研究借鑒了黃畋等[7]的研究及GAYLARDE P M等[8]的研究中用普萘洛爾誘導(dǎo)豚鼠銀屑病的造模方法。其次，用紫外線燈照射肌表以模擬日光。日光屬于中醫(yī)的暑熱之邪，《素問·生氣通天論篇》指出，傷于暑熱則“汗出”，“體若燔炭”?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈费裕骸靶粮拾l(fā)散為陽”，干姜為大辛大熱之品，炙甘草為甘滋之物，持續(xù)灌服煎煮液使脾胃積熱耗氣傷陰，致使火熱內(nèi)生，從而奠定內(nèi)傷的基礎(chǔ)。

《素問·瘧論篇》言：“陽盛則外熱，陰虛則內(nèi)熱”，外感風(fēng)熱毒邪直接作用肌表，內(nèi)受火熱耗損陰津，外感和內(nèi)傷的雙重刺激，導(dǎo)致大鼠皮膚不僅顯現(xiàn)紅斑、丘疹、鱗屑等銀屑病樣皮損，還表現(xiàn)出口渴喜飲、溲黃便秘、進食減少、體質(zhì)量減少、肛溫升高、局部皮膚溫度升高等與臨床血熱證相符的癥狀。其次，IL-17是炎癥細(xì)胞因子，具有極強的致炎性，是銀屑病特異性指標(biāo)的微觀表達，與TNF-α存在相互作用，能夠擴大并維持炎癥反應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-17和TNF-α在銀屑病皮損中的表達均高于正常組和對照組[16]。故本研究檢測大鼠血清IL-17和TNF-α的表達，得到了與臨床一致的結(jié)果，由此證明銀屑病大鼠模型的建立。魏歆然等[17]實驗研究結(jié)果表明寒證、熱證的主要生理病理基礎(chǔ)在于內(nèi)分泌激素水平的高低，熱證模型組的T3、T4、TNF-α均高于正常組和寒證模型組。故本研究檢測大鼠血清中T3、T4和TNF-α的表達，結(jié)論與魏歆然的一致，由此證明銀屑病血熱證大鼠模型的建立。

證是中醫(yī)學(xué)特有的概念，證的存在或消除決定了疾病是痊愈還是轉(zhuǎn)變。因此，本研究有效地把病與證結(jié)合，成功地將血熱證形成因素運用到動物模型，構(gòu)建的模型不僅穩(wěn)定性高，符合銀屑病慢性炎癥的特點，而且貼近臨床，既具有西醫(yī)的病理改變又具有中醫(yī)的特定癥狀。但銀屑病發(fā)病涉及多種復(fù)雜因素，本研究僅僅是對銀屑病病證結(jié)合動物模型的初步摸索，如何精準(zhǔn)選取造模因素和如何完善評價標(biāo)準(zhǔn)是我們下一步探索的方向。