益心泰顆粒對慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水停證大鼠心肌AMPK蛋白表達(dá)的影響*

唐 云，雷 洋

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省中醫(yī)藥研究院文獻(xiàn)信息研究所，湖南 長沙 410006）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）患病率高，病死率高，我國2003年的數(shù)據(jù)顯示患病率約為0.9%，死亡率約6.2%[1]。隨著對心力衰竭的重視，全國各地心力衰竭中心的成立，藥物規(guī)范化方案的不斷改進(jìn)，以及諾欣妥等新藥的出現(xiàn)，使CHF的再住院率和死亡率有所下降[2]。但隨著年齡的增大，其患病率升高，我國已逐步向老年化時(shí)代邁進(jìn)，且隨著冠心病、高血壓等其基礎(chǔ)疾病的患病率逐年升高，故CHF患病率仍居高不下，死亡率亦未得到顯著控制。心室重構(gòu)與代謝障礙是CHF的兩大重點(diǎn)特點(diǎn)，且二者具有雙向調(diào)控[3]。單磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMPK）是心臟的能量感受器，參與AMPK/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1（PGC-1）α、AMPK/過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）α等多條能量代謝信號通路，不僅可以調(diào)節(jié)心肌能量代謝，還與心肌肥大密切相關(guān)[4]。前期研究顯示益心泰顆?？梢愿纳艭HF心室重構(gòu)[5]。本課題選擇AMPK等指標(biāo)，從能量角度探討益心泰顆粒改善CHF的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡健康SPF級雄性BN（Brown Nonway）大鼠87只，體質(zhì)量180~220 g，均由湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證編碼：SCXK(湘)2019-009，該實(shí)驗(yàn)通過倫理審核（批號：LL201801010801）。

1.2 藥物與試劑 益心泰顆粒(由黃芪、丹參、澤瀉等組成，每克顆粒含生藥3.1 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)；注射用鹽酸多柔比星（ADR）（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10mg/瓶，批號：H44024361）；鹽酸曲美他嗪片（施維雅天津制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/片，批號：H20055465）；丙硫養(yǎng)嘧啶片（PTU）（上海復(fù)星朝輝藥業(yè)有限公司，規(guī)格：50mg/片，批號：H31021082）。血清氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、游離脂肪酸（FFA）Elisa試劑盒（美國RD公司）；超微量Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶測試盒（南京建成生物功能研究所）；AMPK抗體（美國abcam公司）。

1.3 主要儀器 多普勒超聲診斷儀（荷蘭Philips公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；伯樂半干轉(zhuǎn)膜（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；全自動(dòng)生化分析儀（日本日立高新技術(shù)公司）。

1.4 造模 采用PTU灌胃及ADR腹腔注射造模，具體方法、造模評判標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6]。隨機(jī)選取75只大鼠造模，予以PTU灌胃，灌胃量為大鼠每日進(jìn)食量的0.2%，1次/d；同時(shí)以3.5 mg/kg的ADR腹腔注射，1次/周。CHF模型成功標(biāo)準(zhǔn)：LVEF≤50%；心氣虛兼血瘀水停證模型成功評判標(biāo)準(zhǔn)：心悸（心率加快），神疲乏力（力竭性游泳時(shí)間減少），胸部滿悶（全心質(zhì)量指數(shù)升高），脅下痞塊（肝重指數(shù)升高），浮腫尿少（尿量減少）；同時(shí)符合2者，提示造模成功，造模共6周。

1.5 分組與給藥 將造模成功的70只大鼠按心功能分層后再隨機(jī)分為模型組、益心泰高劑量組（10.4 g/kg）、益心泰中劑量組（5.2 g/kg）、益心泰低劑量組（2.6 g/kg）及曲美他嗪組（10 mg/kg），每組14只；另設(shè)正常對照組12只，各藥物組予相應(yīng)藥物灌胃，模型組及正常對照組予以等體積的蒸餾水灌胃，1次/d，灌胃體積為10 mL/kg，灌胃4周。劑量換算方法為按人大鼠體表面積換算。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清NT-proBNP、FFA水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心，取上層血清，其中血FFA采用全自動(dòng)生化分析儀檢測，血清NT-proBNP采用酶聯(lián)免疫法檢測，具體方法按說明書執(zhí)行。

1.6.2 心肌Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性 麻醉后，空氣栓塞法處死，取出左心室心肌組織，檢測方法按說明書執(zhí)行。

1.6.3 心肌AMPK蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測。勻漿組織，使充分裂解，將裂解液樣品離心，取上清，酶標(biāo)板計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度，上樣及電泳，采用半干式轉(zhuǎn)膜，檢測膜上蛋白，封閉及孵育抗體，顯色及圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以（±s）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 藥物治療期間，除正常對照組和曲美他嗪組外，其他各組均有死亡，死亡大鼠尸體解剖后，發(fā)現(xiàn)死亡原因均為心力衰竭，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常對照組、模型組、益心泰低劑量組、益心泰中劑量組、益心泰高劑量組、曲美他嗪組存活數(shù)分別為12只、11只、12只、13只、12只、14只。

2.2 各組大鼠血清NT-proBNP、FFA比較 模型組血清NTproBNP、FFA均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。各給藥組血清NT-proBNP、FFA均明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰低劑量組血清NT-proBNP、FFA均明顯高于益心泰中劑量組、益心泰高劑量組與曲美他嗪組（P＜0.05）；而益心泰中、高劑量組血清NT-proBNP、FFA比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清NT-proBNP、FFA比較（±s）

表1 各組大鼠血清NT-proBNP、FFA比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與曲美他嗪組比較，dP＜0.05；與益心泰低劑量組比較，eP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）NT-proBNP（pg/mL）FFA（mmol/L）正常對照組 12 108.39±20.46 0.36±0.12模型組 11 387.02±31.97a 1.52±0.41a益心泰低劑量組 12 311.54±27.45b d 1.17±0.38b d益心泰中劑量組 13 218.30±19.28c e 0.72±0.30c e益心泰高劑量組 12 190.27±24.32c e 0.68±0.24c e曲美他嗪組 14 183.83±21.78c e 0.75±0.31c e

2.3各組大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值比較 模型組心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。各給藥組心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰低劑量組心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均低于益心泰中劑量組、益心泰高劑量組與曲美他嗪組（P＜0.05）；益心泰中、高劑量組心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度差異值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與曲美他嗪組比較，dP＜0.05；與益心泰低劑量組比較，eP＜0.01

Na+，K+-ATP酶 Ca2+，Mg2+ATP酶(μmolPi/mg(prot)/h)(μmolPi/mg(prot)/h)正常對照組 12 3.95±0.90 1.84±0.36 0.85±0.19模型組 11 2.47±0.63a 0.58±0.22a 0.21±0.08a益心泰低劑量組12 2.84±0.35bd 0.92±0.43bd 0.35±0.10bd益心泰中劑量組13 2.96±0.52b 1.29±0.51b 0.49±0.13c益心泰高劑量組12 3.28±0.46ce 1.37±0.53ce 0.56±0.27ce曲美他嗪組 14 3.16±0.71ce 1.46±0.58ce 0.54±0.15c組別 動(dòng)物數(shù)（只）AMPK/β-actin

圖1 各組大鼠心肌AMPK蛋白表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)古籍無CHF病名，直至1997年國家才明確心力衰竭病名，但中醫(yī)古籍有“心衰”病名的相關(guān)記載，且描述心衰相關(guān)癥狀的篇幅很多，可見中醫(yī)對心衰的認(rèn)識較為深刻?！端貑枴つ嬲{(diào)論篇》云：“若心氣虛衰，可見喘息持續(xù)不已”，而喘息是心衰的重要臨床癥狀之一，故這里描述的就是心衰，并指出心氣虛衰是其發(fā)病的病機(jī)?！蹲x醫(yī)隨筆·承制生化論》云：“氣虛不足以推血，則血必有瘀”，指出氣虛無力推動(dòng)血液，可以導(dǎo)致血液瘀滯?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論篇》記載“瘀血不去，其水乃成冶”，瘀血長時(shí)間無法得到有效治療，易導(dǎo)致水液代謝失常，最終可以出現(xiàn)水飲內(nèi)停。且氣虛運(yùn)化水濕不利亦導(dǎo)致水停，而水飲內(nèi)停又出現(xiàn)水飲凌心影響心氣的運(yùn)行，加重血瘀，心氣虛、血瘀、水停三者形成惡性循環(huán)，故CHF病機(jī)可用“虛”“瘀”“水”概括[7]。益心泰顆粒中黃芪善于補(bǔ)氣，且能利尿，可以改善心肌能量代謝，抑制心肌纖維化，改善心功能[8]。丹參、紅花活血化瘀，均可抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)，改善心室重構(gòu)[9-10]。澤瀉、豬苓利尿，現(xiàn)代藥理研究表明澤瀉、豬苓均可利尿、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫[11-12]。BNP、NT-proBNP與CHF關(guān)系密切，是診斷CHF的重要生化指標(biāo)，且可以作為CHF療效的評判標(biāo)準(zhǔn)，還可作為CHF預(yù)后的指標(biāo)。但NT-proBNP生物穩(wěn)定性好，且在血液中濃度高，故臨床上常用其來評判CHF[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組NT-proBNP明顯升高（P＜0.01），故其也可作為診斷CHF的重要指標(biāo)。治療后，與模型組比較，益心泰顆粒低、中、高劑量組NT-proBNP均明顯下降，提示益心泰顆?？梢杂行е委烠HF。

AMPK是細(xì)胞能量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，當(dāng)機(jī)體處于代謝應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可減少ATP分解代謝，促進(jìn)ATP合成代謝[14]。CHF時(shí)，心肌細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，AMPK被快速激活，使FFA氧化增加，增加相同氧量情況下ATP的生成，優(yōu)化了心肌的能量代謝[15]。ATP是心肌直接利用的能量物質(zhì)，主要包括Na+，K+-ATP、Ca2+，Mg2+-ATP，其廣泛存在于心肌組織，與心肌收縮、舒張功能密切相關(guān)，是反映心肌能量代謝的重要指標(biāo)[16]。ATP釋放能量，需要相應(yīng)酶的參與，ATP酶活性降低導(dǎo)致衰竭的心肌細(xì)胞出現(xiàn)ATP利用障礙[17-18]。故檢測Na+，K+-ATP酶與Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性，就可反映ATP的情況。FFA是心肌處于缺血缺氧狀態(tài)下，能量的重要來源，當(dāng)CHF時(shí)，其水平明顯升高，與NT-proBNP呈正相關(guān)，且可反映CHF的嚴(yán)重程度[19]。曲美他嗪可提高線粒體活性，釋放更多ATP，改善心肌能量代謝[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，曲美他嗪組血清NT-proBNP、FFA顯著低于模型組（P＜0.01），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均顯著高于模型組（P＜0.01），提示曲美他嗪可以促使AMPK蛋白表達(dá)增加，增加ATP酶活性，抑制脂肪酸氧化，降低血清NT-proBNP水平，改善心衰。益心泰低、中、高劑量組血清NT-proBNP、FFA均明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），這與曲美他嗪在治療CHF心肌能量代謝方面作用相同。劑量間比較顯示，與益心泰低劑量組比較，益心泰中、高劑量組血清NT-proBNP、FFA均明顯降低（P＜0.05），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相對灰度值均明顯升高（P＜0.05），且益心泰中、高劑量組以上指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示益心泰顆粒高、中劑量療效優(yōu)于低劑量，且中劑量后，藥效已達(dá)最大療效。

綜上所述，益心泰顆?？纱偈笰MPK蛋白表達(dá)增加，增加ATP酶活性，抑制脂肪酸氧化，降低血清NT-proBNP水平，改善心衰。