薯蕷皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型小鼠損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

夏凡林，沈磊瑩，曹 陽，林子晶

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415；2.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400016）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種慢性、自身免疫性和神經(jīng)退行性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要病理特征。據(jù)報(bào)道，全球大約有250多萬人罹患MS。該病的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境、感染和自身免疫等有關(guān)，其中“自身免疫學(xué)說”是研究熱點(diǎn)之一。該學(xué)說指出，MS的產(chǎn)生是由于髓鞘堿性蛋白（MBP）對(duì)自身免疫系統(tǒng)進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)髓鞘脫失，從而導(dǎo)致各種神經(jīng)功能障礙的發(fā)生[1]。目前，國內(nèi)外學(xué)者依據(jù)“自身免疫學(xué)說”開發(fā)出了Glatiramer acetate、Fingolimod等新藥治療MS，但其價(jià)格昂貴且患者耐受性差，臨床應(yīng)用有限。近年來，中藥治療MS因其療效穩(wěn)定、毒副作用小及復(fù)發(fā)率低的特點(diǎn)引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。

多發(fā)性硬化在中醫(yī)學(xué)中無對(duì)應(yīng)的名稱，根據(jù)其癥狀及體征可歸屬于“痿證”。其主要病機(jī)是患者多素體稟賦不足，復(fù)感受外邪，導(dǎo)致體內(nèi)痰瘀凝結(jié)，誘發(fā)腦髓、脊髓病變。治療應(yīng)以補(bǔ)腎益氣、活血化瘀為主要治療原則。薯蕷塊莖是常用中藥材山藥，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為薯蕷具有益腎氣、健脾胃、止泄痢、化痰涎、舒筋活血、截瘧等功效。薯蕷皂苷是其主要活性成分，屬于甾體皂苷類化合物之一。藥理學(xué)研究顯示，薯蕷皂苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等活性[3]。褚春民等[4]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有良好的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是非常具有開發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。鑒于此，筆者推測薯蕷皂苷可能通過改善免疫炎癥損傷而延緩MS進(jìn)展。核因子κB（NF-κB）屬于轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[5]。與健康人比較，MS患者腦脊液、血清、腦組織和脊髓組織中NF-κB表達(dá)水平均有所升高[6]；且臨床上常用于治療MS的藥物[如醋酸格拉替雷、干擾素β（IFN-β）等]均可通過抑制NF-κB的表達(dá)而發(fā)揮作用[7]。這提示阻斷NF-κB表達(dá)可能是防治MS的有效手段[8]?；诖?，本研究采用髓鞘堿性蛋白（MBP）+完全弗氏佐劑（CFA）誘導(dǎo)建立EAE小鼠模型，觀察薯蕷皂苷是否可以通過抑制NF-κB活性而改善MS小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)及阻止疾病的進(jìn)展，旨在探討薯蕷皂苷對(duì)MS的免疫調(diào)節(jié)作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57BL/6小鼠40只，健康狀況良好，SPF級(jí)，10周齡，體質(zhì)量20～30 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0037。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫（24±2）℃，每12 h明暗交替，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用脊椎脫臼法處死小鼠，本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 薯蕷皂苷原料藥（海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)：180704，純度：≥98%）；氯化鈉注射液（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：20180911，規(guī)格：500 mL∶450 mg）；CFA（內(nèi)含減毒結(jié)核分枝桿菌H37RA（美國Sigma公司，批號(hào)：170902）；百日咳毒素（美國Sigma公司，批號(hào)：P7208）；兔抗小鼠MBP多克隆抗體（上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：181207）；兔抗小鼠抗離子化鈣結(jié)合適配分子1（IBA-1）多克隆抗體（日本W(wǎng)AKO公司，批號(hào)：180922）；兔抗小鼠抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP，批號(hào)：SC201809）、IFN-γ（批號(hào)：SC201294）、白細(xì)胞介素-4（IL-4，批號(hào)：SC201502）、IL-17（批 號(hào)：SC201607）、IL-22（批號(hào)：SC201711）、Nod樣受體蛋白-3（NLRP-3，批號(hào)：SC201609）、NF-κB多克隆抗體（批號(hào)：SC201602）（美國Santa Cruz公司）；β-actin抗體（美國Santa Cruz公司，批號(hào)：SC201801）；Alexa Fluor488/568/594結(jié)合生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗（美國Invitrogen公司，批號(hào)：A11029）；抗CD4單克隆抗體（武漢生物制品研究所公司，批號(hào)：180922）；抗小鼠F4/80抗體（美國Abcam公司，批號(hào)：ab204451）；抗小鼠Hinstone H3抗體（北京百奧萊博科技有效公司，批號(hào)：181108）；IFN-γ（批號(hào)：191108）、IL-4（批 號(hào)：180911）、IL-17（批號(hào)：191220）、IL-22（批號(hào)：180723）、NLRP-3酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號(hào)：180711）（南京森貝伽生物科技有限公司）；胎牛血清、結(jié)晶紫染液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染液（美國Sigma公司）；蘇木精-伊紅（HE）染液（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）；蛋白裂解液、胞質(zhì)或核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；固藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染液（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；SDS緩沖液（上海榕柏生物技術(shù)有限公司公司）；Trans AMTM NF-κB p65活性檢測試劑盒（美國Active Motif公司，批號(hào)：521455deo）；其余試劑均為分析純，水為滅菌注射用水。

1.3 主要儀器ELX808型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；CM1950型冷凍切片機(jī)（北京格美勝達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司）；IX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；CX43型光學(xué)顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；JIDI-16R型高速冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器（美國LICOR公司）；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4 造模與分組 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、薯蕷皂苷低劑量組、薯蕷皂苷高劑量組，每組10只。除對(duì)照組外，其余小鼠參考練高建等[9]的研究建立EAE模型：取MBP 15 mg，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）5 mL稀釋，得質(zhì)量濃度為3 mg/mL的MBP溶液，再將同體積的CFA（內(nèi)含減毒結(jié)核分枝桿菌H37RA）與之混合。將上述混合溶液于4℃下進(jìn)行乳化，得乳化液。于小鼠脊柱段兩側(cè)任意2點(diǎn)皮下注射乳化液0.2 mL（內(nèi)含MBP 300μg）進(jìn)行免疫，并于免疫當(dāng)日同時(shí)腹腔注射百日咳毒素0.5 mL（即200 ng/只）以復(fù)制EAE模型。取造模小鼠脊髓組織進(jìn)行HE染色，若出現(xiàn)脊髓血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、白質(zhì)脫髓鞘等癥狀，提示造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 薯蕷皂苷溶液的配制以生理鹽水為溶劑，劑量參照人臨床常用劑量的5、10倍并通過人與小鼠的體質(zhì)量換算而得。于造模完成當(dāng)日（即為第0天）起，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠按0.1 mL/10 g腹腔注射相應(yīng)藥物，劑量分別為60、120 mg/kg；對(duì)照組和模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每日中午給藥，1次/d，連續(xù)20 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況及神經(jīng)功能評(píng)分 每日由同一研究者觀察各組小鼠進(jìn)食、飲水、排便、活動(dòng)度、體質(zhì)量等一般情況，并對(duì)小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行評(píng)分，0分：無明顯異常；1分：尾巴癱瘓；2分：共濟(jì)失調(diào)，后肢麻痹性癡呆；3分：雙后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。分別記錄造模前及造模后第5、10、15、20天各組小鼠的體質(zhì)量及神經(jīng)功能評(píng)分情況。

1.6.2 血清炎癥因子水平 于造模后第20天，腹腔注射10%水合氯醛溶液（4 mL/kg）進(jìn)行麻醉，于小鼠眼球取血并分離血清。采用ELISA法以酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各組小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-22、NLRP3水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.6.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 于取血后處死各組小鼠，取出脊髓組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，使用冷凍切片機(jī)切片（厚度約16μm），經(jīng)HE染色后使用光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠脊髓組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況（浸潤細(xì)胞呈藍(lán)紫色）；經(jīng)LPB染色后使用光學(xué)顯微鏡觀察其脊髓組織脫髓鞘情況（髓鞘呈藍(lán)白色）。

1.6.4 脊髓組織中CD3、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達(dá) 采用免疫熒光染色法檢測。取“1.6.3”項(xiàng)下脊髓組織切片，用PBS洗滌2次，用3%過氧化氫孵育20 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后用5%胎牛血清阻斷1 h，分別加入CD3、F4/80、GFAP、IBA-1抗體（稀釋度均為1∶200），于4℃下孵育過夜；經(jīng)PBS洗滌3次后，于室溫下加入Alexa Fluor 488/568/594結(jié)合生物素標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1∶500），室溫孵育1～2 h；經(jīng)PBS洗滌3次，用DAPI染色后，以中性樹脂封片，使用熒光顯微鏡觀察CD3、F4/80、GFAP、IBA-1的表達(dá)情況（根據(jù)其綠色/紅色熒光強(qiáng)弱來判定其表達(dá)強(qiáng)弱）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.5 脊髓組織中炎癥蛋白（IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-22、NLRP3、NF-κB及p-NF-κB）的表達(dá)水平 采用Western blotting法檢測。取各組大鼠脊髓組織適量，勻漿后，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，分別使用胞質(zhì)或核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞的胞漿或胞核蛋白，冰上裂解25 min后，于4℃下以1 000 g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入SDS緩沖液適量，煮沸5 min使蛋白變性。取變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為1∶500），4℃孵育過夜，用TBST溶液清洗5 min×3次；隨后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，用TBST溶液清洗5 min×3次。經(jīng)ECL顯色后，使用Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參（β-actin或Histone 3）的灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.6 NF-κB p65與DNA結(jié)合活性檢測 按“1.6.4”項(xiàng)下方法提取各組小鼠脊髓組織的核蛋白，參考Trans AMTM NF-κB p65活性檢測試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度值，其吸光度值越高，表示NF-κB p65與DNA結(jié)合活性越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況 對(duì)照組小鼠生存狀態(tài)良好，食量、活動(dòng)和大小便均未見異常，造模前后的神經(jīng)功能評(píng)分均為0分；模型組小鼠自造模后第10天起出現(xiàn)EAE癥狀，如疲憊、后肢無力、尾拖地等，其體質(zhì)量（造模后第10～20天）明顯減少，神經(jīng)功能評(píng)分（造模后第10～20天）明顯升高（P＜0.05）。薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠上述癥狀均有不同程度的改善，薯蕷皂苷高劑量組小鼠體質(zhì)量（造模后第10～20天）明顯增加，且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組；薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（造模后第10～20天）均明顯降低，且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表1~2、圖1~2）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=23.517，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=21.326，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=17.218，P交互效應(yīng)=0.000；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 造模前 造模后5 d造模后10 d造模后15 d造模后20 d F P對(duì)照組 10 - 22.09±7.21 22.62±7.82 22.98±8.13 23.41±7.99 23.65±8.14 0.129 0.887模型組 10 - 23.82±8.43 21.82±8.12 20.35±7.09a 18.63±6.58a 18.15±5.66a 7.213 0.003薯蕷皂苷低劑量組 10 60 22.09±7.95 21.67±7.11 21.02±6.84 19.02±6.73 18.94±5.82 6.490 0.005薯蕷皂苷高劑量組 10 120 23.40±8.45 22.42±7.65 22.31±6.93bc 22.97±6.67bc 23.14±7.65bc 0.074 0.929 F 0.162 0.056 4.238 5.641 8.284 P 0.851 0.946 0.025 0.009 0.002

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較的交互效應(yīng)輪廓圖

圖2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較的交互效應(yīng)輪廓圖

2.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯升高（P＜0.05），而IL-4水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組血清IFN-γ、IL-17、NLRP3明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；薯蕷皂苷低、高劑量組血清IL-4水平均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） IFN-γ IL-4 IL-17 IL-22 NLRP-3對(duì)照組 10 - 11.23±1.09 36.92±2.77 16.73±2.26 17.58±4.36 19.75±2.46模型組 10 - 33.73±4.81a 19.83±1.25a 31.22±2.47a 65.73±7.33a 31.25±3.41a薯蕷皂苷低劑量組 10 60 21.73±2.35b 26.48±2.24b 21.36±1.97b 21.09±5.13b 23.47±3.59b薯蕷皂苷高劑量組 10 120 15.72±3.11b c 30.91±2.47b c 15.09±2.48b c 22.15±5.22b c 20.93±2.44b c

2.3 各組小鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組未見明顯的單核細(xì)胞浸潤，模型組可見大量的單核細(xì)胞浸潤，薯蕷皂苷低、高劑量組單核細(xì)胞浸潤明顯減少。LFB染色結(jié)果顯示，對(duì)照組未見明顯的脊髓脫髓鞘變化，模?型組可見明顯的脫髓鞘改變，薯蕷皂苷低、高劑量組脫髓鞘改變明顯減少。（見圖3）

圖3 各組小鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=32.471，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=42.362，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=36.283，P交互效應(yīng)=0.000；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）造模前 造模后5 d造模后10 d造模后15 d造模后20 d F P對(duì)照組 10 - 0 0 0 0 0模型組 10 - 0 0 0.22±0.15a 2.64±0.66a 3.02±0.72a 70.869 0.000薯蕷皂苷低劑量組 10 60 0 0 0.23±0.17b 1.02±0.53b 1.95±0.61b 32.610 0.000薯蕷皂苷高劑量組 10 120 0 0 0.09±0.03b c 0.17±0.09b c 0.97±0.49b c 28.519 0.000 F 16.499 65.193 27.896 P 0.000 0.000 0.000

2.4各組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達(dá)均明顯增加；與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達(dá)均有不同程度的減少。（見圖4）

圖4 各組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1表達(dá)比較（×20，小方格中為×200，比例尺為50μm）

2.5 各組小鼠脊髓組織中炎癥蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），而IL-4的相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；而IL-4的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖5、表4）

表4 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）IFN-γ IL-4 IL-17 IL-22 NLRP3對(duì)照組 10 - 0.49±0.12 1.98±0.15 0.42±0.05 0.51±0.11 0.62±0.07模型組 10 - 0.85±0.12a 0.72±0.08a 0.87±0.11a 0.92±0.13a 1.25±0.12a薯蕷皂苷低劑量組 10 60 0.54±0.21b 1.16±0.10b 0.52±0.11b 0.65±0.09b 1.01±0.05b薯蕷皂苷高劑量組 10 120 0.39±0.06b c 1.78±0.08b c 0.38±0.05b c 0.56±0.06b c 0.87±0.07b c

圖5 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達(dá)電泳圖

2.6 各組小鼠脊髓組織中NF-κB表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠脊髓組織細(xì)胞核中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織細(xì)胞核中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖6、表5）

圖6 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達(dá)及DNA結(jié)合活性比較（±s）

表5 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達(dá)及DNA結(jié)合活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

NF-κB蛋白表達(dá) NF-κB p65與細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì) DNA結(jié)合的OD值對(duì)照組 10 - 0.45±0.11 1.21±0.18 0.18±0.03模型組 10 - 1.38±0.26a 0.34±0.05a 1.35±0.19a薯蕷皂苷低劑量組10 60 1.09±0.17b 0.69±0.12b 1.16±0.14b薯蕷皂苷高劑量組10 120 0.65±0.12b c 0.92±0.12b c 0.76±0.08b c組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）

2.7 各組小鼠脊髓組織中NF-κB p65與DNA結(jié)合活性比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠脊髓組織細(xì)胞核中NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表5）

3 討 論

MS是一種慢性自身免疫性中樞炎性疾病，伴有大腦神經(jīng)細(xì)胞大量損傷和死亡[10]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，與免疫炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和分化等密切相關(guān)[11]。NF-κB激活在MS發(fā)病中有重要意義，阻斷NF-κB功能可能是防治MS的有效手段。IFN-γ、IL-17、IL-22屬于促炎細(xì)胞因子，而IL-4為抗炎細(xì)胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)MS患者血清中IFN-γ、IL-17、IL-22表達(dá)水平升高，而IL-4水平下降[12-13]。NF-κB可以調(diào)控IFN-γ、IL-17、IL-22、IL-4的表達(dá)[14-15]。NLRP3是炎癥小體，NF-κB可以靶向NLRP3而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥[16]。膠質(zhì)細(xì)胞激活后可引起炎癥反應(yīng)，使組織中炎癥因子水平升高，促進(jìn)MS的發(fā)生發(fā)展。

本研究建立了EAE小鼠模型對(duì)MS進(jìn)行研究。EAE是以特異性致敏的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的，以及以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是模擬MS的理想動(dòng)物模型。本研究采用MBP+CFA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，約10 d后小鼠出現(xiàn)明顯的EAE癥狀，如精神疲憊、后肢無力、尾拖地和體質(zhì)量下降等，且模型組神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組，且小鼠脊髓出現(xiàn)了典型的脊髓損傷的病理改變，脊髓損傷區(qū)域出現(xiàn)大量免疫細(xì)胞，且星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1明顯激活，提示造模成功，這與既往報(bào)道類似[4]。同時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯升高，而IL-4水平明顯降低。HE染色結(jié)果顯示，模型組可見大量的單核細(xì)胞浸潤。LFB染色結(jié)果顯示，模型組可見明顯的脫髓鞘改變，同時(shí)，可見脊髓組織中CD4、F4/80、IBA-1、GFAP，IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，IL-4的相對(duì)表達(dá)量明顯降低；模型組脊髓組織細(xì)胞核中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性明顯增加。進(jìn)一步驗(yàn)證了MS脊髓組織中出現(xiàn)了典型的自身免疫炎癥反應(yīng)，而這一過程與NF-κB的激活，并促進(jìn)炎癥因子的大量釋放有關(guān)。

薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等活性[17-18]。既往研究顯示，薯蕷皂苷可以通過抑制NF-κB而改善酒精性肝纖維化、缺血性腦卒中、肝臟缺血再灌注損傷等病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可顯著改善MS小鼠的一般情況和神經(jīng)功能評(píng)分，且可以減少脊髓損傷區(qū)域單核細(xì)胞浸潤和脊髓脫髓鞘的發(fā)生。中樞免疫炎癥性損傷是MS的重要發(fā)病機(jī)制之一[19]，本研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷干預(yù)后脊髓組織中活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞明顯減少，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化受到抑制，提示薯蕷皂苷可以通過改善中樞免疫炎癥損傷而發(fā)揮治療MS的作用。

本研究中薯蕷皂苷干預(yù)后實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反性腦脊髓炎模型小鼠血清及脊髓組織中相關(guān)炎癥因子水平明顯降低，且NF-κB向胞核轉(zhuǎn)移明顯減弱，故我們推測薯蕷皂苷可能是通過阻斷NF-κB的胞核轉(zhuǎn)移途徑來影響炎癥蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)EAE小鼠的作用。

綜上所述，薯蕷皂苷可以改善EAE小鼠脊髓病理損傷，并且能夠改善外周血和脊髓組織中炎癥因子表達(dá)，其機(jī)制可能是抑制NF-κB從細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，進(jìn)而抑制NF-κB激活。本實(shí)驗(yàn)屬于初步研究，存在一定不足，如未設(shè)立陽性對(duì)照藥物組，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步開展研究。