水產(chǎn)食品過(guò)敏及其防控技術(shù)研究

劉光明，劉慶梅，楊 陽(yáng)，劉 萌，李夢(mèng)思，曹敏杰

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門(mén) 361021）

過(guò)敏反應(yīng)疾病被世界衛(wèi)生組織列為21 世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一。食品過(guò)敏 （Food allergy）主要為免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）E 介導(dǎo)的I 型超敏反應(yīng)，其反應(yīng)迅速、癥狀明顯，通常伴隨皮膚、胃腸道和呼吸系統(tǒng)反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起休克甚至死亡[1]。目前被報(bào)道能夠引起過(guò)敏的食品已逾百種，而90%以上的食品過(guò)敏反應(yīng)都是由花生、堅(jiān)果、芝麻、小麥、蛋類、奶類、魚(yú)類和甲殼類水產(chǎn)品所引起[2]。西方國(guó)家的食品過(guò)敏反應(yīng)多見(jiàn)于花生、堅(jiān)果類過(guò)敏[3]，而在亞洲地區(qū)，由魚(yú)類、甲殼類等水產(chǎn)食品引起的過(guò)敏反應(yīng)較為常見(jiàn)[4]。食品中能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE 并與之結(jié)合，使抗體進(jìn)一步誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)，從而引起過(guò)敏反應(yīng)的成分稱為食品致敏原（Food allergen）[1]。與其它種類的抗原一樣，食品致敏原是免疫系統(tǒng)不能識(shí)別的外來(lái)大分子，大都是對(duì)食品加工處理、人體消化等過(guò)程具有抗性的高穩(wěn)定性蛋白分子[5-7]。

過(guò)去的幾十年中，過(guò)敏性疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)顯著增加，尤其是兒童的發(fā)病率普遍高于成人[8]。迄今為止，對(duì)食品過(guò)敏仍無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的根治手段。嚴(yán)格避免攝入致敏原，是控制食品過(guò)敏的重要途徑。正因如此，致敏原的鑒定和檢測(cè)一直備受關(guān)注。近年來(lái)，通過(guò)食品加工降低致敏原的致敏性，利用低致敏性致敏原衍生物建立脫敏治療方法以及尋找具有天然抗過(guò)敏活性物質(zhì)，都成為食品過(guò)敏性疾病防控的重要手段。本文針對(duì)水產(chǎn)食品過(guò)敏，闡述其致敏原的分類鑒定方法、分子特征及檢測(cè)技術(shù)，歸納食品加工降低致敏性的方法，以及低致敏性致敏原衍生物和抗過(guò)敏的天然活性物質(zhì)研究進(jìn)展，以期為食品過(guò)敏性疾病的有效防控提供參考。

1 水產(chǎn)食品致敏原分類鑒定及檢測(cè)技術(shù)

效應(yīng)細(xì)胞表面的特異性IgE 和入侵機(jī)體的致敏原是觸發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此致敏原的鑒定可從血清學(xué)分析和細(xì)胞模型兩方面入手[9]。血清學(xué)分析主要是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡等方法，檢測(cè)食品組分與過(guò)敏患者血清IgE 的結(jié)合能力，從而確定其中的致敏原成分，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜、分子克隆等技術(shù)完成致敏原的鑒定和序列分析[10-11]。過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)效應(yīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生介質(zhì)釋放、脫顆粒等變化，因此致敏原激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)的檢測(cè)也可作為其鑒定的方法。目前大鼠來(lái)源的肥大細(xì)胞脫顆粒模型、人外周血嗜堿性白血病細(xì)胞的組胺釋放模型、嗜堿性粒細(xì)胞激活試驗(yàn)等都是較為常用的致敏原鑒定的細(xì)胞模型[12-14]。世界衛(wèi)生組織/國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)盟 （World Health Organization/ International Union of Immunological Societies，WHO/IUIS） 是權(quán)威的致敏原認(rèn)證和系統(tǒng)命名機(jī)構(gòu)，在WHO/IUIS 的命名申請(qǐng)已成為致敏原鑒定的重要環(huán)節(jié)[15]。目前被WHO/IUIS 收錄的水產(chǎn)食品致敏原共有99 種，包括47 種甲殼類水產(chǎn)品致敏原、34 種魚(yú)類致敏原和8 種軟體類水產(chǎn)食品致敏原。

1.1 水產(chǎn)食品致敏原的分類鑒定

超過(guò)70%的水產(chǎn)食品致敏原可按照結(jié)構(gòu)特征分為3 個(gè)主要的蛋白家族，即：EF 手型的鈣離子結(jié)合蛋白家族、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族和磷酸原激酶家族（表1）。

表1 WHO/IUIS 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的水產(chǎn)食品致敏原Table 1 Seafood allergens defined in WHO/IUIS database

鈣離子結(jié)合蛋白在機(jī)體中可作為鈣離子載體或是發(fā)揮細(xì)胞信使等功能[16]，其分子結(jié)構(gòu)中的鈣離子結(jié)合區(qū)域具有典型的EF 手型結(jié)構(gòu)，即第1 個(gè)α 螺旋“E” 連接1 個(gè)結(jié)合鈣離子的柔性環(huán)和第2個(gè)α 螺旋“F”，鈣離子結(jié)合蛋白一般包含2～9 個(gè)EF 手型結(jié)構(gòu)[17]。魚(yú)類主要致敏原小清蛋白（Parvalbumin，PV） 分子內(nèi)含有2 個(gè)EF 手型結(jié)構(gòu)，屬于典型的EF 手型的鈣離子結(jié)合蛋白[18]。自首次被鑒定為鱈魚(yú)主要致敏原后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼在多種硬骨魚(yú)和軟骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)小清蛋白為其主要致敏原[19]。甲殼類水產(chǎn)食品中新型致敏原肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）和肌鈣蛋白C 也屬于EF 手型鈣離子結(jié)合蛋白家族。肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白近年來(lái)被陸續(xù)報(bào)道為克氏原螯蝦、擬穴青蟹、牡蠣等的新型致敏原[20-22]。Chen等[23]通過(guò)定點(diǎn)突變證實(shí)其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)致敏性具有重要影響。肌鈣蛋白具有肌鈣蛋白C/I/T 3種亞型，目前被鑒定為致敏原的是肌鈣蛋白C/I，只有肌鈣蛋白C 的結(jié)構(gòu)被解析，然而，未證實(shí)其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)與致敏性的關(guān)系[24-25]。

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的主要生理功能是參與肌動(dòng)蛋白的聚合成束或交聯(lián)，介導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的維持和運(yùn)動(dòng)[26]。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族成員分子結(jié)構(gòu)呈典型的絲狀，如原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）、副肌球蛋白、肌球蛋白、細(xì)絲蛋白C（Filamin C，F(xiàn)LNc）等。原肌球蛋白是甲殼類水產(chǎn)食品中的主要致敏原，也是存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中的泛致敏原，近期還被報(bào)道為魚(yú)類的次要致敏原[27]。原肌球蛋白在不同物種間具有很高的序列保守性，其空間結(jié)構(gòu)由2 股α 螺旋結(jié)構(gòu)相互纏繞而成，這種結(jié)構(gòu)使得原肌球蛋白對(duì)不同pH 值、熱處理、消化酶等都具有很好的耐受能力[28-29]。副肌球蛋白近年來(lái)被相繼報(bào)道為鮑魚(yú)和海螺等軟體類水產(chǎn)食品致敏原[30-31]，其空間結(jié)構(gòu)也主要由α 螺旋構(gòu)成，且具有十分保守的氨基酸序列，被稱為 “原肌球蛋白-A”，由于這種結(jié)構(gòu)的相似性，在軟體動(dòng)物中副肌球蛋白與原肌球蛋白間存在免疫交叉反應(yīng)性[31-32]。肌球蛋白由1 個(gè)200 ku 左右的肌球蛋白重鏈和2個(gè)18～20 ku 的肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）構(gòu)成[33]。肌球蛋白輕鏈被鑒定為凡納濱對(duì)蝦的主要致敏原和克氏原螯蝦、擬穴青蟹等物種的次要致敏原[34-36]。肌球蛋白重鏈不僅被報(bào)道為甲殼類水產(chǎn)食品致敏原，也被證實(shí)是魚(yú)類的一種致敏原，而目前尚未證實(shí)肌球蛋白重鏈?zhǔn)欠翊嬖谖锓N間的免疫交叉反應(yīng)[37-38]。細(xì)絲蛋白存在A、B、C 3種亞型，目前被報(bào)道為甲殼類水產(chǎn)食品致敏原的是FLNc[39-40]。Mao 等[41]根據(jù)與其序列高度同源的細(xì)絲蛋白A 的結(jié)構(gòu)推測(cè)，該蛋白也具有較為典型的絲狀結(jié)構(gòu)。此外，從生理功能上看，肌鈣蛋白也屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合家族[26]。

磷酸原激酶主要的生理功能是催化高能磷酸基團(tuán)在ATP 和胍類化合物之間的可逆轉(zhuǎn)移，從而在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮作用[42]。目前發(fā)現(xiàn)的磷酸原激酶有8 種，其中被報(bào)道為致敏原的是精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）和肌酸激酶。精氨酸激酶是甲殼類水產(chǎn)食品中的一種主要致敏原，并能廣泛引起節(jié)肢動(dòng)物間的免疫交叉反應(yīng)[43]。肌酸激酶最初主要被報(bào)道為海水魚(yú)肌肉中的致敏原[44]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼在武昌魚(yú)和鯰魚(yú)等淡水魚(yú)中將其鑒定為致敏原[45]。磷酸原激酶家族中的分子高度保守，精氨酸激酶和肌酸激酶的序列同源性超過(guò)50%[44]，而二者的空間結(jié)構(gòu)高度相似，因此推測(cè)精氨酸激酶和肌酸激酶間可能存在免疫交叉反應(yīng)[46-47]。不僅如此，二者都存在一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，通過(guò)半胱氨酸巰基與二硫鍵之間的相互轉(zhuǎn)化調(diào)控酶的形變。Yang 等[48]通過(guò)變性劑處理等方式證實(shí)精氨酸激酶內(nèi)部的二硫鍵可影響分子的空間結(jié)構(gòu)，從而影響其致敏性。

除上述幾大家族的致敏原之外，水產(chǎn)食品中其它致敏原也不斷被發(fā)現(xiàn)，如魚(yú)類膠原蛋白、烯醇酶、醛縮酶和甲殼類水產(chǎn)食品中的磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephosphate isomerase，TIM）、血藍(lán)蛋白等[27]。然而，這些新型致敏原的抗原表位及其引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的作用機(jī)理等有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

1.2 水產(chǎn)食品致敏原的檢測(cè)技術(shù)

食品中致敏原的檢測(cè)方法可分為蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)和基因水平的檢測(cè)?；诘鞍踪|(zhì)水平的檢測(cè)又可分為免疫學(xué)方法和質(zhì)譜技術(shù)?；诨蛩降臋z測(cè)方法主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）系列方法[49]。

免疫學(xué)方法主要包括ELISA、免疫印跡法、免疫層析法和蛋白質(zhì)芯片，其原理都是抗原與抗體之間的相互識(shí)別。ELISA 是目前食品致敏原檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法是將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后顯色度的深淺，對(duì)樣品中待測(cè)致敏原進(jìn)行定性和定量分析[50]。免疫印跡是先通過(guò)電泳將不同蛋白組分按照分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移至固相載體，利用酶標(biāo)記或放射性標(biāo)記的抗體對(duì)固相載體上的致敏原進(jìn)行檢測(cè)。免疫印跡方法能夠追蹤食物不同加工階段的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)及肽段[51]。免疫層析法首先將抗體預(yù)包被于硝化纖維膜，待測(cè)樣品通過(guò)毛細(xì)作用涌動(dòng)至預(yù)包被抗體區(qū)域時(shí)被捕獲，通過(guò)酶標(biāo)或膠體金作為示蹤標(biāo)志物可得到直觀的可視化結(jié)果[52]。蛋白質(zhì)芯片是將特異性抗原等蛋白質(zhì)探針高密度地分配在固體基底表面形成蛋白陣列，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，然而，目前由于檢測(cè)成本和技術(shù)難度問(wèn)題，蛋白質(zhì)芯片在食品中致敏原的檢測(cè)方面應(yīng)用并不廣泛[53]。

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，在致敏原檢測(cè)領(lǐng)域也占據(jù)日趨重要的地位。為實(shí)現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)，質(zhì)譜技術(shù)往往與液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳等高效的分離純化技術(shù)相結(jié)合，在致敏原檢測(cè)中應(yīng)用最多的是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[54]。質(zhì)譜技術(shù)是針對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)或肽段的檢測(cè)方法，相比于免疫學(xué)方法，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)既克服了食品加工后致敏原結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的假陰性問(wèn)題，也避免了食品中同源蛋白引起的假陽(yáng)性問(wèn)題[55]。

基因水平檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于DNA 分子經(jīng)食品加工后仍可有效提取且穩(wěn)定性較好。普通PCR 是一種針對(duì)致敏原特征基因序列的檢測(cè)方法，該方法需結(jié)合PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目的片段分子質(zhì)量大小進(jìn)行定性分析[56]。實(shí)時(shí)PCR 是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)的全過(guò)程[57]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，通過(guò)針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，在DNA 聚合酶的作用下以60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)目的基因的大量擴(kuò)增[49]，LAMP 檢測(cè)結(jié)果可直接通過(guò)反應(yīng)體系中樣品顏色等變化進(jìn)行判斷[58]?；蛐酒瑱z測(cè)是利用核酸分子雜交原理，將已知序列核酸單鏈作為探針，標(biāo)記后高密度地固化于芯片基質(zhì)，檢測(cè)時(shí)待測(cè)樣品中的核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與芯片基質(zhì)上的探針進(jìn)行雜交[49]。生物芯片檢測(cè)致敏原最突出的優(yōu)點(diǎn)是其檢測(cè)的高通量，然而目前基因芯片在食品致敏原檢測(cè)中的應(yīng)用尚有待推廣。

2 水產(chǎn)食品致敏原的加工脫敏控制

水產(chǎn)食品引起的過(guò)敏反應(yīng)通常伴隨終身，也是引起成年人食品過(guò)敏的主要原因[59]。雖然水產(chǎn)食品過(guò)敏在一定程度上與個(gè)人體質(zhì)有關(guān)，但是也有大量證據(jù)表明加工方式可影響水產(chǎn)食品的過(guò)敏性[60-62]。如何在加工處理過(guò)程中降低水產(chǎn)品的致敏性，逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。常見(jiàn)的處理方式按照類型可分為熱處理、非熱處理和復(fù)合加工。

2.1 熱處理降低水產(chǎn)食品致敏原的致敏性

熱處理在水產(chǎn)品加工處理中較為常見(jiàn)[63]，可引起致敏原結(jié)構(gòu)上的變化，包括蛋白質(zhì)分子一級(jí)序列的斷裂，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等空間結(jié)構(gòu)的展開(kāi)和構(gòu)象的喪失，分子內(nèi)和/或分子間共價(jià)和非共價(jià)相互作用的形成及聚集（圖1）[59，64]。這種結(jié)構(gòu)的改變與處理溫度存在明顯的相關(guān)性：當(dāng)溫度70～80℃時(shí)，熱處理會(huì)使蛋白發(fā)生變性，促進(jìn)致敏原二硫鍵的重排；當(dāng)溫度升至90～100 ℃時(shí)，致敏原形成聚體，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化；溫度繼續(xù)升高，致敏原的空間結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌、重組，抗原表位重新形成，被掩蓋或破壞，從而影響其致敏性[65]。本文將熱處理溫度范圍分為70 ℃以下的低溫?zé)崽幚恚?0～100 ℃的高溫?zé)崽幚砑?00 ℃以上的超高溫?zé)崽幚怼?/p>

圖1 熱處理對(duì)致敏原結(jié)構(gòu)的影響[59，64]Fig.1 The influence of thermal processing on the structure of allergen[59，64]

研究表明，致敏原經(jīng)單獨(dú)的低溫?zé)崽幚砗?，其結(jié)構(gòu)及免疫結(jié)合活性可發(fā)生明顯變化。青蟹SCP經(jīng)60 ℃加熱30 min[66]，小龍蝦AK 經(jīng)42 ℃加熱30 min[67]，出現(xiàn)的二聚體均可致SCP 和AK 的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。小龍蝦TIM 和FLNc 經(jīng)過(guò)60 ℃加熱30 min 后，致敏原的α 螺旋含量降低，螺旋結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，IgE 結(jié)合能力顯著降低[40]。

此外，美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）也常用于降低食品的致敏性。核糖與章魚(yú)TM 在相對(duì)濕度35%，60 ℃共熱3 h 后，章魚(yú)TM 的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物致敏性可顯著降低，其主要原因是美拉德反應(yīng)引起TM 結(jié)構(gòu)上的變化[68]。Fu 等[69]發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖、低聚殼聚糖和核糖均可在相對(duì)濕度35%，60 ℃共熱4～12 h 的條件下與中國(guó)對(duì)蝦TM 發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而顯著降低TM 的致敏性，其主要原因是TM 的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中致敏原α 螺旋含量顯著下降，β 折疊含量明顯上升，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生較大變化。此外，TM 分子中游離賴氨酸含量降低也是其致敏性降低的原因之一。

酶法交聯(lián)也是較為常用的食品加工脫敏方式之一，其主要原理是酶可催化致敏原分子內(nèi)/間的交聯(lián)，進(jìn)而影響其致敏性[70]。Fei 等[71]報(bào)道青蟹AK經(jīng)45 ℃預(yù)熱30 min，結(jié)合酪氨酸酶和咖啡酸催化處理8 h，AK 分子間發(fā)生交聯(lián)，分子質(zhì)量顯著增加，致敏性明顯下降。Liu 等[72]發(fā)現(xiàn)青蟹TM 在37℃經(jīng)酪氨酸酶和咖啡酸共同催化3 h，形成分子質(zhì)量更大的復(fù)合物，致敏原分子間發(fā)生交聯(lián)，TM 的致敏性明顯下降；同時(shí)，TM 在37 ℃經(jīng)辣根過(guò)氧化物催化3 h 后形成的分子質(zhì)量較大的交聯(lián)復(fù)合物，致敏性也顯著降低。而青蟹SCP 在37 ℃經(jīng)酪氨酸酶和咖啡酸共同催化30 min 后，蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，且SCP 蛋白表位區(qū)域的酪氨酸殘基發(fā)生修飾，最終使SCP 的致敏性顯著降低[66，70]。

常見(jiàn)的高溫?zé)崽幚戆ㄖ笾?、蒸制等方式。?jīng)100 ℃煮制15 min 后的青蟹蟹肉中，AK、TIM 和FLNc 不能被相應(yīng)的多克隆抗體所識(shí)別，其主要原因在于這些致敏原經(jīng)煮制處理，蛋白質(zhì)變性或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗體無(wú)法識(shí)別致敏原的特異性位點(diǎn)[63]。這一情況也發(fā)生在凡納濱對(duì)蝦中[73]，表明大部分的水產(chǎn)食品致敏原可在煮制或蒸制的過(guò)程中被破壞。

雖然美拉德反應(yīng)可在低溫下進(jìn)行，但是在pH、高溫、光照等條件下，其反應(yīng)速率會(huì)明顯提高[74]。Zhao 等[75]發(fā)現(xiàn)木糖與鰱魚(yú)PV 在100 ℃經(jīng)美拉德反應(yīng)100 min，PV 的螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，疏水性增加；糖化產(chǎn)物交聯(lián)形成明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；此外，PV 中的5 個(gè)賴氨酸殘基發(fā)生糖化修飾，其中有3個(gè)賴氨酸殘基位于抗原表位區(qū)域，因此美拉德反應(yīng)后PV 的免疫結(jié)合活性明顯降低。隨后，Hu等[66，70]也報(bào)道青蟹SCP 與木糖在100 ℃經(jīng)美拉德反應(yīng)70 min，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可顯著下調(diào)青蟹過(guò)敏患者嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63 和CD203c 的表達(dá)，其主要原因也包括SCP 蛋白結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的變化，關(guān)鍵抗原表位區(qū)域中半胱氨酸、賴氨酸和精氨酸等的修飾，非表位區(qū)域的氨基酸糖基化修飾及二硫鍵的斷裂。青蟹TM 與阿拉伯糖在100℃經(jīng)美拉德反應(yīng)60 min，AK 與阿拉伯糖在100 ℃經(jīng)美拉德反應(yīng)60 min，反應(yīng)產(chǎn)物均可明顯減緩小鼠的過(guò)敏反應(yīng)，表明其致敏性顯著下降[76]；Bai 等[77]也發(fā)現(xiàn)扇貝TM 與木糖在100 ℃經(jīng)美拉德反應(yīng)60 min，其免疫結(jié)合活性可顯著降低，其原因與Hu等[66，70]報(bào)道類似。

食品加工中常見(jiàn)的超高溫?zé)崽幚戆ê婵尽⒂驼?、高溫高壓處理等。鄭禮娜等[78]發(fā)現(xiàn)煮制、蒸制和高溫壓力（121 ℃，0.10 MPa）均可明顯降低刀額新對(duì)蝦的致敏活性。蔡秋鳳等[79]比較了常規(guī)魚(yú)丸加工方式、烘烤（180 ℃處理2 min）、油炸（180℃炸至金黃）、高壓（115 ℃處理20 min）4 種方式對(duì)鰱魚(yú)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 種方式均可降低PV的含量，進(jìn)而降低其免疫結(jié)合活性；相對(duì)來(lái)說(shuō)，高壓處理可完全破壞PV 的免疫結(jié)合能力。李錚[80]報(bào)道高壓（121 ℃，0.15 MPa 處理30 min）可有效降低PV 的抗原性及變應(yīng)原性。Liu 等[81]發(fā)現(xiàn)高溫高壓處理（115 ℃，0.08 MPa 處理15 min）可有效降低蟹肉中主要致敏原TM 的含量，改變其空間結(jié)構(gòu)[64]，破壞青蟹致敏原的不耐熱的表位，從而降低青蟹的免疫結(jié)合活性。進(jìn)一步，高溫壓力處理提高了對(duì)蝦蝦肉的消化率，改變了蝦肉基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了蝦肉可食部分吸光度峰的藍(lán)移和粒徑的減小，進(jìn)而降低了對(duì)蝦的免疫結(jié)合能力[73]。

熱處理可引起部分水產(chǎn)食品致敏原發(fā)生降解，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。低溫?zé)崽幚砜蓪?duì)致敏原分子進(jìn)行一些化學(xué)修飾；高溫及超高溫?zé)崽幚韯t對(duì)致敏原氨基酸殘基的影響更大?？乖砦簧系陌被釟埢l(fā)生修飾后，其側(cè)鏈上的糖鏈可直接對(duì)表位產(chǎn)生封閉作用；非表位區(qū)域的氨基酸修飾通過(guò)糖鏈形成空間位阻，進(jìn)而影響表位位點(diǎn)與抗體的結(jié)合[66，70]。

2.2 非熱處理降低水產(chǎn)食品致敏原的致敏性

非熱處理是指在常溫或低溫情況下使微生物和酶失活，并能保持食品的新鮮度和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的處理方法[82]。目前研究較多的包括酸堿處理和酶水解。此外，一些低致敏性的新型非熱加工處理技術(shù)，如超聲處理、高靜水壓、輻照等也有報(bào)道。

致敏原的致敏性很大程度上依賴其空間結(jié)構(gòu)的完整性，而其空間結(jié)構(gòu)受pH 值的影響較大，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6]。此外，在低溫和堿性條件下，蛋白質(zhì)特定氨基酸（絲氨酸或蘇氨酸）會(huì)轉(zhuǎn)化為α-氨基酸，從而影響致敏原的抗原表位[83]。小龍蝦AK 在酸性條件（pH 1.0～4.0）下，發(fā)生部分降解，IgE 結(jié)合能力增強(qiáng)；在中性條件下，蛋白條帶較穩(wěn)定；然而，在堿性條件下（pH 9.0～11.0）IgE 結(jié)合能力明顯降低，推測(cè)可能是AK 經(jīng)酸堿處理后內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露在表面，在堿性條件下暴露出的抗原表位不穩(wěn)定，使其免疫結(jié)合能力降低[84]。

雖然都是采用食品級(jí)蛋白酶水解致敏原以降低其致敏性，但是酶解處理與酶法交聯(lián)不同，酶法交聯(lián)的主要目的是催化致敏原之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)以掩蓋其抗原表位，而酶解處理是將大分子的過(guò)敏蛋白水解成小片段或多肽，破壞其空間結(jié)構(gòu)及抗原表位以降低其致敏性[82]。Liu 等[81]報(bào)道了經(jīng)胃腸液連續(xù)消化處理后，青蟹各致敏原在胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶處理下的水解穩(wěn)定性，結(jié)果顯示SCP 被迅速降解；MLC 也易被消化酶水解；TM 雖耐胰蛋白酶水解，但可被胃蛋白酶逐漸水解；在胃腸液連續(xù)消化下，TM 被迅速降解；消化后的SCP、MLC 和TM 的免疫結(jié)合活性明顯降低，表明消化酶水解可有效降低致敏原的免疫結(jié)合能力。對(duì)蝦致敏原在連續(xù)消化后也呈現(xiàn)出類似的情況[85]。

超聲處理可在蛋白質(zhì)中形成空化泡，其收縮、破裂后形成空化區(qū)，出現(xiàn)高溫、高壓、高剪切能波和湍流，嚴(yán)重影響蛋白空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)，或斷裂致敏原肽鏈，影響其抗原表位，進(jìn)而影響致敏原的致敏性[86]。Zhang 等[87]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲（100～800 W，15 min）可解開(kāi)秀麗白蝦TM 的α 螺旋，破壞蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白發(fā)生降解，并誘導(dǎo)TM 中的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生自由基氧化，從而降低其致敏性。

高靜水壓（High hydrostatic pressure）是一種新的加工技術(shù)，是指使用100～800 MPa 的壓力來(lái)滅活致病微生物并延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[82]，可通過(guò)引起蛋白分子可逆或不可逆的結(jié)構(gòu)修飾，導(dǎo)致聚集、碎片、變性或糊化，從而改變致敏原的致敏性。Jin 等[88]發(fā)現(xiàn)在壓力200～600 MPa 下章魚(yú)TM 分子中的α 螺旋含量和游離巰基含量逐漸降低，表面疏水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，表明其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，其免疫結(jié)合活性也逐漸降低。

輻照對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和感官特性的影響很小，目前被允許應(yīng)用于全球60 多個(gè)國(guó)家的40 種食品[82]。食品經(jīng)輻照后會(huì)引起蛋白空間構(gòu)象的變化，包括裂解、聚集、交聯(lián)、氧化和氨基酸修飾等，進(jìn)而改變致敏原的致敏性[89]。Guan 等[90]報(bào)道對(duì)蝦TM在7 kGy 的電子束輻照劑量下，其IgG 結(jié)合能力降低了59%，并推測(cè)其主要原因可能是由于TM的α 螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

復(fù)合加工方式，通常包括2 種及以上加工方式，可確保食品的安全性和穩(wěn)定性及感官和營(yíng)養(yǎng)特性[82]。Yu 等[91]發(fā)現(xiàn)超聲（200 W，30 ℃，60 min）與煮制（20 min）復(fù)合加工處理青蟹TM 后，TM 的可消化性顯著升高，IgE 結(jié)合能力顯著下降。Long等[92]采用超高壓（500 MPa）結(jié)合熱處理（55 ℃）復(fù)合加工處理對(duì)蝦TM 10 min，TM 的致敏性降低了73.59%。胡志和等[93]報(bào)道超高壓（200 MPa）結(jié)合酶解（胰蛋白酶3 000 U/g，40°C）處理30 min，對(duì)蝦TM 的致敏性消減率達(dá)98%，其主要原因是復(fù)合加工有助于TM 結(jié)構(gòu)的破壞和線性表位的斷裂。Liu等[94]發(fā)現(xiàn)低溫美拉德反應(yīng)（半乳糖，4 ℃，2 h）結(jié)合高溫壓力（115 ℃，0.08 MPa）處理6 min，可顯著改變對(duì)蝦蝦肉的微觀結(jié)構(gòu)，降低其IgE 和IgG 結(jié)合能力，并推測(cè)其原因可能是由于蝦中各致敏原抗原表位氨基酸殘基的修飾。

3 水產(chǎn)食品過(guò)敏的防控技術(shù)

水產(chǎn)食品過(guò)敏的治療遵循食品過(guò)敏的治療方案。由于食品過(guò)敏誘因多、癥狀復(fù)雜，免疫學(xué)機(jī)制未被完全闡明，因此臨床上仍無(wú)完全根治的有效措施[95]。一旦發(fā)生食品過(guò)敏性疾病，一般采用藥物治療的手段進(jìn)行控制。此外，近年來(lái)針對(duì)食品過(guò)敏的致敏原特異療法和其它非特異性療法相關(guān)研究也越來(lái)越多。

食品過(guò)敏的發(fā)病癥狀復(fù)雜，表現(xiàn)在消化道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚系統(tǒng)等多個(gè)方面。過(guò)敏癥狀發(fā)生后，通常需要通過(guò)藥物控制。常用的過(guò)敏藥物有抗組胺藥和肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，包括氯雷他定、西替利嗪和色甘酸鈉等，然而，這些并非單一針對(duì)食品過(guò)敏的藥物，只能在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生后發(fā)揮對(duì)癥治療的效果[96-97]。奧馬珠單抗是重組人源化抗IgE 的單克隆抗體，與機(jī)體內(nèi)游離IgE 結(jié)合，阻斷IgE 介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。在一項(xiàng)針對(duì)37 種食品過(guò)敏的15名兒童的研究中發(fā)現(xiàn)，奧馬珠單抗能夠增加患者食品致敏原的閾值至8.6 倍，治療4 個(gè)月后，共有70.4%的受試者耐受了完全激發(fā)劑量，有效治療了兒童多種食品過(guò)敏疾病[98]。無(wú)論是單獨(dú)用于食品過(guò)敏治療，還是聯(lián)合口服特異性治療，奧馬珠單抗均能發(fā)揮良好的治療效果，其能夠減少免疫治療時(shí)的不良反應(yīng)，有利于快速脫敏[99-100]。然而，特異性針對(duì)食品過(guò)敏的藥物有待深入挖掘，現(xiàn)有藥物治療食品過(guò)敏的安全性和有效性也有待證實(shí)。

3.1 致敏原特異性療法

致敏原特異性免疫療法 （Allergen-specific immunotherapy，AIT） 是一種很有前景的可治療由IgE 介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病的方法。該療法的最終目標(biāo)是在停止給藥后，患者可以正常食用或接觸致敏原而不出現(xiàn)過(guò)敏癥狀。近年來(lái)，AIT 技術(shù)在吸入性過(guò)敏性疾病的治療研究中已初見(jiàn)成效[101]，而食品過(guò)敏的AIT 研究因治療周期長(zhǎng)、患者依從性問(wèn)題以及治療過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的過(guò)敏副作用而阻礙了其在臨床上的應(yīng)用及推廣[102]。為提高AIT 技術(shù)在食品過(guò)敏臨床研究中的可行性與安全性，制備改造的低致敏性衍生物替代天然致敏原，進(jìn)行脫敏治療勢(shì)在必行。

低致敏性食品致敏原衍生物構(gòu)建的一般策略是利用化學(xué)修飾或基因工程技術(shù)使重組致敏原在保持致敏原免疫原性的同時(shí)減少致敏原性，且副作用小[101]。目前，已有多種化學(xué)修飾的致敏原衍生物（如碘乙酰胺烷基化的花生致敏原）可有效降低與患者血清中特異性IgE 的結(jié)合，同時(shí)能有效減緩小鼠的過(guò)敏癥狀[103]。此外，多種基因工程模式也已發(fā)展起來(lái)，包括IgE 結(jié)合表位的定點(diǎn)突變、致敏原序列的刪除重組等[101]。Wai 等[104]通過(guò)定點(diǎn)突變和刪除IgE 結(jié)合表位構(gòu)建了Met e 1 的2 種低致敏性衍生物，且在小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)具有抑制功能的IgG 抗體。此外，一項(xiàng)涉及15 例魚(yú)類過(guò)敏患者的臨床研究結(jié)果顯示：設(shè)計(jì)的Cyp c 1 突變低致敏性疫苗免疫患者，可有效降低IgE 反應(yīng)性并誘導(dǎo)特異性IgG 抗體的產(chǎn)生，且副作用較低[105-106]?？偟膩?lái)說(shuō)，低致敏性食品致敏原衍生物在臨床前研究和三期試驗(yàn)中很有前景，適合于重組AIT 疫苗的研制，然而，迄今為止大部分還局限于構(gòu)建的早期階段和臨床前表征階段，未來(lái)仍需要更多高質(zhì)量、大樣本的臨床及基礎(chǔ)研究來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)AIT 在水產(chǎn)食品過(guò)敏治療中的應(yīng)用效果[107-108]。

3.2 非特異性療法

由于食品過(guò)敏性疾病治療的復(fù)雜性和困難性，因此致敏原非特異性療法的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，主要包括益生菌佐劑療法和天然產(chǎn)物抗過(guò)敏療法，這些療法各具優(yōu)勢(shì)，同時(shí)存在不同程度的局限和風(fēng)險(xiǎn)。

腸道微生態(tài)和免疫性疾病關(guān)系甚密，腸道微生物能夠改變腸道屏障和免疫反應(yīng)模式，參與到食品過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中。有研究發(fā)現(xiàn)益生菌能夠維持腸道穩(wěn)態(tài)而建立免疫耐受并阻斷食品過(guò)敏發(fā)展進(jìn)程[109]。Fu 等[110]利用貝類主要致敏原TM 建立的小鼠食品過(guò)敏模型，驗(yàn)證了乳酸桿菌（Lactobacillus caseiZhang）通過(guò)誘發(fā)耐受性免疫細(xì)胞緩解食品過(guò)敏的能力，主要靶向NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮功能。用乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）治療TM致敏小鼠后，小鼠Treg 細(xì)胞相關(guān)的Foxp3 和TGF-β 水平增加，而Th17 相關(guān)的IL-17A 和IL-23 的相對(duì)mRNA 水平降低，以此有效緩解食品過(guò)敏癥狀[111]。此外，口服雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis14.518） 能夠預(yù)防和抑制TM 誘導(dǎo)的小鼠食品過(guò)敏反應(yīng)，其通過(guò)刺激DC 成熟和誘導(dǎo)CD103+DC 產(chǎn)生，促進(jìn)Treg 分化，抑制Th2 反應(yīng)，從而減輕食品過(guò)敏腸道炎癥[112]。益生菌對(duì)于食品過(guò)敏防控的重要性顯而易見(jiàn)，而現(xiàn)有研究多基于動(dòng)物模型，在體研究和長(zhǎng)期安全性等需深入探究。

隨著天然活性物質(zhì)挖掘和研究的不斷開(kāi)展，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥、陸生植物及海洋資源均是天然活性產(chǎn)物的豐富源泉。研究發(fā)現(xiàn)多種天然活性產(chǎn)物具有抗過(guò)敏的生物活性，其作用機(jī)制各有不同，在食品過(guò)敏的致敏階段和效應(yīng)階段均有顯著影響[113-114]。傳統(tǒng)中藥Food Allergy Herbal Formula 2（FAHF-2）能夠預(yù)防小鼠的全身過(guò)敏反應(yīng)，并對(duì)T 細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞有較好的安全性和初步的免疫調(diào)節(jié)活性，其最重要的活性成分是小檗堿，F(xiàn)AHF-2 聯(lián)合口服免疫治療和奧馬珠單抗治療多種食品過(guò)敏已進(jìn)入II 期臨床試驗(yàn)[115-116]。黃酮類化合物是重要的天然產(chǎn)物活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制肥大細(xì)胞激活，有望成為治療食物過(guò)敏的候選分子[117-118]。

在廣袤的海洋資源中，多種活性物質(zhì)被證實(shí)具有良好的抗過(guò)敏活性[114]。研究最為廣泛的是巖藻聚糖，其能夠影響DC 的成熟和功能，通過(guò)控制Th1 調(diào)節(jié)T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[119]。最新研究發(fā)現(xiàn)口服巖藻聚糖可增加過(guò)敏小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中半乳糖凝集素-9 的基因表達(dá)，從而抑制肥大細(xì)胞激活并緩解小鼠食品過(guò)敏反應(yīng)[120]。來(lái)自紅藻的硫酸多糖能夠有效控制食品過(guò)敏反應(yīng)，作用機(jī)制多為促進(jìn)Treg分化，抑制Th2 細(xì)胞的產(chǎn)生[121-122]；而低分子質(zhì)量的紅藻寡糖具有更好的生物利用度，發(fā)揮優(yōu)于多糖的抗過(guò)敏活性，并能夠影響肥大細(xì)胞的激活[123-124]。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)海洋微生物來(lái)源的次級(jí)代謝產(chǎn)物能夠直接靶向肥大細(xì)胞，影響其激活和功能，從而發(fā)揮抗過(guò)敏作用[125-126]。關(guān)于食品過(guò)敏的非特異性治療研究甚多，然而，大都僅限于細(xì)胞和小鼠模型的活性驗(yàn)證，深層次的作用機(jī)制、在體治療的有效性、長(zhǎng)期使用的安全性等仍有待深入探究。

4 小結(jié)

隨著人們生活水平的提高，魚(yú)類、甲殼類、貝類等水產(chǎn)食品引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)屢見(jiàn)不鮮。針對(duì)水產(chǎn)食品致敏原的性質(zhì)研究和檢測(cè)手段的革新亟待開(kāi)展，關(guān)于致敏原抗原表位和物種交叉的探究仍需長(zhǎng)期進(jìn)行。從加工過(guò)程中改變致敏原致敏性是控制水產(chǎn)食品過(guò)敏的有效手段之一，開(kāi)發(fā)用于家庭生活的可降低致敏原致敏性的加工處理手段是預(yù)防水產(chǎn)食品過(guò)敏的重要研究方向?；谥旅粼奶禺愋悦庖忒煼ê吞烊划a(chǎn)物抗過(guò)敏的探究，有望成為水產(chǎn)食品過(guò)敏的有效治療手段。