基于雷公法結(jié)合鹽炙法對(duì)補(bǔ)骨脂的炮制及肝毒性評(píng)價(jià)

洪 麗，王 哲，湯小涵，袁海龍*

基于雷公法結(jié)合鹽炙法對(duì)補(bǔ)骨脂的炮制及肝毒性評(píng)價(jià)

洪 麗1, 2，王 哲2，湯小涵2，袁海龍1, 2*

1.安徽醫(yī)科大學(xué)空軍臨床學(xué)院，安徽 合肥 230032 2.空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142

基于雷公法結(jié)合鹽炙法對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制減毒并評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂炮制前后的肝毒性變化。建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素和補(bǔ)骨脂酚6個(gè)指標(biāo)成分的含量；選取醇濃度、醇浸時(shí)間和蒸制時(shí)間為考察因素，以指標(biāo)成分含量下降率的綜合加權(quán)評(píng)分為指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化炮制工藝，并通過(guò)小鼠肝毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂炮制前后的肝毒性。補(bǔ)骨脂最佳炮制工藝，按《中國(guó)藥典》2020年版鹽炙法制備鹽補(bǔ)骨脂，取鹽補(bǔ)骨脂適量，加入5倍量80%乙醇浸泡24 h，倒出乙醇并用蒸餾水洗凈，加入5倍量蒸餾水，浸泡12 h，倒出蒸餾水并洗凈，置蒸鍋內(nèi)隔水蒸4 h，取出晾干；由該法炮制所得的補(bǔ)骨脂炮制品中毒性成分含量明顯下降，小鼠肝毒性顯著降低。該炮制方法可明顯降低補(bǔ)骨脂的肝毒性，為臨床合理炮制補(bǔ)骨脂提供參考。

補(bǔ)骨脂；雷公法；鹽炙法；炮制減毒；正交試驗(yàn)；肝毒性；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；新補(bǔ)骨脂異黃酮；補(bǔ)骨脂甲素；補(bǔ)骨脂乙素；補(bǔ)骨脂酚

補(bǔ)骨脂，又名破故紙，是豆科一年生直立草本補(bǔ)骨脂L.的干燥成熟果實(shí)，性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，臨床用于治療腎陽(yáng)不足、腰膝冷痛、五更泄瀉等，外用治白癜風(fēng)及斑禿[1]。現(xiàn)代藥理研究表明補(bǔ)骨脂具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤和抗氧化等藥理作用[2]。然而，近年來(lái)臨床相繼出現(xiàn)了補(bǔ)骨脂及其復(fù)方制劑長(zhǎng)期或大劑量使用致嚴(yán)重肝損害的案例報(bào)道[3-6]，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外研究者及藥監(jiān)部門(mén)的廣泛關(guān)注，這在一定程度上限制了補(bǔ)骨脂及其復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用。因此，探索有效的減毒方法，促進(jìn)補(bǔ)骨脂及其復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展顯得尤為重要。

合理炮制是降低中藥毒性的有效方法之一，文獻(xiàn)報(bào)道的補(bǔ)骨脂炮制減毒方法有鹽炙法、雷公法、酒焙法、清炒法等，其中以鹽炙法為主[7-8]，《中國(guó)藥典》2020年版一部收載的補(bǔ)骨脂炮制品為鹽補(bǔ)骨脂[1]。補(bǔ)骨脂鹽炙不僅是引藥下行、增補(bǔ)肝腎，還能通過(guò)除去藥物中的燥性達(dá)到減毒的目的[9]。但是，研究發(fā)現(xiàn)鹽補(bǔ)骨脂仍然具有一定的肝毒性[10-11]，影響其臨床應(yīng)用的安全性。

文獻(xiàn)報(bào)道，《雷公炮炙論》記載的酒浸水漂法（雷公法）可有效降低補(bǔ)骨脂的潛在肝毒性[12]。因此，本研究嘗試將鹽炙法與雷公法結(jié)合對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制減毒研究，以補(bǔ)骨脂中致毒的關(guān)鍵成分補(bǔ)骨脂酚、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素[13]及毒效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量變化為指標(biāo)，重點(diǎn)對(duì)雷公法進(jìn)行炮制工藝優(yōu)化，并初步評(píng)價(jià)其炮制減毒效果。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BT25S電子天平（十萬(wàn)分之一分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200-B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16-W高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；ASP300S型全自動(dòng)封閉脫水機(jī)（Leica公司）；RM2135型切片機(jī)（Leica公司）；BX51型顯微鏡（OLYMPUS公司）；BMJ-1型包埋機(jī)（天津航空機(jī)電公司）；S1-M82型打粉機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；蒸鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；C21-RT2149美的電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；藥典三號(hào)篩（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)骨脂（產(chǎn)地河南，購(gòu)自北京人衛(wèi)中藥飲片有限公司，批號(hào)為20110306）經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心袁海龍主任藥師鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂L.的干燥成熟果實(shí)；對(duì)照品補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚（批號(hào)分別為20062812、20061812、20062205、20060805、20121110、20060912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%）均購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)分別為20201206、20201112）；食鹽（中鹽鹽業(yè)有限公司）；4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20200508）；95%藥用乙醇（南京潤(rùn)升石化有限公司）；乙腈和甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2018-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為空特（科研）第2021-87-PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂中指標(biāo)成分定量分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0～12 min，48%～53%A；12～30 min，53%～70%A；30～40 min，70%～85%A；40～45 min，85%A；45～50 min，85%～48%A。柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品補(bǔ)骨脂素15.00 mg、異補(bǔ)骨脂素5.80 mg、新補(bǔ)骨脂異黃酮9.80 mg、補(bǔ)骨脂甲素8.00 mg、補(bǔ)骨脂乙素9.00 mg分別于10 mL量瓶中，甲醇定容，制成含1.50 mg/mL補(bǔ)骨脂素、580 μg/mL異補(bǔ)骨脂素、980 μg/mL新補(bǔ)骨脂異黃酮、800 μg/mL補(bǔ)骨脂甲素、900 μg/mL補(bǔ)骨脂乙素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取補(bǔ)骨脂酚21.80 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，制成872 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密量取1 mL補(bǔ)骨脂素、2 mL異補(bǔ)骨脂素、0.5 mL新補(bǔ)骨脂異黃酮、0.5 mL補(bǔ)骨脂甲素、0.5 mL補(bǔ)骨脂乙素、5 mL補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品儲(chǔ)備液于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，制成含150 μg/mL補(bǔ)骨脂素、116 μg/mL異補(bǔ)骨脂素、49 μg/mL新補(bǔ)骨脂異黃酮、40 μg/mL補(bǔ)骨脂甲素、45 μg/mL補(bǔ)骨脂乙素、436 μg/mL補(bǔ)骨脂酚的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取補(bǔ)骨脂適量粉碎，過(guò)三號(hào)篩，精密稱(chēng)取粉末0.1 g，置25 mL量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取適量，15 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液的進(jìn)樣溶液。

2.1.5 陰性對(duì)照溶液 以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.1.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取陰性對(duì)照、混合對(duì)照品及供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚色譜峰均能實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計(jì)均不低于3000，且陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

1-補(bǔ)骨脂素 2-異補(bǔ)骨脂素 3-新補(bǔ)骨脂異黃酮 4-補(bǔ)骨脂甲素 5-補(bǔ)骨脂乙素 6-補(bǔ)骨脂酚

2.1.7 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容后，再同法逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥梢幌盗袧舛忍荻鹊幕旌蠈?duì)照品溶液，分別取10 μL按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積（）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)表1。結(jié)果表明6種指標(biāo)成分在一定的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 指標(biāo)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取“2.1.7”項(xiàng)下中間濃度混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為0.44%、0.60%、0.51%、1.31%、1.37%、0.49%。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂粉末0.1 g，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為0.52%、0.42%、1.10%、1.05%、1.63%、0.87%。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂粉末0.1 g，共6份，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算各指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚含量的RSD分別為0.81%、0.81%、1.02%、1.70%、1.60%、0.69%。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂粉末0.1 g，共9份，分別按指標(biāo)成分含量的80%、100%、120%加入對(duì)照品，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚的平均加樣回收率分別為103.46%、105.09%、92.91%、96.55%、100.02%、99.72%，RSD分別為0.62%、1.65%、1.90%、1.69%、1.18%、1.44%。

2.2 補(bǔ)骨脂炮制工藝研究

2.2.1 補(bǔ)骨脂鹽炙 照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則（0213）鹽炙法，取凈補(bǔ)骨脂藥材100 g，鹽水20 mL（含鹽2 g）悶潤(rùn)4 h，傾出鹽水，在炒藥鍋中炒制，文火炒至膨脹，崩裂，表面呈黑色或黑褐色，氣清香，味微咸，放涼即可，備用。

2.2.2 鹽補(bǔ)骨脂雷公法炮制 取同一批次的鹽補(bǔ)骨脂適量，對(duì)其進(jìn)行雷公法炮制。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)方法[12]，選取醇濃度（A）、醇浸時(shí)間（B）和蒸制時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以補(bǔ)骨脂酚、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量下降率的綜合加權(quán)評(píng)分為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化炮制工藝，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

按L9(34)正交表進(jìn)行補(bǔ)骨脂炮制品的制備，并采用建立的HPLC方法測(cè)定各炮制品中指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算含量下降率。

下降率＝(補(bǔ)骨脂相應(yīng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)－炮制品相應(yīng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù))/補(bǔ)骨脂相應(yīng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用綜合加權(quán)評(píng)分法評(píng)價(jià)指標(biāo)成分的變化。根據(jù)各成分在補(bǔ)骨脂中的含量高低和毒性強(qiáng)弱[13]，指定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素和補(bǔ)骨脂酚的權(quán)重系數(shù)分別為10%、10%、20%、12%、18%、30%，計(jì)算綜合加權(quán)評(píng)分（）。

＝1×10%＋2×10%＋3×20%＋4×12%＋5×18%＋6×30%

123456分別為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素和補(bǔ)骨脂酚的含量下降率

越高，補(bǔ)骨脂毒性成分降低越多，炮制品越優(yōu)，炮制工藝越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3直觀分析可知，影響炮制工藝的主次順序?yàn)锳＞B＞C，表4方差分析結(jié)果表明醇濃度和醇浸時(shí)間對(duì)炮制工藝影響顯著，結(jié)合生產(chǎn)成本因素確定最優(yōu)工藝為A2B3C1。即醇濃度80%，醇浸時(shí)間24 h，蒸制時(shí)間4 h。因此，補(bǔ)骨脂最佳炮制工藝：按《中國(guó)藥典》鹽炙法制備鹽補(bǔ)骨脂，取鹽補(bǔ)骨脂適量，加入5倍量80%藥用乙醇浸泡24 h，倒出藥用乙醇并用蒸餾水洗凈，加入5倍量蒸餾水，浸泡12 h，倒出蒸餾水并洗凈，置蒸鍋內(nèi)隔水蒸4 h，取出晾干。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

2.2.3 工藝驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述炮制工藝的可行性和穩(wěn)定性，平行制備3份炮制品。按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定炮制品中指標(biāo)成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。與補(bǔ)骨脂比較，炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量分別上升15.45%、5.61%，新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素和補(bǔ)骨脂酚的含量分別下降72.23%、84.38%、74.75%、61.87%，且平行實(shí)驗(yàn)獲得的炮制品中指標(biāo)成分含量基本沒(méi)有差異，表明該炮制工藝有很好的重復(fù)性。

表5 驗(yàn)證結(jié)果

2.3 肝毒性評(píng)價(jià)

2.3.1 供試藥物的制備 取補(bǔ)骨脂炮制品40 g，加8倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液后濃縮至100 mL，即得補(bǔ)骨脂炮制品水提液[14]。同法制備補(bǔ)骨脂水提液。

2.3.2 分組與給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組7只。對(duì)照組ig給予等體積蒸餾水，補(bǔ)骨脂炮制品低（1.5 g/kg）、中（3 g/kg）、高（6 g/kg）劑量組，補(bǔ)骨脂低（1.5 g/kg）、中（3 g/kg）、高（6 g/kg）劑量組，每日給藥1次，連續(xù)ig給藥7 d。

2.3.3 血清生化檢測(cè) 小鼠ig給藥結(jié)束后，禁食不禁水過(guò)夜，摘眼球取血，室溫下3500 r/min離心10 min，分離血清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定ALT、AST，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3.4 肝臟系數(shù)及組織病理學(xué)檢查 剖腹摘取小鼠肝臟，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)（肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量），結(jié)果見(jiàn)表6。切取小鼠一葉肝臟于4%多聚甲醛溶液中固定，固定液為組織體積的5～10倍，固定48 h后，石蠟切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病變（圖2）。

與對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂高、中劑量組ALT明顯升高（＜0.01，0.001），補(bǔ)骨脂高、中、低劑量組AST顯著升高（＜0.001），補(bǔ)骨脂高、中劑量組肝系數(shù)明顯升高（＜0.01，0.001），補(bǔ)骨脂炮制品組無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂高、中劑量組肝臟明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血；炮制品組肝臟未見(jiàn)明顯異常改變。結(jié)果表明補(bǔ)骨脂炮制品的肝毒性顯著降低。

表6 各組小鼠肝臟系數(shù)和血清ALT、AST測(cè)定結(jié)果()

與對(duì)照組比較，**＜0.01***＜0.001

**< 0.01***< 0.001 vs control group

圖2 小鼠肝組織病理形態(tài)（HE，×200）

綜上，基于雷公法結(jié)合鹽炙法對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制，可明顯降低毒性指標(biāo)成分的含量，且通過(guò)小鼠給藥補(bǔ)骨脂肝毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，說(shuō)明該法可達(dá)到炮制減毒目的。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次將鹽炙法和雷公法結(jié)合對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制減毒，建立了同時(shí)測(cè)定補(bǔ)骨脂中6種指標(biāo)成分含量測(cè)定的HPLC。結(jié)果表明該炮制方法可顯著降低毒性成分的含量。小鼠肝毒性結(jié)果顯示該炮制方法所得補(bǔ)骨脂與生品給藥相同劑量及時(shí)間，補(bǔ)骨脂生品表現(xiàn)出明顯的肝損傷，而補(bǔ)骨脂炮制品未見(jiàn)肝損傷，表明該炮制方法能夠有效降低生補(bǔ)骨脂肝毒性[14]。

補(bǔ)骨脂炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量相比補(bǔ)骨脂生品有所提高，可能在炮制過(guò)程中由補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷轉(zhuǎn)化而來(lái)[15]，使補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量保持在有效劑量范圍內(nèi)，而其余毒性指標(biāo)成分大大降低，保障了補(bǔ)骨脂用藥的安全性及有效性。炮制品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂乙素的含量均顯著下降，可能是由于其都屬于二氫黃酮類(lèi)，在高溫下不穩(wěn)定，A環(huán)開(kāi)環(huán)發(fā)生降解所致，且在炮制過(guò)程中，加入高濃度的藥用乙醇長(zhǎng)時(shí)間浸泡，溶于乙醇也使其含量降低。補(bǔ)骨脂酚是一種異戊二烯基酚萜類(lèi)化合物，是補(bǔ)骨脂揮發(fā)油的主要成分，易氧化，且在炮制過(guò)程中受熱揮發(fā)，是其含量下降的主要原因。

補(bǔ)骨脂生品經(jīng)過(guò)鹽炙法炮制再雷公法炮制，最終得到補(bǔ)骨脂炮制品，實(shí)驗(yàn)測(cè)得中間炮制品鹽補(bǔ)骨脂中指標(biāo)成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚的含量分別為7.824、10.030、3.078、1.502、2.772、47.208 mg/g，與生品比較，毒效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量分別上升117.03%、127.70%，說(shuō)明鹽炙法能夠增強(qiáng)補(bǔ)骨脂溫腎助陽(yáng)、補(bǔ)腎納氣的功效[16]；毒性成分新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚的含量分別下降29.53%、52.14%、38.17%、29.18%，說(shuō)明鹽炙法具有炮制減毒的作用[17]。但研究已證明鹽補(bǔ)骨脂的毒性仍然存在，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)鹽補(bǔ)骨脂進(jìn)行雷公法再炮制，由結(jié)果可知，與生品相比，最終炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量略微上升，而新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚的含量大大降低，說(shuō)明該炮制方法可保障補(bǔ)骨脂的的有效性及安全性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)合理炮制選擇性減少毒性指標(biāo)成分的含量，在一定程度上降低了補(bǔ)骨脂的毒性，由于中藥成分的復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)僅以6個(gè)毒性指標(biāo)成分評(píng)價(jià)炮制減毒工藝存在一定的局限性，有關(guān)補(bǔ)骨脂更多毒性物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典[S].一部.2020: 195.

[2] 楊闊, 高茸, 馬亞中, 等.補(bǔ)骨脂素藥理作用及肝毒性機(jī)制的研究進(jìn)展 [J].中草藥, 2021, 52(1): 289-298.

[3] 張守學(xué), 趙玉斌, 孟云輝.含補(bǔ)骨脂中藥湯劑致嚴(yán)重急性藥物性肝損傷1例 [J].臨床合理用藥雜志, 2020, 13(25): 127-128.

[4] 李珊, 王秀娟, 莊偉, 等.39例仙靈骨葆膠囊不良反應(yīng)/事件分析 [J].中國(guó)藥師, 2019, 22(6): 1068-1071.

[5] 周學(xué)士, 尹翠蘭, 陸忠華, 等.骨康膠囊引起嚴(yán)重肝損害2例及經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn) [J].實(shí)用肝臟病雜志, 2017, 20(2): 250-251.

[6] 楊莉, 王昭昕, 盧國(guó)彥, 等.補(bǔ)骨脂水提藥渣大鼠三個(gè)月卡期毒性試驗(yàn)研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究, 2019, 42(6): 1128-1134.

[7] 葉斌斌, 敖楠楠, 姜明月, 等.補(bǔ)骨脂酒制工藝的優(yōu)化 [J].中成藥, 2019, 41(1): 182-185.

[8] 郭兆娟, 張晶璇, 涂燦, 等.關(guān)于中藥潛在肝毒性若干問(wèn)題的思考 [J].中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(11): 5399-5402.

[9] 劉巧, 郭延麗, 董泰瑋, 等.補(bǔ)骨脂肝損傷機(jī)制及減毒方法研究進(jìn)展 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(11): 233-239.

[10] 趙瀟, 蔡濤濤, 郭欣, 等.鹽補(bǔ)骨脂水提物對(duì)不同性別大鼠的長(zhǎng)期毒性研究 [J].中國(guó)藥物警戒, 2021, 18(5): 438-443.

[11] 王月清, 何登明.鹽補(bǔ)骨脂致藥物性肝損傷1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí) [J].實(shí)用醫(yī)藥雜志, 2018, 35(8): 724-725.

[12] 宋迪, 陳帥帥, 李朋彥, 等.補(bǔ)骨脂潛在肝毒性的修制減毒方法研究: 酒浸水漂法 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(2): 276-282.

[13] 李佳妍, 劉欣欣, 寧青, 等.基于斑馬魚(yú)模型的補(bǔ)骨脂毒性相關(guān)成分群的高效辨識(shí)研究 [J].中草藥, 2021, 52(1): 129-136.

[14] 郭兆娟, 張晶璇, 康倩君, 等.補(bǔ)骨脂對(duì)大鼠、小鼠肝毒性的比較 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(22): 16-25.

[15] 呂彬, 譚旺曉, 劉瀟, 等.補(bǔ)骨脂“雷公炮制法”減毒的科學(xué)內(nèi)涵 [J].天津中醫(yī)藥, 2020, 37(9): 976-983.

[16] 汪小莉, 江瑜, 范蘭蘭, 等.新安醫(yī)家陳嘉謨“入鹽走腎臟”的現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J].中草藥, 2020, 51(5): 1336-1342.

[17] 吳育, 許妍, 吳麗, 等.補(bǔ)骨脂臨床不良反應(yīng)報(bào)道、毒性研究及減毒思考[J/OL].中藥藥理與臨床: [2021-08-18].https://doi.org/10.13412/j.cnki.zyyl.2021 0609.009.

Processing ofbased on combination of Leigong method and salt processed method and its hepatotoxicity evaluation

HONG Li1, 2, WANG Zhe2, TANG Xiao-han2, YUAN Hai-long1, 2

1.Air Force Clinical College,Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2.Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, Beijing 100142, China

Buguzhi (, PF) was processed based on combination of Leigong method and salt processed method, and the hepatotoxicity of PF before and after processing were evaluated.An HPLC method was established for simultaneous determination of 6 index components (psoralen, isopsoralen, neobavaisoflavone, bavachin, isobavachalcone and bakuchiol) in PF.With alcohol concentration, alcohol soaking time and steaming time as the investigation factors, the processing technology was optimized by orthogonal test with the comprehensive weighted score of the decrease rate of index components content as the index, and the hepatotoxicity of PF before and after processing was evaluated by hepatotoxicity test in mice.The optimal processing technology was as follows: the salt-processed PF was prepared according to the Chinese Pharmacopoeia, and then was soaked in 5 times the amounts of 80% medicinal ethanol for 24 h.After removing the medicinal ethanol and washing with distilled water, the PF was further soaked in 5 times the amounts of distilled water for 12 h.After removing the distilled water and washing with fresh distilled water, the PF was steamed in a steamer for 4 h and then air-dried.The content of toxic components in the processed PF were significantly reduced, and hepatotoxicity in mice was significantly reduced.The processing method can significantly reduce the hepatotoxicity of PF, and provide reference for rational clinical processing of PF.

; Leigong method; salt processed method; processing attenuation; orthogonal test; hepatotoxicity; psoralen; isopsoralen; neobavaisoflavone; bavachin; isobavachalcone; bakuchiol

R286

A

0253 - 2670(2021)22 - 6983 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.025

2021-05-06

軍隊(duì)后勤目錄重點(diǎn)課題（BKJ15J005）

洪 麗，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail: 2385517652@qq.com

通信作者：袁海龍，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]