紋黨米炒前后體外抗氧化活性及干預(yù)脾虛泄瀉大鼠的藥效對(duì)比研究

帖曉燕，張?jiān)弃Q，張文廣，王 丹，辛國(guó)雄，李 蕓*，胡芳弟

? 藥理與臨床?

紋黨米炒前后體外抗氧化活性及干預(yù)脾虛泄瀉大鼠的藥效對(duì)比研究

帖曉燕1，張?jiān)弃Q1，張文廣1，王 丹1，辛國(guó)雄1，李 蕓1*，胡芳弟2

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

研究紋黨米炒前后體外抗氧化活性變化規(guī)律及干預(yù)脾虛泄瀉大鼠的藥效差異。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2-氮雜雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）2種方法，考察紋黨米炒前后體外抗氧化活性的變化規(guī)律。建立脾虛泄瀉大鼠模型，給予硫酸阿托品注射液、紋黨和米炒紋黨水提液進(jìn)行干預(yù)，記錄各組大鼠體質(zhì)量；計(jì)算各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中胃動(dòng)素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、淀粉酶（amylase，AMS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-10水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠十二指腸、空腸組織病理改變情況，比較紋黨米炒前后治療脾虛泄瀉大鼠在免疫調(diào)節(jié)和消化吸收方面的療效差異。體外抗氧化結(jié)果顯示，紋黨、米炒紋黨的清除DPPH自由基半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為（0.041±0.110）、（0.029±0.140）g/mL；其清除ABTS自由基IC50分別為（0.038±0.050）、（0.029±0.100）g/mL。藥效結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、TNF-α、IL-10、MTL、GAS、VIP及AMS水平明顯下降（＜0.05），IL-6水平明顯上升（＜0.05），小腸病理切片結(jié)果顯示十二指腸、空腸病變嚴(yán)重。與模型組比較，各給藥組脾臟指數(shù)及血清TNF-α、IL-10、IL-6水平均具有明顯差異（＜0.05）；除紋黨低劑量組胸腺指數(shù)，紋黨中、低劑量組與米炒紋黨低劑量組MTL水平以及紋黨低劑量組GAS水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異外，其余各給藥組均可使大鼠胸腺指數(shù)、MTL、GAS、VIP及AMS水平明顯上升（＜0.05），各給藥組十二指腸、空腸病變不同程度地恢復(fù)。與相同劑量生品組比較，米炒紋黨高、中劑量組脾臟指數(shù)及米炒紋黨高、低劑量組胸腺指數(shù)明顯上升（＜0.05），米炒紋黨高、中、低劑量組TNF-α、IL-10、GAS及VIP水平，米炒紋黨高劑量組MTL水平以及米炒紋黨中劑量組AMS水平明顯上升（＜0.05），米炒紋黨高、中劑量組IL-6水平明顯下降（＜0.05）。紋黨米炒后抗氧化活性增強(qiáng)；紋黨生熟飲片對(duì)脾虛泄瀉大鼠免疫調(diào)節(jié)和消化吸收方面均具有明顯治療作用，且米炒品明顯強(qiáng)于生品，可能與調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-10水平密切相關(guān)，說(shuō)明米炒紋黨增強(qiáng)和胃健脾止瀉的科學(xué)性、合理性。

紋黨；米炒紋黨；抗氧化；和胃健脾止瀉；消化吸收功能；免疫調(diào)節(jié)功能

黨參為典型的多基原中藥，為桔梗科植物黨參(Franch.) Nannf.、素花黨參Nannf.var.(Nannf.) L.T.Shen或川黨參Oliv.的干燥根[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)?、改善心血管功能、抗氧化、抗衰老等作用[2-3]，對(duì)脾肺氣虛、中氣不足、脾胃虛弱、熱病傷津等均有良好的療效。紋黨為素花黨參的干燥根，是甘肅文縣特產(chǎn)，其有效成分含量居各類黨參之首，是黨參中的上品。歷代本草典籍及各省炮制規(guī)范中記載黨參的炮制方法有米炒、蜜炙、麩炒、蜜麩炒、清炒、土炒、蜜蒸、清蒸等[4-5]，其中米炒品是臨床最常用的炮制品?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部黨參項(xiàng)下僅收載了黨參和米炒黨參2種飲片規(guī)格，但只對(duì)生品黨參飲片的功效進(jìn)行了闡述，未收載米炒黨參的功效，“十三五”規(guī)劃教材《中藥炮制學(xué)》明確指出黨參米炒后氣變清香，和胃健脾止瀉作用增強(qiáng)。目前，黨參生品化學(xué)成分和藥理作用研究報(bào)道較多，有關(guān)米炒黨參藥效及作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道，更未見紋黨的相關(guān)報(bào)道。

黨參氣味甘、平，生用長(zhǎng)于益氣生津、氣血雙補(bǔ)，米炒后氣變清香，和胃健脾止瀉作用增強(qiáng)[6]，用于脾胃虛弱、食少、便溏等[7]。米炒是加固體輔料炒的常見炮制方法之一，黨參與米共炒可以增強(qiáng)藥物和胃健脾止瀉的作用。因此，本研究以中醫(yī)臨床為指導(dǎo)，選擇最優(yōu)且更能契合中醫(yī)用藥歷史的紋黨為研究對(duì)象，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2-氮雜雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）2種方法，考察紋黨米炒前后體外抗氧化活性的變化規(guī)律，并結(jié)合最常用的用藥方式即湯劑，研究炮制對(duì)其“和胃”和“健脾止瀉”功效相關(guān)藥效指標(biāo)的影響，從宏觀動(dòng)物系統(tǒng)藥效學(xué)驗(yàn)證和評(píng)價(jià)紋黨米炒后和胃健脾止瀉作用是否增強(qiáng)，為進(jìn)一步闡釋米炒黨參“生熟異治”的作用機(jī)制和指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

紋黨藥材購(gòu)自甘肅省隴南市文縣仁和農(nóng)副公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任中藥師鑒定為桔?？浦参锼鼗h參Nannf.var.(Nannf.) L.T.Shen的干燥根。

1.2 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)Wistar大鼠144只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2015-0002，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 藥品與試劑

DPPH（批號(hào)1989-66-4）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；ABTS（批號(hào)A6000020001）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀均為分析純；水為娃哈哈純凈水；利血平注射液（批號(hào)1911091）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；硫酸阿托品注射液（批號(hào)61909042）購(gòu)自遂成藥業(yè)股份有限公司；大鼠胃動(dòng)素（motilin，MTL）ELISA試劑盒（批號(hào)L200811647）、大鼠血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）ELISA試劑盒（批號(hào)L200907040）、大鼠胃泌素（gastrin，GAS）ELISA試劑盒（批號(hào)L200907043）購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；淀粉酶（amylase，AMS）ELISA試劑盒（批號(hào)09／2020）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)A30600115）、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)A31090324）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)222131-001）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液（批號(hào)69111800）購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色劑、分化液、返藍(lán)液（批號(hào)分別為G1005、G1005-3、G1005-4）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器

KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；MH-1000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HHS-11S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；TG16B型臺(tái)式高速離心機(jī)（金壇市科析儀器有限公司）；Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK公司）；RT-3100C型全自動(dòng)洗板機(jī)（雷杜生命科技有限公司）；KD-BM型包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；2016型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；RX50型顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；XB-20型雪花制冰機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 紋黨參飲片的炮制

2.1.1 紋黨參飲片（生飲片）的炮制 將紋黨藥材去除雜質(zhì)，洗凈，蓋過(guò)紋黨藥材的水量浸泡15～20 min，悶潤(rùn)3 h，切制長(zhǎng)度為2～4 mm的厚片，置于烘干室50 ℃干燥[8]，取出備用。

2.1.2 米炒紋黨參飲片（熟飲片）的炮制 取紋黨參飲片，用米拌炒至表面深黃色，取出，篩去米，放涼（100 kg黨參，用大米20 kg），備用[1]。該過(guò)程由“隴原工匠”楊錫倉(cāng)主任中藥師指導(dǎo)完成。

2.2 抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備 分別取紋黨、米炒紋黨粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入250 mL蒸餾水，回流提取2次，每次1.5 h，共2次，濾過(guò)，合并續(xù)濾液，減壓濃縮至0.1 g/mL的溶液，即得。

2.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定[9]DPPH用無(wú)水乙醇配制成濃度為0.1 mmol/L的工作液，將供試品溶液稀釋制成0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 g/mL的溶液，精密吸取樣品溶液和DPPH工作液各100 μL于96孔板中，避光靜置30 min后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定517 nm處的吸光度（）值，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算DPPH自由基清除率，DPPH的清除能力用半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）表示。

DPPH自由基清除率＝[0－(－1)]/0

0為未加樣品的DPPH值；為樣品與DPPH反應(yīng)后的值；1為溶劑與DPPH的值

2.2.3 ABTS自由基清除能力測(cè)定[10]將用純凈水配制的7 mmol/L ABTS溶液5 mL和2.45 mmol/L K2S2O8溶液5 mL混合產(chǎn)生ABTS+自由基，避光室溫靜置12～16 h，得ABTS工作液，備用。使用前取ABTS工作液1 mL，加純凈水稀釋至該溶液在734 nm處值為0.700±0.002，現(xiàn)用現(xiàn)配。于96孔板中分別精密加入不同質(zhì)量濃度（0.10～0.02 g/mL）的樣品溶液40 μL，加入ABTS工作液160 μL，避光靜置6 min后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定734 nm處的值，計(jì)算ABTS自由基清除率，ABTS的清除能力用IC50表示。

ABTS自由基清除率＝[0－(－1)]/0

0為未加樣品的ABTS值；為樣品與ABTS反應(yīng)后的值；1為溶劑與ABTS的值

2.3 和胃健脾止瀉藥效對(duì)比研究

2.3.1 紋黨、米炒紋黨水提液的制備 根據(jù)本課題組前期研究，稱取紋黨、米炒紋黨飲片各312 g，加入10倍量水，回流提取1 h，濾過(guò)，連續(xù)回流2次，合并2次濾液，水浴濃縮至1.62 g生藥/mL，即濃縮至505 mL，于?20 ℃保存，備用。

2.3.2 分組、造模及給藥 將適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后的144只Wistar大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表分成9組，每組16只，分別記為對(duì)照組、模型組、阿托品（0.5 mg/kg）組黃丸紋黨高、中、低劑量（16.2、10.8、5.4 g/kg）組及米炒紋黨高、中、低劑量（16.2、10.8、5.4 g/kg）組。除對(duì)照組外，其余各組大鼠ip利血平（0.5 mg/kg）[11]，1次/d，持續(xù)造模15 d；對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。模型復(fù)制成功后，阿托品組ip硫酸阿托品注射液[11]，紋黨和米炒紋黨高、中、低劑量組ig紋黨和米炒紋黨水提液（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)15 d。給藥期間，除對(duì)照組外，其余各組繼續(xù)造模。

2.3.3 大鼠一般狀態(tài)觀察 分別觀察各組大鼠造模前后及給藥治療后的一般狀態(tài)，包括體質(zhì)量、進(jìn)食量、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、大便及是否存在脫肛現(xiàn)象等。給藥第15天各組大鼠均禁食，自由飲水，記錄末次給藥24 h后大鼠體質(zhì)量。

2.3.4 樣本采集 末次給藥24 h后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，心臟采血并靜置30 min，4 ℃、3500 r/min離心15 min，取上清液，于?80 ℃保存?zhèn)溆?，采血完成后脫頸椎處死大鼠。

2.3.5 臟器指數(shù)的測(cè)定 摘取完整脾臟和胸腺，去掉筋膜及脂肪組織，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱定質(zhì)量，計(jì)算脾臟及胸腺指數(shù)。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

2.3.6 ELISA檢測(cè)各指標(biāo)含量 取各組經(jīng)心臟采集處理得到的血清樣品，按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MTL、GAS、VIP、AMS、TNF-α、IL-6和IL-10水平。

2.3.7 小腸組織切片的制作與觀察 摘取小腸，立即用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，分別從十二指腸（距離幽門口5 cm處）、空腸（距離幽門口20 cm）取2 cm×1 cm全層組織塊，在4%多聚甲醛固定液中固定1周，然后石蠟包埋、切片、烘焙，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

3 結(jié)果

3.1 抗氧化活性

許多中藥化學(xué)成分具有抗氧化活性，不同的化學(xué)成分可能通過(guò)不同的機(jī)制作用于氧化劑，因此一種孤立的方法很難完全評(píng)估復(fù)雜樣品的抗氧化能力[12]，本研究通過(guò)2種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法考察紋黨米炒前后的抗氧化活性變化情況。紋黨米炒前后抗氧化活性見圖1，樣品的抗氧化活性呈劑量相關(guān)性，維生素C、紋黨及米炒紋黨對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除率隨樣品溶液質(zhì)量濃度的增大而增大，計(jì)算紋黨、米炒紋黨的清除DPPH自由基IC50分別為（0.041±0.110）、（0.029±0.140）g/mL；其清除ABTS自由基IC50分別為（0.038±0.050）、（0.029±0.100）g/mL，IC50值越小表示提取液的抗氧化活性越強(qiáng)，2種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)均表明米炒紋黨抗氧化活性優(yōu)于紋黨，證明紋黨米炒可顯著增強(qiáng)其抗氧化活性。

3.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

如圖2和表1所示，對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中行為狀態(tài)正常，皮毛濃密且有光澤，行動(dòng)敏捷，飲食正常，扎堆現(xiàn)象不明顯，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)等。與對(duì)照組相比，模型組大鼠的表現(xiàn)為瞇眼、倦臥嗜睡、體毛稀疏且失澤，反應(yīng)遲鈍并伴倦怠懶動(dòng)，大便溏泄明顯，出現(xiàn)弓背等現(xiàn)象，表明造模成功；體質(zhì)量明顯下降（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠體毛稀疏失澤、瞇眼、少食怠動(dòng)、消瘦倦臥、大便溏泄（或時(shí)干時(shí)?。┑劝Y狀逐漸減輕且活動(dòng)度趨于正常，體質(zhì)量明顯升高（＜0.05）；與相同劑量生品組比較，米炒紋黨高劑量組體質(zhì)量顯著升高（＜0.05）。表明紋黨和米炒紋黨對(duì)利血平致脾虛泄瀉大鼠體質(zhì)量有改善作用，且米炒紋黨效果更佳。

圖1 紋黨米炒前后的抗氧化活性

圖2 對(duì)照組(A, A1) 與模型組(B, B1) 大鼠的一般狀態(tài)

表1 紋黨米炒前后對(duì)脾虛泄瀉大鼠體質(zhì)量的影響(, n = 16)

與對(duì)照組比較：△＜0.05；與模型組比較：*＜0.05；與相同劑量生品組比較：#＜0.05，下表同

△<0.05control group;*<0.05model group;#<0.05same dose of raw product group, same as below tables

3.3 指標(biāo)檢測(cè)

3.3.1 對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響 如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低（＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，各給藥組脾臟指數(shù)明顯升高（＜0.05）；除紋黨低劑量組外，其余各給藥組胸腺指數(shù)明顯升高（＜0.05）；與相同劑量生品組比較，米炒紋黨高、中劑量組脾臟指數(shù)明顯升高（＜0.05），米炒紋黨高、低劑量組胸腺指數(shù)明顯升高（＜0.05）。表明紋黨及米炒紋黨對(duì)脾虛泄瀉大鼠脾臟及胸腺均有保護(hù)作用，且米炒品的保護(hù)作用更佳。

3.3.2 對(duì)大鼠免疫、炎癥因子相關(guān)指標(biāo)的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α及IL-10水平明顯降低（＜0.05），IL-6水平明顯升高（＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α及IL-10水平明顯升高（＜0.05），IL-6水平明顯降低（＜0.05）；與相同劑量生品組比較，米炒紋黨高、中、低劑量組大鼠血清TNF-α及IL-10水平明顯升高（＜0.05），米炒紋黨高、中劑量組大鼠血清IL-6水平明顯降低（＜0.05）。表明紋黨及米炒紋黨對(duì)免疫炎癥相關(guān)指標(biāo)方面具有一定的調(diào)節(jié)作用，且米炒品的調(diào)節(jié)作用更為顯著。

表2 紋黨米炒前后對(duì)脾虛泄瀉大鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 16)

表3 紋黨米炒前后對(duì)脾虛泄瀉大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10水平的影響(, n = 16)

3.3.3 對(duì)大鼠消化吸收相關(guān)指標(biāo)的影響 如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MTL、GAS、VIP及AMS水平明顯降低（＜0.05），表明造模成功；與模型組比較，除紋黨中、低劑量組與米炒紋黨低劑量組對(duì)MTL及紋黨低劑量組對(duì)GAS影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各給藥組大鼠血清MTL、GAS、VIP及AMS水平均明顯升高（＜0.05）。與相同劑量生品組比較，對(duì)于血清MTL，米炒紋黨高劑量組優(yōu)于紋黨對(duì)應(yīng)劑量組（＜0.05）；對(duì)于血清GAS及VIP，米炒紋黨對(duì)應(yīng)劑量組均具有顯著差異（＜0.05）；對(duì)于血清AMS，米炒紋黨中劑量組優(yōu)于紋黨對(duì)應(yīng)劑量組（＜0.05）。表明紋黨及米炒紋黨對(duì)消化吸收相關(guān)指標(biāo)方面具有不同程度的調(diào)節(jié)作用，且米炒品的調(diào)節(jié)作用更為顯著。

3.3.4 對(duì)大鼠小腸組織病理學(xué)的影響 如圖3、4所示，對(duì)照組大鼠十二指腸與空腸上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞頂端有排列整齊緊湊的微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙正常。與對(duì)照組比校，模型組大鼠十二指腸和空腸黏膜上皮細(xì)胞頂端微絨毛稀疏，部分脫落，長(zhǎng)短不一，細(xì)胞間連接復(fù)合體被破壞，橋粒結(jié)構(gòu)基本消失，胞間連接松散并出現(xiàn)降解，十二指腸腸腺萎縮，結(jié)構(gòu)不完整。與模型組比較，阿托品組、紋黨高劑量組和米炒紋黨高、中劑量組黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密，固有層腸腺豐富；紋黨中劑量組和米炒紋黨低劑量組部分黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)不完整，可見大量上皮細(xì)胞脫落，但程度較模型組有所減輕；與相同劑量生品組比較，米炒紋黨高、中劑量組黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)更為完整。

表4 紋黨米炒前后對(duì)脾虛泄瀉大鼠血清中MTL、GAS、VIP及AMS水平的影響(, n = 16)

圖3 各組大鼠空腸組織病理切片圖(HE, ×200)

圖4 各組大鼠十二指腸組織病理切片圖(HE, ×200)

4 討論

黨參具有清除自由基、抗衰老、抗氧化的作用[13]。本研究采用DPPH和ABTS 2種方法評(píng)價(jià)了紋黨米炒前后抗氧化活性，結(jié)果表明米炒可顯著增強(qiáng)紋黨體外抗氧化活性。Cai等[14]發(fā)現(xiàn)，黨參水提物可降低-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，其抗衰老作用可能與微小RNA（miRNA）靶向作用有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖可通過(guò)拮抗-半乳糖降低小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及GSH水平，提高丙二醛水平，進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)[15]，且硫酸化修飾可增強(qiáng)黨參多糖的抗氧化活性[16]。

脾胃為氣血生化之源，臟腑經(jīng)絡(luò)之根，是人體賴以生存的倉(cāng)稟，故稱“脾為后天之本”。同時(shí)，脾居中焦，為人體氣機(jī)升降之樞紐，又是人體抗御病邪的重要防衛(wèi)機(jī)構(gòu)。若脾失健運(yùn)，則會(huì)引起出現(xiàn)水谷精微運(yùn)化障礙，表現(xiàn)為消瘦、氣血衰少、倦怠、眩暈、水腫等脾虛濕困癥狀。紋黨為黨參中的上品，自古以來(lái)便因其“健脾運(yùn)而不燥，滋胃陰而不濕，潤(rùn)肺而不犯寒涼，養(yǎng)血而滋膩，鼓舞清陽(yáng)振動(dòng)中氣而無(wú)燥之弊”而廣泛應(yīng)用于臨床，常用于治療脾肺氣虛、中氣不足、脾胃虛弱、熱病傷津等。清《時(shí)病論》曰“米炒，治脾土虛寒泄瀉”[17]，米炒是加固體輔料炒的常見炮制方法之一，黨參與米共炒可以增強(qiáng)藥物和胃健脾止瀉的作用。

脾虛證是脾胃病最多見的證型之一，脾虛動(dòng)物模型的建立對(duì)于脾胃病的研究意義重大。脾虛動(dòng)物模型建立的方法主要分為病因模型（如苦寒瀉下法、飲食失節(jié)法、勞倦過(guò)度法等單病因模型；苦寒瀉下結(jié)合勞倦過(guò)度法、勞倦過(guò)度結(jié)合飲食不節(jié)法等雙病因模型；五味偏食加控制飲食結(jié)合勞倦過(guò)度法等多病因模型）、病理模型（如利血平法、新斯的明法、秋水仙堿法等）和病癥結(jié)合模型[18]。本研究采用利血平復(fù)制脾虛模型是利用化學(xué)藥的不良反應(yīng)產(chǎn)生類似脾虛的臨床表現(xiàn)，也是脾虛實(shí)驗(yàn)研究的常用模型[19]。利血平屬于腎上腺能神經(jīng)阻斷劑，用藥后交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能受到遏制，副交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能相對(duì)占優(yōu)勢(shì)，從而出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、腹瀉、耐寒力差等與臨床脾虛證相似的癥狀[20]。張帆等[21]采用利血平建立脾虛證小鼠動(dòng)物模型探討參苓白術(shù)散治療脾虛泄瀉的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，利血平致脾虛泄瀉模型小鼠出現(xiàn)皮毛無(wú)光澤、拱背、扎堆、活動(dòng)減少、倦臥、嗜睡、便溏、肛周污穢、食量減少、消瘦等癥狀，且血清-木糖及AMS含量均明顯降低。利血平所致的脾虛大鼠模型在一定程度上反映了類似的病理改變，其表現(xiàn)和中醫(yī)脾虛證有高度的相符性，且此模型干預(yù)因素簡(jiǎn)單，可控性好，易于重復(fù)[18]。本研究采用ip利血平復(fù)制脾虛泄瀉大鼠模型，經(jīng)過(guò)15 d造模后觀察大鼠體征變化，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠懶動(dòng)、拱背、精神倦怠、嗜臥、瞇眼現(xiàn)象嚴(yán)重，毛色或枯黃或稀少，受驚動(dòng)時(shí)無(wú)神、抓取時(shí)掙扎無(wú)力，便溏、泄瀉嚴(yán)重、受激排便率增高，體質(zhì)量明顯下降，模型組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)基本符合中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)制定的“中醫(yī)虛證參考標(biāo)準(zhǔn)”及“脾虛模型標(biāo)準(zhǔn)”[22]。結(jié)合模型組大鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清MTL、GAS、AMS、VIP等指標(biāo)均與對(duì)照組大鼠具有顯著性差異，表明脾虛泄瀉大鼠模型制備成功。

臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)，脾臟及胸腺指數(shù)的改變可直觀反映機(jī)體及細(xì)胞免疫水平的變化。利血平致脾虛泄瀉模型大鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)明顯降低，與對(duì)照組比較有顯著性差異，表明脾虛可使機(jī)體免疫力下降。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)多肽細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥中起著重要作用；IL-6主要由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，在慢性腸道炎癥中，IL-6的過(guò)度表達(dá)會(huì)影響腸上皮細(xì)胞的電解質(zhì)分泌，使其通透性增加，使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到炎癥部位[23]；IL-10主要由CD4＋Th2輔助細(xì)胞亞群產(chǎn)生，是細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[24]；本研究發(fā)現(xiàn)，利血平致脾虛泄瀉模型組大鼠血清中TNF-α、IL-10水平明顯降低，IL-6水平明顯升高，表明脾虛可使機(jī)體免疫功能下降；紋黨米炒后可顯著增加脾虛泄瀉小鼠的脾臟及胸腺指數(shù)，能夠調(diào)節(jié)脾虛泄瀉模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平，顯著改善脾虛泄瀉大鼠的免疫功能，有效地降低IL-6和提高TNF-α、IL-10水平，提示黨參及米炒黨參對(duì)機(jī)體有很好的免疫保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖是增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的主要生物活性成分[25]，黨參中的免疫活性成分可能通過(guò)調(diào)控TNF、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、IL-10、IL-6等靶點(diǎn)，T細(xì)胞受體信號(hào)通路，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體信號(hào)通路等多個(gè)途徑發(fā)揮增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[26]。

MTL是產(chǎn)生于十二指腸和空腸的一種肽類激素，其主要功能是影響胃和腸道的蠕動(dòng)，并能刺激胃蛋白酶和胰液的分泌及膽囊的收縮[27]，若水平異常，則能夠誘發(fā)胃腸道功能紊亂。作為調(diào)節(jié)胃腸功能的另一種激素，GAS在消化道運(yùn)動(dòng)、食物的吸收和代謝、正常免疫功能的發(fā)揮等方面有著重要調(diào)節(jié)作用，通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體，促進(jìn)胃腸道中胃蛋白酶、胃酸、胰酶的合成，還能促進(jìn)胃腸道粘膜組織生長(zhǎng)，促進(jìn)上皮組織中多種細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)胃、腸及胰腺中DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，具有營(yíng)養(yǎng)胃腸道的作用[28]。AMS是一種重要的消化酶，主要由唾液腺和胰腺分泌，淀粉酶分泌不足，機(jī)體的消化功能必然受到影響。VIP是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸運(yùn)動(dòng)收縮連接的重要腦腸肽，由腸道神經(jīng)元釋放，在消化系統(tǒng)的主要作用是舒張腸道平滑肌，并使食管下段括約肌、腸道平滑肌和肛門內(nèi)括約肌松弛，同時(shí)又可促進(jìn)腸道水分和電解質(zhì)的分泌[29]。VIP分泌異常可致胃腸動(dòng)力和分泌功能紊亂，引起腸道平滑肌規(guī)律性運(yùn)動(dòng)障礙，腸道分泌物增多，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清MTL、GAS、AMS及VIP水平均顯著低于對(duì)照組，各給藥組大鼠血清MTL、GAS、AMS及VIP水平均有不同程度升高，且米炒紋黨在改善消化吸收功能方面優(yōu)于紋黨。

綜上，紋黨及米炒紋黨可升高脾虛泄瀉小鼠AMS、MTL、GAS、VIP、TNF-α、IL-10、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)水平，降低IL-6水平，從而減輕脾虛泄瀉癥狀，且米炒紋黨和胃健脾止瀉作用更為顯著，表明米炒紋黨增強(qiáng)和胃健脾止瀉的科學(xué)性、合理性。引起紋黨及米炒紋黨在免疫調(diào)節(jié)和消化系統(tǒng)方面的作用差異可能的機(jī)制為輔料大米氣味甘、性平，具補(bǔ)中益氣、健脾和胃、止瀉痢等功效，與紋黨共炒后，氣變清香，醒脾開胃作用增強(qiáng)；紋黨米炒后，產(chǎn)生了與健脾止瀉作用相關(guān)的化學(xué)成分，具體變化后續(xù)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC- MS/MS）進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on effects ofbefore and after stir-baking with rice on anti-oxidationand regulation of immune function and digestive absorption in diarrhea rats with spleen deficiency

TIE Xiao-yan1, ZHANG Yun-he1, ZHANG Wen-guang1, WANG Dan1, XIN Guo-xiong1, LI Yun1, HU Fang-di2

1.Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2.Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

To comparative the effects of Wendang () before and after stir-baking with rice on the antioxidationand regulation of immune function and digestive absorption in diarrhea rats with spleen deficiency.DPPH and ABTS methods were used to investigate the changes of antioxidant activity ofbefore and after stir-baking with rice.The model of diarrhea of rats with spleen deficiency was established.The sulfate injection and water extract ofbefore and after stir-baking with rice were given for intervention, body weight of rats in each group was recorded, spleen index and thymus index of rats in each group were calculated.Levels of MTL, GAS, VIP, AMS, TNF-α, IL-6, and IL-10 in serum of each group of rats were determined by ELISA.HE staining method was used to observed the pathological changes of duodenum and jejunum of each group of rats.The effects ofbefore and after stir-baking with rice on diarrhea of spleen deficiency rats in terms of immune regulation, digestion and absorption were compared.Results of antioxidationshowed that IC50of scavenging DPPH free radical ofbefore and after stir-baking with rice were (0.041 ± 0.110) and (0.029 ± 0.140) g/mL, IC50of scavenging ABTS free radical were (0.038 ± 0.050) and (0.029 ± 0.100) g/mL.Compared with control group, body weight, thymus index, spleen index, TNF-α, IL-10, MTL, GAS, VIP and AMS levels in model group were significantly decreased (< 0.05), while the level of IL-6 was significantly increased (< 0.05).The pathological changes of duodenum and jejunum were severe in model group.The treatment of each experimental group had different effects on spleen index, TNF-α, IL-10 and IL-6 as compared to model group.There was no statistical difference in thymus index between low-dosegroup, the level of MTL was not statistically different between medium- and low-dosegroups and low-doseafter stir-baking with rice group, and level of GAS in low-dosegroup had no statistically difference.All the other groups could significantly increase the thymus index, MTL, GAS, VIP and AMS levels in rats (< 0.05).The pathological changes of duodenum and jejunum were ameliorated in different degrees in each treatment group.Compared with same dose group, spleen index of high- and medium-doseafter stir-baking with rice group and thymus index of high- and low-doseafter stir-baking with rice group were significantly increased (< 0.05).The levels of TNF-α, IL-10, GAS and VIP in high-, medium- and low-doseafter stir-baking with rice groups, MTL level in high-doseafter stir-baking with rice group, and AMS levels in medium- doseafter stir-baking with rice group were significantly increased (< 0.05), the level of IL-6 in high- and medium-doseafter stir-baking groups with rice was significantly decreased (< 0.05).Antioxidant activity ofwas enhanced after stir-baking with rice.Raw and cooked slices ofhave obvious therapeutic effects on diarrhea in rats with spleen deficiency in therms of immune regulation, digestion and absorption.after stir-baking with rice is obviously stronger than raw products, which may be closely related to the regulation of levels of TNF- α, IL-6 and IL-10, which demonstrates thatafter stir-baking with rice can harmonize stomach, invigorate and relieve diarrhea scientifically and reasonably.

;after stir-baking with rice; anti-oxidant; harmonizing stomach, invigorating and relieving diarrhea; digestive absorption; immune function

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6871 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.012

2021-06-21

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706303）；全國(guó)中藥特色技術(shù)傳承人才培訓(xùn)項(xiàng)目（T20184828005）

帖曉燕（1995—），女，碩士研究生，從事中藥炮制與制藥工藝研究。Tel: 18153675913 E-mail: 1194570175@qq.com

通信作者：李 蕓（1973—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥化學(xué)成分分離分析、中藥加工炮制工藝研究與中藥大健康產(chǎn)品開發(fā)。Tel: 13893362959 E-mail: liyunherb@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]