超濾親和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選顯齒蛇葡萄葉中酪氨酸酶抑制劑

周慧吉，張 璐，李廷釗, 2，李 波, 2*

超濾親和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選顯齒蛇葡萄葉中酪氨酸酶抑制劑

周慧吉1，張 璐1，李廷釗1, 2，李 波1, 2*

1. 安利（中國）研發(fā)中心，上海 201203 2. 安利（中國）植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214145

采用超濾親和-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry，UF-LC-MS）結(jié)合體外酶活性實驗，篩選藥茶兩用植物顯齒蛇葡萄葉（藤茶）中的酪氨酸酶抑制劑。通過體外酶活實驗發(fā)現(xiàn)藤茶具有很好的酪氨酸酶抑制活性，采用UF-LC-MS篩選并鑒定藤茶中1個主要組分對酪氨酸酶的活性具有抑制作用，并鑒定為二氫楊梅素。進(jìn)一步通過體外熒光光譜、圓二色譜和分子對接技術(shù)研究了二氫楊梅素對酪氨酸酶的分子作用機制。發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素對酪氨酸酶具有較高的抑制作用，對單酚酶及雙酚酶的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為37.73、18.87 μg/mL。分子模擬結(jié)果顯示，二氫楊梅素可以進(jìn)入酪氨酸酶的活性中心，與氨基酸殘基形成4個氫鍵，改變酶活性中心的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酪氨酸酶催化活性下降。此外，二氫楊梅素能明顯抑制B16黑色瘤細(xì)胞的增殖，并且顯著降低黑色素合成。為利用UF-LC-MS和分子對接技術(shù)篩選藥用植物中酪氨酸酶抑制劑提供了參考，也為后續(xù)研究和開發(fā)藤茶及二氫楊梅素用于治療皮膚色素沉著性疾病提供理論基礎(chǔ)。

超濾親和-液質(zhì)聯(lián)用；顯齒蛇葡萄；二氫楊梅素；酪氨酸酶；分子對接；B16黑色瘤細(xì)胞

藤茶亦稱銀茶、霉茶，是葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(Handel- Mazzetti) W. T. Wang的干燥莖葉，為多年生藤本植物[1]，是湘西土家族民間習(xí)用藥材，用于治療咽喉炎、口腔炎癥及各種癰腫、便秘等病癥[2]。藤茶主要分布在長江流域及其以南省份，食用歷史悠久，有報道早在東晉時期湖南衡東居民就開始飲用藤茶[3]。2013年國家衛(wèi)生計生委批準(zhǔn)顯齒蛇葡萄葉為新資源食品。作為藥茶兩用植物資源，藤茶開發(fā)潛力巨大。藤茶中富含黃酮類化合物[4]，主要化學(xué)成分有二氫楊梅素、楊梅素、香橙素、楊梅苷等，其中二氫楊梅素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)28%[5]。除此之外，藤茶中還含有較多的酚類化合物，如沒食子酸、沒食子酸酯、兒茶素、表兒茶素等[6]。

酪氨酸酶又被稱為多酚氧化酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的催化黑色素合成的關(guān)鍵酶[7]，與生命體的諸多重要生理過程密切相關(guān)，過量表達(dá)會導(dǎo)致色素沉著性疾病的產(chǎn)生，例如黃褐斑、雀斑和老年痣等色素沉著性疾病。酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥、化妝品和食品化學(xué)方向有著廣泛的應(yīng)用。而隨著天然產(chǎn)物研究的興起，從植物中篩選高效低毒的酪氨酸酶抑制劑已是當(dāng)前的研究熱點。

傳統(tǒng)活性成分追蹤方法要經(jīng)過提取、分離、純化、化合物鑒定，再針對單體化合物進(jìn)行活性測定，該方法費時費力，還容易造成微量成分流失或者活性追蹤消失[8]。因此，操作簡便、檢測靈敏、結(jié)果特異的快速活性成分篩選方法開發(fā)一直是研究熱點。超濾親和-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（ultra-filtration affinity- liquid chromatography spectrometry，UF-LC-MS）是將超濾技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的一種高效藥物篩選方法[9-10]，它以酶為靶點成功應(yīng)用于復(fù)雜體系中活性成分的發(fā)現(xiàn)和鑒定。如Yang等[11]采用光電二極管陣列檢測和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜從人參莖葉中篩選出乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑。Zhang等[12]運用UF-LC-MS方法發(fā)現(xiàn)并分析參芪降糖顆粒中α-葡萄糖苷酶抑制成分。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)藤茶具有較好的酪氨酸酶抑制活性，利用UF-LC-MS技術(shù)，獲得藤茶主要活性成分信息，結(jié)合文獻(xiàn)和已有對照品對化合物進(jìn)行推斷及驗證，從而鑒定藤茶中抑制酪氨酸酶的主要成分。并進(jìn)一步采用多種光譜學(xué)技術(shù)結(jié)合分子模擬技術(shù)初步探究化合物對酪氨酸酶的作用機制，為后續(xù)研究和開發(fā)藤茶及二氫楊梅素用于治療皮膚色素沉著性疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料

藤茶藥材購自湖南省張家界，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院高級實驗師劉書芬博士鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(Handel- Mazzetti) W. T. Wang的葉，存樣于安利（中國）研發(fā)中心中藥材標(biāo)本庫。

酪氨酸酶（批號9002-10-2）、二甲基亞砜DMSO（批號#D4540）購自美國Sigma公司；超濾離心管購自美國Microcon公司；色譜級甲醇購自美國Honeywell公司；二氫楊梅素（批號RS03841020）購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；B16細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號11965084）、胎牛血清FBS（批號10099141C）、青霉素-鏈霉素（10 000 U/mL）PS（批號10378016）、胰酶（批號R001100）均購自美國Gibco公司；MTT試劑盒（批號G020-1-2）購自南京建成生物工程研究所；PBS（批號C8020）購自Adamas公司；RIPA裂解液（批號P0013B）購自上海碧云天；其他試劑均購自上海泰坦科技股份有限公司；熊果苷（批號60077B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、曲酸（批號60307B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、白藜蘆醇（批號00308B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、水溶性VE（Trolox，批號P1307382，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%），購自Adamas公司。咖啡酸（批號ST04140120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自上海詩丹德技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀，配PDA檢測器，串聯(lián)QDa質(zhì)譜儀，美國Waters公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，上海技舟化工科技有限公司；XS205十萬分之一電子天平及MS3002S型電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；WF-600EHT 型超聲波清洗機，寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；RWB3220CY-2高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；恒溫水浴鍋，美國Thermo公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular公司。

2 方法

2.1 樣品處理

藤茶粉碎，過篩，精密稱定20.0 g，用12倍體積熱水回流提取2次，每次1 h。提取液過濾后真空濃縮到小體積，凍干后?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 酪氨酸酶抑制實驗

2.2.1 酪氨酸酶的單酚氧化酶活力測定 酪氨酸酶單酚氧化酶測定參考文獻(xiàn)報道[13]并對方法進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整。以酪氨酸為底物，熊果苷為陽性對照，測定藤茶提取物對酪氨酸酶單酚氧化酶的抑制活性。實驗分為空白組、空白對照組、樣品組和樣品對照組（＝3）。樣品組：50 μL的-酪氨酸（0.5 mmol/L）及100 μL樣品液，混勻后37 ℃孵育5 min。隨后加入100 μL酪氨酸酶溶液（250 U/mL），混勻后37 ℃孵育15 min。樣品對照組：100 μL PBS替代100 μL酪氨酸酶?？瞻捉M：100 μL PBS替代100 μL樣品溶液。空白對照組：100 μL PBS替代100 μL樣品溶液，并用100 μL PBS替代100 μL酪氨酸酶。預(yù)孵結(jié)束后于475 nm處測定吸光度（）值。熊果苷作為陽性對照。按照公式計算抑制率。

抑制率＝1－(1－2)/(3－4)

1為樣品組；2為樣品對照組；3為空白組；4為空白對照組

2.2.2 酪氨酸酶的雙酚氧化酶測定 酪氨酸酶雙酚氧化酶測定參考文獻(xiàn)報道[14]并對方法進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整。以多巴為底物，熊果苷為陽性對照，測定藤茶提取物對酪氨酸酶單酚氧化酶的抑制活性。分為空白組、空白對照組、樣品組和樣品對照組（＝3）。樣品組：50 μL的多巴溶液（0.5 mmol/L）及100 μL樣品液，混勻后37 ℃孵育5 min。隨后加入100 μL酪氨酸酶溶液（100 U/mL），混勻后37 ℃孵育5 min。樣品對照組：100 μL PBS替代100 μL酪氨酸酶。空白組：100 μL PBS替代100 μL樣品溶液。空白對照組：100 μL PBS替代100 μL樣品溶液，并用100 μL P BS替代100 μL酪氨酸酶。孵育結(jié)束后于475 nm處測定值。熊果苷作為陽性對照。抑制率計算公式同“2.2.1”項。

2.3 UF-LC-MS技術(shù)篩選酶抑制劑

UF-LC-MS在線鑒別藤茶中的酪氨酸酶抑制劑的流程見圖1。

2.3.1 競爭性配體篩選

（1）配體混合溶液配制：分別稱取一定量熊果苷、曲酸、咖啡酸、白藜蘆醇和Trolox，溶于含5%DMSO的PBS（pH 6.6）溶液中，5種抑制劑的最終質(zhì)量濃度分別為5 mg/mL和750、375、200、700 μg/mL。

圖1 UF-LC-MS流程圖

（2）配體與酪氨酸酶結(jié)合情況分析：移取50 μL混合溶液，加入250 μL的酪氨酸酶（500 U/mL）溶液，37 ℃下孵育30 min。再將混合溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管（Millipore，UFC501096）中以12 000 r/min的速度離心15 min?；旌弦河?00 μL PBS清洗2次，收集3次離心液，濾過，取續(xù)濾液高效液相色譜分析。

（3）配體與酪氨酸酶是特異性結(jié)合分析：分別將5種已知抑制劑與250 μL酪氨酸酶在37 ℃下預(yù)孵育30 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管后離心，并PBS清洗3次后。舍棄離心液后，在離心管種加入50μL混合溶液和250 μL PBS，37 ℃下繼續(xù)孵育30 min。12 000 r/min的速度離心15 min，用300 μL PBS清洗2次，收集3次離心液，濾過，取續(xù)濾液高效液相色譜分析。

液相條件：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.02%磷酸（B）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長280 nm；梯度洗脫，0～3 min，5% A；3～10 min，5%～70% A；10～15 min，70%～95% A；15～25 min，95% A；25.1～35 min，5% A。

2.3.2 超濾離心法分析藤茶提取物中抑制酪氨酸酶的活性成分及結(jié)構(gòu)鑒定 分為空白對照組、樣品組和阻斷性競爭樣品對照組進(jìn)行實驗?？瞻捉M：300 μL PBS；樣品組：50 μL PBS＋250 μL酪氨酸酶溶液（500 U/mL）；對照組：50 μL競爭性配體＋250 μL酪氨酸酶溶液（500 U/mL），3組樣品置于37 ℃恒溫水浴鍋中同時預(yù)孵化30 min。將溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中12 000 r/min的速度離心15 min，向濾膜中加入PBS清洗3次，徹底洗去未結(jié)合的配體。舍棄離心液后，依次往離心管中加入藤茶水溶液（10 mg/mL，50 μL）和250 μL PBS溶液，37 ℃下繼續(xù)孵育30 min，于12 000 r/min的高速離心15 min，向濾膜中加入300 μL PBS，離心清洗2次。收集濾液，混勻后UPLC-MS分析。

超高效液相條件：色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），編號SR047，流動相為0.1%甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，12% B；3～11 min，12%～15% B；11～16 min，15%～30% B；16～17min，30%～95% B；17～30 min，95% B；30～31 min，95%～12% B。體積流量為0.3 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為292、365 nm，進(jìn)樣量5 μL。

Qda分析采用電噴霧負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓0.8 kV，氮氣體積流量28.0 L/min, 干燥氣溫度500 ℃，錐孔電壓15V，全掃描質(zhì)荷比（/）范圍為50～1700。

2.4 活性成分對酪氨酸酶活性及構(gòu)象的影響

2.4.1 活性成分對酪氨酸酶活性的抑制能力測定 按“2.2.1”項方法測定化合物對單酚氧化酶和雙酚氧化酶的抑制率，熊果苷為陽性對照組。

2.4.2 活性成分對酪氨酸酶的抑制可逆性測定 設(shè)置4組實驗，固定底物左旋多巴胺（-DOPA）的濃度（0.5 mmol/L），加入不同濃度的化合物溶液，測定酪氨酸酶濃度變化時值的變化（Δ），作出Δ與酶濃度的關(guān)系曲線，并由該關(guān)系曲線判斷化合物對酪氨酸酶的抑制作用是否可逆[15]；每隔15 s檢測反應(yīng)體系在475 nm處的值，通過測定475隨時間的變化曲線，計算曲線的斜率即得Δ。

2.4.3 活性成分對酪氨酸酶的熒光光譜的測定[16]以ex＝280 nm為激發(fā)波長，發(fā)射波長em范圍290～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。移取100 μL的100 U/mL的酪氨酸酶溶液，加入不同體積（0、10、20、30、40、50 μL）的化合物，并用緩沖溶液補充至300 μL，于酶標(biāo)儀上進(jìn)行熒光光譜的掃描和測定。

2.4.4 圓二色譜的測定[17]掃描范圍為190～260 nm，帶寬1 nm，掃描速度60 nm/min。移取980 μL的500 U/mL的酪氨酸酶溶液，分別加入0、10、20 μL的100 μg/mL二氫楊梅素溶液，并用緩沖溶液補充至1 mL，充分混勻后，于室溫下測定二氫楊梅素-酪氨酸酶混合體系的圓二色譜。以磷酸鹽緩沖液作為空白，實驗結(jié)果均扣除緩沖液背景峰。

2.4.5 分子對接研究 從RSCB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（rcsb.org/）中下載酪氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:2Y9X）。去掉原有的小分子配體及水分子后保存為2y9x-protein.pdb。從PubChem網(wǎng)站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載二氫楊梅素的SDF文件，并用OpenBabel軟件轉(zhuǎn)化為mol2格式，保存為ligand.Mol2。酪氨酸酶和二氫楊梅素均加力場，選擇酪氨酸酶自帶小分子配體的位置作為對接位點，保留活性位點的2個銅離子。最后，運用殷斌云計算平臺（http://cloud.yinfotek.com）進(jìn)行分子對接模擬計算。選擇結(jié)合能最低的構(gòu)象分析酪氨酸酶與配體的相互作用。

2.5 活性成分對B16黑色素瘤細(xì)胞的影響

2.5.1 小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），置CO2孵箱，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下。每2～3天用0.25%胰酶消化，以1∶3～1∶5傳代。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈對數(shù)生長期時，用于實驗。

2.5.2 MTT法測定化合物對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞活性的影響[18]當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，消化制成細(xì)胞懸液。每孔100 μL，密度為5×104個/mL，接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。實驗分為空白組：只含培養(yǎng)液；對照組：加培養(yǎng)液正常培養(yǎng)細(xì)胞；實驗組：加不同濃度樣品的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。測試的樣品均設(shè)置5個濃度，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩20 min，酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔的值。按照公式計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.5.3 氫氧化鈉裂解法測定化合物對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞中黑色素合成的影響[19]細(xì)胞培養(yǎng)同上，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，消化制成細(xì)胞懸液，以每孔體積2 mL，密度1×105個/mL，接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。實驗分為空白組：加入不含樣品的培養(yǎng)液；給藥組：加入含不同濃度樣品的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加0.5 mL胰酶細(xì)胞消化液進(jìn)行消化，然后收集細(xì)胞至離心管中，1500 r/min，離心5 min，離心后棄去上清液，得到細(xì)胞團。PBS洗滌，6400 r/min，離心5 min后，棄去上清液，每管中加入100 μL裂解液，放置于冰上，充分裂解30 min，每10 min混勻1次。之后4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，棄去上清后，在細(xì)胞沉淀中加入100 μL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，置于水浴鍋80 ℃水浴1 h，使黑素顆粒能夠充分溶解，酶標(biāo)儀于400 nm處測定。按公式計算細(xì)胞中黑色素抑制率。

黑色素抑制率＝(給藥－空白)/空白

2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

3 結(jié)果

3.1 藤茶提取物對酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶單酚酶、二酚酶的抑制活性測定結(jié)果見表1。藤茶提取物質(zhì)量濃度為50.00 μg/mL、0.16 mg/mL時，其對酪氨酸酶單酚酶、雙酚酶的抑制率分別為62.91%、68.87%，相同濃度下熊果苷的抑制率分別為39.53%、9.02%，顯示藤茶提取物具有較好的酪氨酸酶抑制活性且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。推測藤茶提取物中可能存在一些有效成分通過占據(jù)酪氨酸酶活性位點形成受體-配體復(fù)合物，從而抑制了酪氨酸酶的活性。

表1 藤茶提取物、二氫楊梅素和熊果苷對酪氨酸酶抑制活性()

3.2 酪氨酸酶競爭性配體篩選

小分子化合物可以和酶發(fā)生特異性結(jié)合，占據(jù)酶的活性位點，從而阻斷其他化合物與酶的結(jié)合。然而在活性篩選的試驗中也會出現(xiàn)化合物和酶發(fā)生非特異性結(jié)合，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。為了避免大量的假陽性，采用競爭性實驗，通過已知配體阻斷酶的特定位點來識別特異性結(jié)合[20]。因此，如何選擇特異性結(jié)合的陽性藥物至關(guān)重要。

選擇5種已知的酪氨酸酶抑制劑（熊果苷、曲酸、白藜蘆醇、咖啡酸、Trolox），進(jìn)行配體篩選實驗。圖2-a是5種配體混合液的液相色譜圖（空白組）；圖2-b是配體混合液和酪氨酸酶預(yù)孵育后的液相色譜圖（酶結(jié)合組），從峰面積的下降程度可以推測Trolox與酪氨酸酶沒有顯著結(jié)合，而熊果苷、曲酸、咖啡酸、白藜蘆醇均能與酪氨酸酶發(fā)生顯著結(jié)合，可作為潛在的競爭性配體繼續(xù)篩選。分別用熊果苷、曲酸、咖啡酸、白藜蘆醇與酪氨酸酶進(jìn)行預(yù)孵化實驗，結(jié)果顯示白藜蘆醇預(yù)孵化后可以顯著提高其它抑制劑的峰面積（圖2-c，白藜蘆醇預(yù)孵化組），推測白藜蘆醇與酪氨酸酶緊密結(jié)合并占據(jù)酶的活性位點，從而阻止了其他抑制劑與酶結(jié)合。因此，最終選擇白藜蘆醇作為競爭性配體進(jìn)行陽性對照實驗。

a-空白組 b-酶結(jié)合組 c-白藜蘆醇預(yù)孵化組

3.3 超濾離心法分析藤茶提取物中抑制酪氨酸酶的活性成分

在超濾篩選實驗過程中發(fā)現(xiàn)，樣品組（圖3-B）的藤茶提取物中活性成分與酪氨酸酶發(fā)生結(jié)合后的色譜峰面積要低于空白組（圖3-A）。為避免非特異性結(jié)合而造成的假陽性結(jié)果，設(shè)計競爭性抑制試驗陽性對照組（圖3-C）。酪氨酸酶與陽性藥物白藜蘆醇預(yù)孵化后，白藜蘆醇會提前占據(jù)酪氨酸酶的活性位點。此時藤茶提取物中活性成分則無法與酪氨酸酶進(jìn)一步結(jié)合，活性成分的色譜峰面積較樣品組則會升高。親和超濾實驗發(fā)現(xiàn)，藤茶提取物中化合物1和2的峰面積較空白組（圖3-A）有較明顯的降低（圖3-B）。而在添加了競爭性配體陽性實驗中，化合物1和2的峰面積得以恢復(fù)（圖3-C），因此推測化合物1和2對應(yīng)的物質(zhì)與酪氨酸酶發(fā)生了特異性結(jié)合，可能是潛在的酶抑制劑。圖3-B中化合物4的峰面積明顯升高，可能是藤茶與酪氨酸酶的催化產(chǎn)物。

A-藤茶溶液 B-藤茶溶液與酶共孵化后 C-藤茶溶液與白藜蘆醇預(yù)孵化后 D-二氫楊梅素斷裂模式

采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法（UPLC-Q-TOF/MS）對藤茶樣品進(jìn)行分析，根據(jù)多級質(zhì)譜信息，結(jié)合天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]，從藤茶水提取物中鑒定出15個化合物峰，鑒定結(jié)果見表2?；衔?（R＝3.74 min）在一級全掃描質(zhì)譜中/319.046 0 [M－H]?、193.014 3和125.024 7碎片離子分別是母離子按照圖3-D斷裂模式產(chǎn)生的。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)信息[23]，推測化合物1為二氫楊梅素。化合物2（R＝4.71 min）在一級全掃描質(zhì)譜中/319.046 5 [M－H]?，是二氫楊梅素的同分異構(gòu)體。結(jié)合文獻(xiàn)信息[21]，推測化合物2為二氫楊梅素差向異構(gòu)體(2,3)-5,7,3′,4′,5′-五羥基二氫黃酮醇；化合物5、7、14、15分別為黃酮類化合物花旗松素、楊梅苷、槲皮苷及楊梅素；化合物3、6、8～13分別為化合物1或（和）2的二聚體，8個化合物均為同分異構(gòu)體。

3.4 活性成分二氫楊梅素對酪氨酸酶的抑制活性驗證

體外活性試驗進(jìn)一步驗證二氫楊梅素對單酚酶、二酚酶均有明顯的抑制作用，結(jié)果見表1。通過計算，二氫楊梅素抑制單酚酶及雙酚酶的IC50值分別為37.73、18.87 μg/mL，陽性對照組熊果苷抑制單酚酶及雙酚酶的IC50值分別為117.6、1181 μg/mL，表明二氫楊梅素是對單酚酶和雙酚酶的抑制效果更強，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.5 活性成分二氫楊梅素對酪氨酸酶的抑制可逆性測定

圖4表示在不同濃度的二氫楊梅素體系中，酶促反應(yīng)速率（Δ）與酪氨酸酶濃度關(guān)系的5條直線均相交。且隨著二氫楊梅素濃度的增加，直線的斜率不斷減少，由此可以說明二氫楊梅素對酪氨酸酶的抑制作用是可逆的。二氫楊梅素與酪氨酸酶結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸酶活力被抑制，使其催化速率降低。

表2 藤茶樣品成分分析結(jié)果

a～e-質(zhì)量濃度20、40、60、80、100 μg·mL?1的二氫楊梅素

3.6 二氫楊梅素對酪氨酸酶熒光光譜的影響分析

熒光分光光度法是一種用于研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。在280 nm的激發(fā)波長下，含有Phe、Tyr和Trp的蛋白質(zhì)會發(fā)射熒光，被稱為蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與小分子發(fā)生相互作用，或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，由于其熒光對環(huán)境非常敏感，會發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[25]。

圖5為二氫楊梅素與酪氨酸酶相互作用的同步熒光譜圖。如圖5所示，酪氨酸酶在波長320 nm處有較強的熒光峰，二氫楊梅素及反應(yīng)體系中的溶劑熒光強度均很弱，不影響酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜。但隨著體系中二氫楊梅素濃度的增大，能夠有規(guī)律猝滅酪氨酸酶的內(nèi)源熒光，熒光峰更為平緩，說明二氫楊梅素與酪氨酸酶發(fā)生了相互作用。而發(fā)射峰的位置沒有發(fā)生變化，說明酪氨酸酶的色氨酸殘基本身沒有變化。

A-二氫楊梅素 B～G-酪氨酸酶（100 U·mL?1）+二氫楊梅素0, 10, 20, 30, 40, 50 μL

3.7 二氫楊梅素對酪氨酸酶圓二色譜的影響

圓二色譜法是一種用于分析溶液中大分子二級結(jié)構(gòu)的方法[26]，它突破了X射線生理狀態(tài)下的情況。蛋白質(zhì)的旋光性源于其組分的不對稱性，如α-螺旋、β-折疊等二級結(jié)構(gòu)均為不對稱的立體結(jié)構(gòu)[27]。如圖6所示，酪氨酸酶在波長208、222 nm左右有明顯的負(fù)峰，這是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-helix的特征峰[28]。隨著二氫楊梅素的加入，圓二色譜光譜強度逐漸減小，譜圖向零水平移動，但峰位幾乎沒有改變，表明二氫楊梅素對酪氨酸酶的構(gòu)象產(chǎn)生了一定的影響[29-30]。

圖6 二氫楊梅素對酪氨酸酶圓二色譜的影響

3.8 二氫楊梅素與酪氨酸酶的分子對接研究

對接結(jié)果表明，二氫楊梅素能進(jìn)入酪氨酸酶的疏水腔（如圖7），靠近酪氨酸酶的銅離子活性位點。His244、Met280、Glu256、Asn260與二氫楊梅素的3C-OH、7C-OH、4C＝O、3′C-OH形成4個氫鍵，鍵長分別為0.22、0.179、0.316、0.274 nm，表明氫鍵是二氫楊梅素與酪氨酸酶結(jié)合的一種重要作用力。此外，從圖中還可以看出，二氫楊梅素的6C-OH還與Val248和Asn260均有疏水作用，His263和Phe264分別與二氫楊梅素的A環(huán)、B環(huán)存在π-π堆積作用。從對接結(jié)果可推測，二氫楊梅素抑制酪氨酸酶活性機制可能表現(xiàn)在以下2方面：（1）二氫楊梅素進(jìn)入酪氨酸酶疏水腔，可能形成空間位阻效應(yīng)，阻礙其他底物靠近活性口袋；（2）二氫楊梅素在活性中心部位與氨基酸殘基發(fā)生非共價結(jié)合，改變酶活性中心的構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性受到影響。

3.9 二氫楊梅素對B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞活性及黑色素形成的影響

由圖8可知，陽性藥物熊果苷及二氫楊梅素2種化合物能明顯抑制B16黑色瘤細(xì)胞的增殖。陽性藥物熊果苷及二氫楊梅素濃度與黑色素的生成有明顯的量效關(guān)系。隨著待測物濃度的增加，對黑色素生成的抑制作用越大，呈正相關(guān)。

圖7 二氫楊梅素與酪氨酸酶的分子對接

與空白組（CK）比較，*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1

4 討論

本研究在體外提取物活性評價的基礎(chǔ)上，采用UF-UPLC-MS技術(shù)篩選藤茶中酪氨酸酶抑制劑的活性成分。該方法操作簡單，無需對化學(xué)成分進(jìn)行常規(guī)的分離鑒定，為從植物中快速篩選酪氨酸酶抑制劑提供了一種簡潔有效的方法利用UF-UPLC- MS技術(shù)從藤茶提取物中篩選到二氫楊梅素為潛在的抑制酪氨酸酶活性成分，體外酶活性試驗也顯示隨著化合物濃度的升高，其抑制作用逐漸增強，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良效抑制關(guān)系。通過熒光分光光度法、圓二色譜分光光度法和分子對接技術(shù)，推測二氫楊梅素可進(jìn)入酪氨酸酶活性中心，引起酪氨酸酶二級結(jié)構(gòu)的改變，從而降低酶的活性。進(jìn)一步的細(xì)胞試驗也驗證二氫楊梅素能抑制黑色瘤細(xì)胞生長，抑制黑色素合成。該研究結(jié)論可為開發(fā)新的酪氨酸酶抑制劑提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and identification of natural inhibitors of tyrosinase fromusing ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry

ZHOU Hui-ji1, ZHANG Lu1, LI Ting-zhao1, 2, LI Bo1, 2

1. Amway (China) R&D Center, Shanghai 201203, China 2. Amway (China) Botanical R&D Center, Wuxi 214145, China

To screen tyrosinase inhibitors from the leaf extract of(vine tea) by ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry (UF-LC-MS) technique combined with enzyme activity.The inhibitory activity of vine tea extract was evaluated by enzyme activity test. Meanwhile one major component from vine tea was screened by UF-LC-MS and identified as potential tyrosinase inhibitor, which was identified as dihydromyricetin. The molecular mechanism of dihydromyricetin on tyrosinase was further studied byfluorescence spectroscopy, circular dichroism and molecular docking techniques.The tyrosinase inhibitor was identified as dihydromyricetin, and IC50of monophenolase and diophenolase were 37.73 μg/mL and 18.87 μg/mL, respectively. The docking results demonstrated that dihydromyricetin entered the active center of tyrosinase, forming four hydrogen bonds with the amino acid residues, and changed the conformation of the active center, which lead to inactivation of tyrosinase. In addition, dihydromyricetin could significantly inhibit the proliferation of B16 melanoma cells, then dramatically reduce the synthesis of melanin.Our research provided theoretical reference for screening natural and high affinity tyrosinase inhibitors from herbal medicines by using UF-LC-MS and molecular docking, which could provide a basis for the subsequent research and development of vine tea and dihydromyricetin for the treatment of skin pigmentation diseases.

UF-LC-MS;(Handel- Mazzetti) W. T. Wang; dihydromyricetin; tyrosinase; molecular docking; B16 melanoma cell

R284.1

A

0253 - 2670(2021)22 - 6796 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.004

2021-03-24

國家重點研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究重點專項（2018YFC1706800）

周慧吉（1990—），碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)。Tel: (021)23056907 E-mail: cassie.zhou@amway.com

通信作者：李 波，博士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)。Tel: (021)23056985 E-mail: robert.li@amway.com

[責(zé)任編輯 王文倩]