固定化酶技術(shù)在中藥酶抑制劑篩選中的研究現(xiàn)狀

安 瓊，李國(guó)峰，郎一帆，楊武亮，陳春蘭，張武崗，陳海芳*

固定化酶技術(shù)在中藥酶抑制劑篩選中的研究現(xiàn)狀

安 瓊1，李國(guó)峰1，郎一帆1，楊武亮1，陳春蘭1，張武崗2*，陳海芳1*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330004

固定化酶技術(shù)是利用物理或化學(xué)方法將游離酶固定在相應(yīng)的載體上用于篩選酶抑制劑的方法，該方法選擇性高、穩(wěn)定性好?；诩膊∠嚓P(guān)靶點(diǎn)—生物酶，采用固定化酶技術(shù)從中藥中篩選疾病相關(guān)酶抑制劑，有望成為中藥新藥研發(fā)的重要手段。以固定化酶應(yīng)用的載體材料為分類綜述了近十年來(lái)固定化酶技術(shù)用于篩選中藥中酶抑制劑的研究現(xiàn)狀，以期為后續(xù)的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

固定化酶；生物酶；中藥；載體材料；篩選；酶抑制劑

中藥資源豐富，歷史悠久，在預(yù)防與治療疾病中扮演著重要的角色。然而，中藥的化學(xué)成分多種多樣，作用機(jī)制更是復(fù)雜多樣，如何從中藥中篩選疾病相關(guān)藥效物質(zhì)是當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。大量研究表明，人體許多疾病過程都與體內(nèi)生物酶調(diào)節(jié)作用相關(guān)，如痛風(fēng)[1]、阿爾茨海默癥[2]、糖尿病[3-5]等。而且，中藥在治療各種疾病中也扮演著重要角色，如白芷提取物能促進(jìn)新生血管形成與成熟，從而提高自發(fā)2型糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合速率和質(zhì)量[6]；絞股藍(lán)葉水提物能夠降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖，其作用機(jī)制可能與增加骨骼肌肌膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4蛋白表達(dá)和抑制骨骼肌炎癥有關(guān)[7]。因此，基于酶在疾病發(fā)生發(fā)展的重要性，以酶為靶點(diǎn)從中藥中篩選新藥是一有力途徑，而且開發(fā)一種快速、高效的酶抑制劑篩選方法是當(dāng)前首要任務(wù)。

固定化酶技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的，該技術(shù)利用物理或化學(xué)方法將游離酶固定在相應(yīng)的載體上用于篩選酶抑制劑。固定化酶技術(shù)可以有效提高酶的催化性能和操作穩(wěn)定性，并降低成本，是目前廣泛使用的技術(shù)[8]。此外，相比于游離酶，固定酶更有利于酶-配合物的分離純化，在pH耐受性，底物選擇性，熱穩(wěn)定性和可回收性等方面表現(xiàn)出優(yōu)越的性能[9-10]。不同的酶發(fā)揮催化作用的活性部位不同，將酶進(jìn)行固定時(shí)，要使載體材料與酶的非活性部位結(jié)合，才可以保留酶的活性，因此載體材料的選擇是固定化酶技術(shù)發(fā)揮作用的關(guān)鍵。本文以固定載體材料（表1）為分類綜述了近10年固定化酶技術(shù)在中藥酶抑制劑[α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，α-Glu）、脂肪酶等] 篩選中的研究現(xiàn)狀，希望可以為后續(xù)的相關(guān)研究提供一定的參考依據(jù)。

表1 固定化載體材料

GA-戊二醛 PDA-聚多巴胺 EDC-1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基羰基二胺甲碘

GA-glutaric dialdehyde PDA-polydopamine EDC-1-(3- dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide

1 磁性載體

磁性載體材料是利用鐵、錳、鈷及其氧化物等化合物制備的一類具有磁性的材料[11]，通過改變磁力大小和外部磁場(chǎng)的方向來(lái)改變粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡，從而使酶與載體的結(jié)合與分離可以在可控條件下完成，便于固定化酶的分離和收集，并用于酶抑制劑的篩選[12]。以磁性載體為材料的固定化酶技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于利用磁力吸引可使固定化酶快速?gòu)姆磻?yīng)體系中分離，且固定化方法簡(jiǎn)單，能有效減少篩選時(shí)間及實(shí)驗(yàn)試劑的消耗。因此，通過不同方法對(duì)磁性載體材料進(jìn)行功能化修飾，在充分發(fā)揮磁性材料優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上改善其表面性質(zhì)，提高對(duì)不同類型目標(biāo)物的特異性，從而在各類復(fù)雜樣品的前處理過程中有著良好的應(yīng)用潛力[13]。目前，磁珠是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種常用的磁性載體材料，也叫做磁性納米粒子，包括氧化鐵（Fe3O4和γFe2O3）、合金（CoPt3和FePt）等。其中，F(xiàn)e3O4納米粒子具有生物相容性和無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。中藥酶抑制劑篩選中的常用磁珠其磁核以Fe3O4納米粒子為主，殼層為二氧化硅、瓊脂糖、葡聚糖等，是具有超順磁性的小球形磁性粒子[14-15]，可借助外部磁場(chǎng)從生物催化體系中分離酶抑制劑。該方法機(jī)械穩(wěn)定性高、孔隙率低，利于降低反應(yīng)中的傳質(zhì)阻力，提高了固定化酶的重復(fù)使用性。由于其具有操作穩(wěn)定性高、磁響應(yīng)強(qiáng)、磁分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，在生物和藥物研究中得到了廣泛的應(yīng)用[16]。在進(jìn)行酶抑制劑篩選時(shí)，磁珠的修飾位置不同，所固定的位點(diǎn)也不同。因此，在實(shí)驗(yàn)中，往往要根據(jù)靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)選擇合適的磁珠或?qū)⒛骋淮胖檫M(jìn)行修飾后作為固定載體。將酶固定在合適的磁珠上會(huì)增強(qiáng)酶與待篩選酶抑制劑的親和力，利用磁力將固定化酶及其抑制劑從提取液中分離，然后洗去與酶不相互作用的化合物，隨后可得到酶固定化磁珠配體配合物，最后通過洗脫溶劑使配體釋放進(jìn)而通過質(zhì)譜表征[17]。在這種方法中，潛在的配體與酶相互作用，生成酶配體配合物，這有利于利用磁性[18-23]從復(fù)雜混合物中分離活性化合物。在酶抑制劑的篩選中，磁性載體材料是最常用的固定化載體材料[24-30]。

1.1 無(wú)機(jī)載體材料

二氧化硅是磁性納米粒子表面修飾最常用的無(wú)機(jī)材料[23,31-34]，此外還有二氧化鈦[35]、介孔二氧化硅[16]等。Li等[23]首先將Fe3O4分散在水中加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）室溫?cái)嚢璧玫疆a(chǎn)物。然后在超聲作用下將產(chǎn)物分散在含有異丙醇和氨水的混合溶劑中，室溫?cái)嚢柘戮徛尤胝杷嵋阴ィ╰etraethyl orthosilicate，TEOS）溶液得到SiO2@Fe3O4磁性微球，并加入3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，ATPES）對(duì)其表面進(jìn)行改性。最后將α-淀粉酶固定在表面改性的SiO2@Fe3O4磁性微球上。將制得的酶固定化磁性微球用于黃花草中α-淀粉酶抑制劑的篩選，最終得到3種黃酮類化合物對(duì)α-淀粉酶具有較好抑制作用。Liu等[35]采用溶劑熱法（也稱水熱法或水熱合成法）制備了Fe3O4@TiO2納米粒子，并通過靜電相互作用固定脂肪酶。采用透射電鏡、傅里葉變換紅外光譜和X射線衍射等方法對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行表征，以確定脂肪酶是否已經(jīng)被固定。研究中應(yīng)用脂肪酶固定化Fe3O4@TiO2納米粒子從6種具有脂肪酶抑制活性的藏藥中篩選出脂肪酶抑制劑，獲得5種具有與臨床常用減肥藥物奧利司他活性類似的化合物，其中1種化合物（山柰酚）的抑制活性優(yōu)于奧利司他。Yi等[16]將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶固定在介孔二氧化硅磁性微球表面篩選紫蘇中的酶抑制劑，利用高效液相色譜和四極飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定，篩選出6種具有谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶抑制作用的物質(zhì)，其中，迷迭香酸、(?)表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯和(?)-表兒茶素-3-沒食子酸酯具有較好的抑制活性。最后利用分子對(duì)接技術(shù)確定潛在抑制劑與谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合方式。首先，用FeCl3與檸檬酸三鈉和乙酸鈉合成Fe3O4，然后將其分散在含有乙醇、去離子水和氨水的混合溶液中，攪拌均勻后加入TEOS制得SiO2@Fe3O4磁性微球。為進(jìn)一步合成介孔二氧化硅磁性微球（mSiO2@SiO2@Fe3O4），將SiO2@Fe3O4磁性微球分散在十六烷基三甲基氯化銨、去離子水和三乙醇胺中并滴加TEOS，產(chǎn)物用磁鐵分離并清洗除雜后得mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球。最后用PDA對(duì)mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球進(jìn)行表面改性并將谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶固定在其表面。

1.2 有機(jī)載體材料

在酶抑制劑的篩選中，有機(jī)載體材料相比于無(wú)機(jī)載體材料應(yīng)用較少。目前，用于磁性納米粒子表面修飾的有機(jī)載體材料有聚酰胺（polyamidoamine，PAMAM）[36]、共軛-有機(jī)骨架[37]和金屬-有機(jī)骨架[38]等。Jiang等[36]以PAMAM包覆磁性微球?yàn)榛A(chǔ)，建立了一種篩選和鑒定赤芍提取物中α-Glu抑制劑的方法。首先，采用微修飾法合成了Fe3O4-COOH微球。然后，通過Fe3O4-COOH微球表面羧基與PAMAM氨基的偶聯(lián)反應(yīng)，制備了Fe3O4@PAMAM微球。最后，通過GA的交聯(lián)，成功地將α-Glu連接到其表面。結(jié)果表明，沒食子酸和(+)-兒茶素對(duì)α-Glu均具有較好抑制作用。Zhao等[37]將乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase,AchE）固定在適配體功能化磁性納米顆粒共軛有機(jī)骨架上構(gòu)建固定化酶反應(yīng)器，并將該方法用于酒石酸、(?)-石杉?jí)AA、多奈哌齊和小檗堿4種AchE抑制劑抑制活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酒石酸的IC50與已報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)，證明了該固定化酶反應(yīng)器的可行性。Wu等[38]將α-Glu固定在磁性納米材料Fe3O4@ZIF-67上，構(gòu)建了快速篩選α-Glu抑制劑的生物微反應(yīng)器。然后，將酶生物微反應(yīng)器通過外加磁場(chǎng)固定在連接高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）和微注射泵2端的管中，形成一個(gè)磁性在線篩選系統(tǒng)。以信陽(yáng)毛尖粗茶提取物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)該在線篩選方法進(jìn)行驗(yàn)證，利用該在線篩選系統(tǒng)篩選出3種抑制劑（兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子酸酯）。與傳統(tǒng)方法相比，該方法可將篩選、洗脫和分析結(jié)合起來(lái)，可以簡(jiǎn)單、高效、直接地從天然來(lái)源篩選和鑒定潛在的α-Glu抑制劑。

磁珠分散性好，磁分離速度快，酶結(jié)合量大，酶活性高，是固定化酶的理想載體，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于酶抑制劑的篩選中。將酶固定在特定的磁珠上，可實(shí)現(xiàn)酶抑制劑的分離。此方法操作較穩(wěn)定，非特異性結(jié)合率低。因此，酶固定化磁珠技術(shù)因其快速的生物分析、導(dǎo)向性分離和從復(fù)雜混合物中直接捕獲配體而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

2 非磁性載體

2.1 無(wú)機(jī)載體材料

2.1.1 石英毛細(xì)管 毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）具有分離效率高、分析速度快、操作簡(jiǎn)單和樣品消耗少以及可與多種檢測(cè)手段聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，在酶分析研究中越來(lái)越受到關(guān)注[39-41]。近年來(lái)，固定化酶微反應(yīng)器與生物活性靶向技術(shù)相結(jié)合已應(yīng)用于中藥酶抑制劑的篩選[42]。該方法將酶固定在經(jīng)過修飾的石英毛細(xì)管內(nèi)，捕獲抑制劑后，洗滌未結(jié)合組分，進(jìn)而通過蛋白質(zhì)變性洗脫活性結(jié)合配體，允許直接并可重復(fù)注射生物樣品到高效液相色譜上進(jìn)行檢測(cè)，篩選和分離一步完成，大大縮短了操作時(shí)間。但該方法制備過程中是比較復(fù)雜繁瑣的[43-44]，而且載體的孔隙率[45]、孔徑[46]和表面化學(xué)[47-48]等因素也很容易影響固定化酶的性能。

Wu等[49-50]用PDA對(duì)石英毛細(xì)管進(jìn)行表面改性，并與氧化石墨烯共聚形成聚多巴胺/氧化石墨烯涂層，增加了固定化酶的結(jié)合率，并將該方法成功用于凝血酶和凝血因子Xa以及黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選。有研究者用3-氨基丙基三乙氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管進(jìn)行表面改性，采用戊二醛交聯(lián)法進(jìn)行酶的固定，并成功用于酶制劑的篩選。Rodrigues等[51]將此修飾方法用于黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）抑制劑的篩選，成功地從不同天然產(chǎn)物中篩選出30個(gè)潛在的XOD抑制劑。Zhang等[52]將此修飾方法用于組織蛋白酶B抑制劑篩選，并從中藥中發(fā)現(xiàn)了17個(gè)具有抑菌潛力的活性成分，發(fā)現(xiàn)山柰酚等5種天然產(chǎn)物有潛在的抑制作用，并以分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證。Tang等[53]將此修飾方法用于脂肪酶抑制劑的在線篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種天然產(chǎn)物對(duì)脂肪酶活性均有抑制作用。Zhao等[54]將此修飾方法用于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)了6種天然產(chǎn)物為潛在抑制劑。進(jìn)一步測(cè)定了這6種化合物對(duì)神經(jīng)氨酸酶潛在的抑制活性，由大到小分別為：甲基補(bǔ)骨脂黃酮A＞補(bǔ)骨脂甲素＞黃芩素＞黃芩苷＞白楊素和牡荊素。此外，還有研究者采用單片毛細(xì)管固定化酶反應(yīng)器與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，成功用于酶抑制劑的篩選[55-56]。

毛細(xì)管的高表面體積比有利于足夠高濃度的酶用于酶促反應(yīng)[57-58]。此外，由于注入的底物溶液直接與固定化酶分子接觸，使傳統(tǒng)的采樣、反應(yīng)、分離和檢測(cè)多步操作簡(jiǎn)化為一步操作，因此該分析變得更簡(jiǎn)單，不需要額外的混合程序。與磁性載體相比，該技術(shù)將篩選和分離集成為一步，大大縮短了操作時(shí)間。該技術(shù)適用于復(fù)雜混合物中酶抑制劑的快速篩選，而且樣品消耗量少，節(jié)省了試劑成本，可以實(shí)現(xiàn)酶抑制劑的快速分離。

2.1.2 硅酸鋁納米管 硅酸鋁納米管（halloysite nanotubes，HNTs）是一種天然存在的硅酸鹽納米管，由于其優(yōu)異的物理特性，引起了人們?cè)絹?lái)越多的興趣。HNTs的內(nèi)徑為20～30 nm，外徑為30～50 nm，長(zhǎng)度為1～2 μm，為藥物、酶和殺菌劑的儲(chǔ)存提供了理想的納米級(jí)包埋系統(tǒng)。更重要的是，HNTs的外表面主要由-Si-基團(tuán)組成，內(nèi)表面由Al2O3組成，為酶提供了更多的選擇性結(jié)合位點(diǎn)，從而減少了配體在HNTs上的非特異性吸附[59]。因此，有研究者將HNTs作為一種新的酶固定載體材料用于酶抑制劑的篩選。Wang等[59]通過靜電吸附作用將脂肪酶固定到羥基納米管上用于厚樸中脂肪酶抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)厚樸三酚和厚樸醛B 2種化合物對(duì)脂肪酶抑制活性較好。HNTs的內(nèi)外表面為酶提供了更多的選擇性結(jié)合位點(diǎn)，降低了非特異性吸附，但其合成較為復(fù)雜，收率較低，因此應(yīng)用有限。

2.1.3 多孔二氧化硅 多孔二氧化硅材料具有表面張力低、粘溫系數(shù)小、壓縮性高、氣體滲透性高等基本性質(zhì)，同時(shí)還具有耐高溫和低溫、電氣絕緣、耐氧化穩(wěn)定性、耐候性、難燃、耐腐蝕、無(wú)毒無(wú)味以及生理惰性等特性[60]。Hou等[61]首先將α-Glu結(jié)合到脂質(zhì)體囊泡中，然后采用反蒸發(fā)法將其負(fù)載到多孔二氧化硅表面，制備成受體脂質(zhì)體生物膜色譜柱，用于五味子提取物的α-Glu抑制劑篩選，并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了五味子苷的降糖作用。

2.2 有機(jī)載體材料

2.2.1 中空纖維 中空纖維是一種具有孔徑和內(nèi)腔的有機(jī)聚合物，具有比表面積大、生物材料和有機(jī)溶劑消耗低，且設(shè)備便宜、用于中空纖維制備的材料來(lái)源豐富，是酶、細(xì)胞、脂質(zhì)體等生物材料的理想載體，已被應(yīng)用于酶固定化中。首先，對(duì)中空纖維進(jìn)行活化。然后，將酶與已活化的中空纖維孵育使酶被吸附在中空纖維上。最后，將待測(cè)物與中空纖維固定化酶孵育，篩選待測(cè)物中潛在酶抑制劑。Zhao等[62]提出了一種基于吸附中空纖維固定化酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）的方法，從葛根提取物中篩選潛在的TYR抑制劑。通過液相色譜-質(zhì)譜分析，成功地檢測(cè)出了7種潛在活性化合物，并進(jìn)一步結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葛根素、葛根素-6--木糖苷、葛根素和阿片苷具有良好的TYR抑制活性。中空纖維因其具有孔徑、內(nèi)腔及比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，為酶提供了充分的附著空間，但由于其清洗較為困難，導(dǎo)致重復(fù)利用率低。

2.2.2 生物傳感器 生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并可將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。絲網(wǎng)印刷電極因其具有批量生產(chǎn)、低成本、高重現(xiàn)性、小尺寸等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域。所謂酶生物傳感器法，是將酶固定在經(jīng)過修飾的絲網(wǎng)印刷電極上，當(dāng)與抑制劑接觸時(shí)會(huì)發(fā)生電信號(hào)變化，通過檢測(cè)電信號(hào)的變化，達(dá)到分析檢測(cè)的目的。Elharrad等[63]為篩選藥用植物中潛在的XOD抑制劑，研制了一種簡(jiǎn)便、靈敏的安培生物傳感器，并用于測(cè)定多種藥用植物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率，發(fā)現(xiàn)留蘭香和馬齒莧2種植物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性較高。以普魯士藍(lán)修飾絲網(wǎng)印刷電極表面，極大降低了生物傳感器的檢測(cè)電位，使該裝置具有較高的選擇性。該傳感器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、選擇性好、成本低、穩(wěn)定性好、結(jié)果快速等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.3 紙 自2007年Whiteside研究小組首次提出微流體裝置概念以來(lái)，紙作為一種新的載體材料，以其良好的生物相容性、大的比表面積、易于修飾、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、化學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[64]。

（1）濾紙：三維打印技術(shù)是利用一種紙分析儀器將紙張制作成為一種特殊的微流體裝置，該裝置成本低，具有較高的比表面積，易于結(jié)合分子吸附蛋白質(zhì)。使用過的紙張?jiān)O(shè)備可以很容易地通過燃燒來(lái)處理，可減少實(shí)驗(yàn)消耗品造成的污染。Guo等[65]將三維打印技術(shù)用于酶抑制劑的篩選，首先，用3D印刷的聚己內(nèi)酯對(duì)濾紙進(jìn)行改性，形成疏水區(qū)。然后，對(duì)濾紙進(jìn)行準(zhǔn)確切割，得到既具有親水性又具有疏水性的改性紙。接下來(lái)，用殼聚糖對(duì)親水區(qū)進(jìn)行改性。最后，將α-Glu固定在親水區(qū)，制備出具有獨(dú)特微流體結(jié)構(gòu)的三維打印技術(shù)微裝置，并成功地將該方法用于篩選植物提取物中具有α-Glu抑制活性的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)綠原酸、槲皮素-3--葡萄糖醛酸、異槲皮素和槲皮素4種化合物對(duì)α-Glu的抑制活性較好。該方法結(jié)合一些便攜式探測(cè)器，如手機(jī)和照相機(jī)，可以獲得定性和定量的結(jié)果。因此，很容易判斷酶在紙上的固定化效果。

（2）纖維素濾紙：纖維素濾紙（cellulose filter paper，CFP）具有成本低、來(lái)源廣、表面積大、生物相容性好、表面羥基含量高等優(yōu)點(diǎn)，被選為新型酶固定化載體，而且CFP可以快速?gòu)拿阜磻?yīng)混合物中分離并終止反應(yīng)，從而縮短了操作時(shí)間，簡(jiǎn)化了其他載體（如納米材料和磁性納米顆粒）所需的分離過程。Li等[66]以纖維素濾紙為載體，對(duì)α-Glu進(jìn)行固定化。利用多巴胺的自聚-粘附行為，通過希夫堿反應(yīng)和邁克爾加成反應(yīng)，將聚多巴胺復(fù)合層包覆α-Glu與改性后的CFP共價(jià)結(jié)合形成固定化酶（CFP/DOPA/α-Glu）。用CFP/DOPA/α-Glu篩選11種中藥中的α-Glu抑制劑，發(fā)現(xiàn)訶子對(duì)α-Glu的抑制作用最強(qiáng)。Zhao等[67]以CFP為載體，以殼聚糖為物理包覆劑引入氨基基團(tuán)，然后以戊二醛為交聯(lián)劑，通過希夫堿反應(yīng)，將AchE與氨基功能化的CFP共價(jià)鍵合進(jìn)行固定化酶。最后，將CFP固定化AchE應(yīng)用于17種中藥的抑制劑篩選。

2.2.4 金屬-有機(jī)骨架 金屬-有機(jī)骨架（metal- organic framework，MOFs）為一種雜化多孔材料，由有機(jī)連接體和金屬節(jié)點(diǎn)通過強(qiáng)的化學(xué)鍵組裝而成。MOFs具有可調(diào)節(jié)孔徑、大比表面積和熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。有研究表明，酶被固定在MOFs上后，其在可重用性、催化活性和穩(wěn)定性方面的性能都有了很大的提高。Chen等[68]首先將ZrCl4和氨基對(duì)苯二甲酸溶于,-二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行超聲，然后分別加入HCl和HAc，得到混合物。隨后，將混合物轉(zhuǎn)移到不銹鋼聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中密封加熱，反應(yīng)混合物在空氣中冷卻至室溫，然后離心。沉淀物用新鮮,-二甲基甲酰胺和無(wú)水乙醇洗凈，后減壓干燥，合成了金屬有機(jī)骨架UiO-66-NH2。UiO-66-NH2通過沉淀交聯(lián)固定化豬胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL），得到的PPL@MOF具有較高的PPL載量和相對(duì)活力恢復(fù)率，并將PPL@MOF復(fù)合物用于篩選夏枯草脂肪酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)了13種潛在的脂肪酶抑制劑。與磁珠、納米粒子相比，MOFs材料酶固定量大、相對(duì)活力恢復(fù)率高。

2.2.5 酶微柱 有研究者采用酶微柱法用于酶抑制劑的篩選，該方法屬于固相萃取技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，可與高效液相色譜耦合，實(shí)現(xiàn)了在線篩選，提高了酶抑制劑的篩選和分析效率。首先將硅膠分散在乙醇中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷形成氨基功能化硅膠，然后將氨基功能化的硅膠與酶液混合，使酶固定在硅膠表面，洗去未結(jié)合酶，最后將酶固定化硅膠填入不銹鋼微柱中形成酶微柱。Peng等[69]運(yùn)用該方法成功的從金銀花中篩選和鑒定XOD抑制劑。該方法與高效液相色譜的在線耦合提高了篩選和分析效率。與傳統(tǒng)的與二維色譜耦合相比，該方法為直接與HPLC耦合，縮短了分析檢測(cè)時(shí)間。

3 總結(jié)與展望

中藥含有的化學(xué)成分復(fù)雜、種類繁多、作用機(jī)制比較復(fù)雜，一直是獲取活性成分或者先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。以酶為靶標(biāo)進(jìn)行藥物篩選是發(fā)現(xiàn)和尋找新藥的重要環(huán)節(jié)之一。隨著固定化酶技術(shù)的發(fā)展，研究者將固定化酶技術(shù)與中藥酶抑制劑的篩選相結(jié)合，并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鑒定，篩選得到很多具有酶抑制活性的化合物，在一定程度上明確了中藥發(fā)揮作用的活性成分及其作用機(jī)制。本文以不同載體材料為分類，綜述了固定化酶技術(shù)在中藥酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。磁珠是最常用的磁性載體材料，該類材料利用磁力吸引可使固定化酶配體配合物快速?gòu)捏w系中分離，且固定化方法簡(jiǎn)單，而且使用后的磁珠可以回收利用，能有效減少人力物力的投入。非磁性載體材料主要以石英毛細(xì)管應(yīng)用最為廣泛。此外，還有中空纖維、納米管、生物傳感器等材料用于篩選中藥中的酶抑制劑，豐富了固定酶的載體材料。固定化酶技術(shù)在酶抑制劑篩選上的應(yīng)用前景十分廣泛，不僅節(jié)省了人力物力而且提高了新藥研發(fā)的效率。目前，固定化酶技術(shù)仍然存在一些問題，如酶與載體材料的結(jié)合率較低、固定化酶的活力也會(huì)有所下降等。但相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及酶抑制劑研究的不斷深入，固定化酶技術(shù)會(huì)成為酶抑制劑篩選最有前景的方法之一。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Robinson P C, Horsburgh S.Gout: joints and beyond, epidemiology, clinical features, treatment and co-morbidities [J]., 2014, 78(4): 245-251.

[2] Semenov V E, Zueva I V, Mukhamedyarov M A,.Novel acetylcholinesterase inhibitors based on uracil moiety for possible treatment of alzheimer disease [J]., 2020, 25(18): E4191.

[3] ?zenver N, Güvenalp Z, Kuruüzüm-Uz A,.Inhibitory potential on key enzymes relevant to type II diabetes mellitus and antioxidant properties of the various extracts and phytochemical constituents fromL [J]., 2020, 44 (10):1-12.

[4] Petersen M J, de Cássia Lemos Lima R, Kjaerulff L,.Immobilized α-amylase magnetic beads for ligand fishing: Proof of concept and identification of α-amylase inhibitors in[J]., 2019, 164: 94-101.

[5] 盧偉熾, 許帥, 朱章志, 等.2型糖尿病中醫(yī)臨床路徑的應(yīng)用效果[J].世界中醫(yī)藥, 2019, 14(6): 1594-1597.

[6] 雷思思, 胡志波, 郭俊, 等.白芷提取物促糖尿病潰瘍新生血管成熟作用及機(jī)制研究 [J].中草藥, 2020, 51(12): 3223-3233.

[7] 王同壯, 王尚, 馬朋, 等.絞股藍(lán)葉水提物對(duì)糖尿病大鼠降血糖作用研究 [J].中草藥, 2020, 51(10): 2828-2834.

[8] Kim K, Lee E.Environmentally-benign dimethyl carbonate-mediated production of chemicals and biofuels from renewable bio-oil [J]., 2017, 10(11): 1790.

[9] Ansari S A, Husain Q.Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials: A review [J]., 2012, 30(3): 512-523.

[10] Meryam Sardar R A.Enzyme immobilization: An overview on nanoparticles as immobilization matrix [J]., 2015, 4(2): 1-8.

[11] 劉濤.磁性納米顆粒定向固定化脂肪酶及其應(yīng)用研究 [D].武漢: 華中科技大學(xué), 2013.

[12] 鄧濤, 余旭亞, 徐軍偉.磁性高分子微球固定化脂肪酶的研究進(jìn)展 [J].化工新型材料, 2013, 41(11): 4-6.

[13] 李菲, 吳昊宬, 李一峻, 等.功能化磁性納米材料在樣品前處理中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].色譜, 2020, 38(1): 2-13.

[14] Ruffert C.Magnetic bead—magic bullet [J]., 2016, 7(2): 21.

[15] Muzzio M, Li J R, Yin Z Y,.Monodisperse nanoparticles for catalysis and nanomedicine [J]., 2019, 11(41): 18946-18967.

[16] Yi R X, Fu R J, Li D P,.Identification of ligands from natural products as inhibitors of glutathione S-transferases using enzyme immobilized mesoporous magnetic beads with high-performance liquid chromatography plus quadrupole time-of-flight mass spectrometry and molecular docking [J]., 2019, 42(24): 3611-3620.

[17] Zhuo R J, Liu H, Liu N N,.Ligand fishing: A remarkable strategy for discovering bioactive compounds from complex mixture of natural products [J]., 2016, 21(11): 1516.

[18] Cie?la ?, Moaddel R.Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products [J]., 2016, 33(10): 1131-1145.

[19] Zhang A Z, Ye F G, Lu J Y,.Screening α-glucosidase inhibitor from natural products by capillary electrophoresis with immobilised enzyme onto polymer monolith modified by gold nanoparticles [J]., 2013, 141(3): 1854-1859.

[20] Liu D M, Chen J, Shi Y P.Screening of enzyme inhibitors from traditional Chinese medicine by magnetic immobilized α-glucosidase coupled with capillary electrophoresis [J]., 2017, 164: 548-555.

[21] Wubshet S G, Brighente I M, Moaddel R,.Magnetic ligand fishing as a targeting tool for HPLC-HRMS-SPE-NMR: α-glucosidase inhibitory ligands and alkylresorcinol glycosides from[J]., 2015, 78(11): 2657-2665.

[22] Tao Y, Zhang Y F, Cheng Y Y,.Rapid screening and identification of α-glucosidase inhibitors from mulberry leaves using enzyme-immobilized magnetic beads coupled with HPLC/MS and NMR [J]., 2013, 27(2): 148-155.

[23] Li Y F, Chen Y, Xiao C Y,.Rapid screening and identification of α-amylase inhibitors fromusing enzyme-immobilized magnetic nanoparticles coupled with HPLC and MS [J]., 2014, 960: 166-173.

[24] Wang Z, Li X Q, Chen M H,.A strategy for screening of α-glucosidase inhibitors fromroot bark based on the ligand fishing combined with high-performance liquid chromatography mass spectrometer and molecular docking [J]., 2018, 180: 337-345.

[25] Cheng G R, Pi Z F, Zheng Z,.Magnetic nanoparticles-based lactate dehydrogenase microreactor as a drug discovery tool for rapid screening inhibitors from natural products [J]., 2020, 209: 120554.

[26] Liu L L, Yuan M M, Huang S Q,.Analysis of xanthine oxidase inhibitors fromwith xanthine oxidase immobilized silica coated Fe3O4nanoparticles [J]., 2018, 8(2): 158.

[27] Liu L, Shi S, Zhao H,.Selective fishing and analysis of xanthine oxidase binders from two Fabaceae species by coupling enzyme functionalized core-shell magnetic nanoparticles with HPLC-MS [J]., 2014, 945/946: 163-170.

[28] Zhang Y P, Shi S Y, Chen X Q,.Functionalized magnetic nanoparticles coupled with mass spectrometry for screening and identification of cyclooxygenase-1 inhibitors from natural products [J]., 2014, 960: 126-132.

[29] Wan L H, Jiang X L, Liu Y M,.Screening of lipase inhibitors fromextract using lipase immobilized on magnetic nanoparticles and study on the inhibitory mechanism [J]., 2016, 408(9): 2275-2283.

[30] Zhu Y T, Ren X Y, Yuan L,.Fast identification of lipase inhibitors in oolong tea by using lipase functionalised Fe3O4magnetic nanoparticles coupled with UPLC-MS/MS [J]., 2015, 173: 521-526.

[31] Zhang Y, Wang Q, Liu R,.Rapid screening and identification of monoamine oxidase-A inhibitors fromusing enzyme-immobilized magnetic beads based method [J]., 2019, 1592: 1-8.

[32] Vanzolini K L, Ainsworth S, Bruyneel B,.Rapid ligand fishing for identification of acetylcholinesterase- binding peptides in snake venom reveals new properties of dendrotoxins [J]., 2018, 152: 1-8.

[33] Zhao Y M, Wang L H, Luo S F,.Magnetic beads-based neuraminidase enzyme microreactor as a drug discovery tool for screening inhibitors from compound libraries and fishing ligands from natural products [J]., 2018, 1568: 123-130.

[34] Ma R, Weng H, Liang J.Screening of lipase inhibitors inwith lipase-linked magnetic microspheres by high-performance liquid chromatography and evaluation in diabetic mice [J]., 2016, 39(23): 4474-4483.

[35] Liu J, Ma R T, Shi Y P.An immobilization enzyme for screening lipase inhibitors from Tibetan medicines [J]., 2020, 1615: 460711.

[36] Jiang J, Yu Y, Wang L,.Enzyme immobilized on polyamidoamine-coated magnetic microspheres for α-glucosidase inhibitors screening fromextracts accompanied with molecular modeling [J]., 2019, 195: 127-136.

[37] Zhao L P, Yang G, Li L S,.Aptamer-functionalized magnetic nanoparticles conjugated organic framework for immobilization of acetylcholinesterase and its application in inhibitors screening [J]., 2020, 1140: 228-235.

[38] Wu X R, Qiu B B, Chen Y N,.Online coupling Fe3O4@ZIF-67@α-glucosidase biomicroreactor with high performance liquid chromatography for rapid screening of α-glucosidase inhibitors in tea and their inhibitory activity research [J]., 2020, 1159: 122398.

[39] Schejbal J, Glatz Z.Immobilized-enzyme reactors integrated with capillary electrophoresis for pharmaceutical research [J]., 2018, 41(1): 323-335.

[40] Iqbal J, Iqbal S, Müller C E.Advances in immobilized enzyme microbioreactors in capillary electrophoresis [J]., 2013, 138(11): 3104-3116.

[41] 宋佳一, 李夢(mèng)琦, 沈昊, 等.基于DNA定向固定化技術(shù)構(gòu)建毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器的研究進(jìn)展 [J].色譜, 2020, 38(10): 1206-1210.

[42] Cheng M X, Chen Z L.Recent advances in screening of enzymes inhibitors based on capillary electrophoresis [J]., 2018, 8(4): 226-233.

[43] Ma J F, Liang Z, Qiao X Q,.Organic-inorganic hybrid silica monolith based immobilized trypsin reactor with high enzymatic activity [J]., 2008, 80(8): 2949-2956.

[44] Sakai-Kato K, Kato M, Toyo'oka T.On-line trypsin-encapsulated enzyme reactor by the Sol-gel method integrated into capillary electrophoresis [J]., 2002, 74(13): 2943-2949.

[45] Magner E.Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials [J]., 2013, 42(15): 6213-6222.

[46] Bayne L, Ulijn R V, Halling P J.Effect of pore size on the performance of immobilised enzymes [J]., 2013, 42(23): 9000-9010.

[47] Kim J, Grate J W, Wang P.Nanostructures for enzyme stabilization [J]., 2006, 61(3): 1017-1026.

[48] Vlakh E G, Tennikova T B.Flow-through immobilized enzyme reactors based on monoliths: I.Preparation of heterogeneous biocatalysts [J]., 2013, 36(1): 110-127.

[49] Wu Z Y, Zhang H, Yang Y Y,.An online dual-enzyme co-immobilized microreactor based on capillary electrophoresis for enzyme kinetics assays and screening of dual-target inhibitors against thrombin and factor Xa [J]., 2020, 1619: 460948.

[50] Wu Z Y, Zhang H, Li F,.Evaluation of xanthine oxidase inhibitory activity of flavonoids by an online capillary electrophoresis-based immobilized enzyme microreactor [J]., 2020, 41(15): 1326-1332.

[51] Rodrigues M V N, Rodrigues-Silva C, Boaventura S,.On-Flow LC-MS/MS method for screening of xanthine oxidase inhibitors [J]., 2020, 181: 113097.

[52] Zhang B, Chen Z.Screening of cathepsin B inhibitors in traditional Chinese medicine by capillary electrophoresis with immobilized enzyme microreactor [J]., 2019, 176: 112811.

[53] Tang Y X, Li W, Wang Y Y,.Rapid on-line system for preliminary screening of lipase inhibitors from natural products by integrating capillary electrophoresis with immobilized enzyme microreactor [J]., 2020, 43(5): 1003-1010.

[54] Zhao H Y, Chen Z L.Screening of neuraminidase inhibitors from traditional Chinese medicines by integrating capillary electrophoresis with immobilized enzyme microreactor [J]., 2014, 1340: 139-145.

[55] Lin H, Zhang C F, Lin Y J,.A strategy for screening trypsin inhibitors from traditional Chinese medicine based on a monolithic capillary immobilized enzyme reactor coupled with offline liquid chromatography and mass spectrometry [J]., 2019, 42(11): 1980-1989.

[56] Wang L, Zhao Y M, Zhang Y Y,.Online screening of acetylcholinesterase inhibitors in natural products using monolith-based immobilized capillary enzyme reactors combined with liquid chromatography-mass spectrometry [J]., 2018, 1563: 135-143.

[57] Cheng M, Chen Z.Trypsin inhibitor screening in traditional Chinese medicine by using an immobilized enzyme microreactor in capillary and molecular docking study [J]., 2017, 40(15): 3168-3174.

[58] Ji X, Ye F, Lin P,.Immobilized capillary adenosine deaminase microreactor for inhibitor screening in natural extracts by capillary electrophoresis [J]., 2010, 82(4): 1170-1174.

[59] Wang H, Zhao X, Wang S,.Fabrication of enzyme-immobilized halloysite nanotubes for affinity enrichment of lipase inhibitors from complex mixtures [J]., 2015, 1392: 20-27.

[60] 賈艷萍, 馬姣, 張?zhí)m河, 等.多孔二氧化硅材料的應(yīng)用進(jìn)展 [J].硅酸鹽通報(bào), 2014, 33(12): 3206-3212.

[61] Hou X, Lou X, Guo Q,.Development of an immobilized liposome chromatography method for screening and characterizing α-glucosidase-binding compounds [J]., 2020, 1148: 122097.

[62] Zhao C P, Yin S J, Chen G Y,.Adsorbed hollow fiber immobilized tyrosinase for the screening of enzyme inhibitors fromextract [J]., 2021, 193: 113743.

[63] El Harrad L, Amine A.Amperometric biosensor based on Prussian blue and nafion modified screen-printed electrode for screening of potential xanthine oxidase inhibitors from medicinal plants [J]., 2016, 85: 57-63.

[64] Martinez A W, Phillips S T, Butte M J,.Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays [J]., 2007, 46(8): 1318-1320.

[65] Guo S X, Lin X T, Wang Y,.Fabrication of paper-based enzyme immobilized microarray by 3D-printing technique for screening α-glucosidase inhibitors in mulberry leaves andleaves [J]., 2019, 14: 13.

[66] Li P, Ma X H, Dong Y M,.α-Glucosidase immobilization on polydopamine-coated cellulose filter paper and enzyme inhibitor screening [J]., 2020, 605: 113832.

[67] Zhao H H, Liu Y Q, Chen J.Screening acetylcholinesterase inhibitors from traditional Chinese medicines by paper-immobilized enzyme combined with capillary electrophoresis analysis [J]., 2020, 190: 113547.

[68] Chen X L, Xue S, Lin Y L,.Immobilization of porcine pancreatic lipase onto a metal-organic framework, PPL@MOF: A new platform for efficient ligand discovery from natural herbs [J]., 2020, 1099: 94-102.

[69] Peng M J, Shi S Y, Chen L,.Online coupling solid-phase ligand-fishing with high-performance liquid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry for rapid screening and identification of xanthine oxidase inhibitors in natural products [J]., 2016, 408(24): 6693-6701.

Research status of immobilized enzyme technology in screening of enzyme inhibitors of traditional Chinese medicine

AN Qiong1, LI Guo-feng1, LANG Yi-fan1, YANG Wu-liang1, CHEN Chun-lan1, ZHANG Wu-gang2, CHEN Hai-fang1

1.Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2.National Engineering Center for Manufacturing Technology of Solid Preparation in Traditional Chinese Medicine, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

Immobilized enzyme technology is a physical or chemical method to fix free enzyme on the corresponding carrier for screening enzyme inhibitors.This method has high selectivity and high stability.Starting from the different pharmacological effects of traditional Chinese medicine (TCM), using disease-related biological enzymes and combining with immobilized enzyme technology to screen related enzyme inhibitors in TCM, this method may become an important means for new drug research and development.In this paper, the research status of immobilized enzyme in the screening of enzyme inhibitors in TCM in recent ten years was reviewed based on the carrier materials used for immobilized enzyme in order to provide a certain theoretical basis for the subsequent research.

immobilized enzyme; biological enzymes; traditional Chinese medicine; carriermaterial; screening; enzyme inhibitor

R28；R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 7057 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.032

2021-02-07

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20192BAB205109）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81903917）；江西省教育廳項(xiàng)目（GJJ19067）；博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2018WBZR002）

安 瓊（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究。Tel: 17807051975 E-mail: 569946976@qq.com

通信作者：張武崗（1979—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel: 15083551442 E-mail: zwgchf98@foxmail.com

陳海芳（1979—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel: 15350004308 E-mail: chenhf88@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]