基于HPLC指紋圖譜與一測多評法聯(lián)用的血府逐瘀片質(zhì)量控制研究

馬夢鴿，楊 莎，唐志書, *，宋忠興，史鑫波，賈艾玲，劉妍如，馬虎強(qiáng)，王昌利,

基于HPLC指紋圖譜與一測多評法聯(lián)用的血府逐瘀片質(zhì)量控制研究

馬夢鴿1，楊 莎2，唐志書1, 2*，宋忠興2，史鑫波2，賈艾玲1，劉妍如2，馬虎強(qiáng)3，王昌利2, 3

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西中藥產(chǎn)業(yè)研究院，陜西 咸陽 712046 3.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 712000

建立血府逐瘀片HPLC指紋圖譜及其6種成分苦杏仁苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、阿魏酸、新橙皮苷的一測多評法（QAMS），驗(yàn)證該方法在血府逐瘀片質(zhì)量分析中應(yīng)用的科學(xué)性與可行性。采用中藥指紋圖譜軟件（2012A版）軟件對10批樣品進(jìn)行相似度分析。以苦杏仁苷為內(nèi)參物，建立芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相對校正因子（s/i），并利用s/i計(jì)算血府逐瘀片樣品中該6種成分的含量，同時(shí)采用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，并比較2種方法差異。10批樣品指紋圖譜中共有24個(gè)峰，相似度均大于0.990。以苦杏仁苷為內(nèi)參物建立的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、阿魏酸、新橙皮苷的s/i分別為1.169 6、0.172 0、0.363 3、0.141 3、0.259 2，QAMS與外標(biāo)法得到的10批血府逐瘀片樣品含量測定結(jié)果相對誤差（RE）＜3%，沒有顯著差異。建立的指紋圖譜和QAMS含量測定法穩(wěn)定可控，簡單易行，可用于血府逐瘀片的質(zhì)量控制。

血府逐瘀片；一測多評法；HPLC；指紋圖譜；苦杏仁苷；芍藥苷；阿魏酸；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

血府逐瘀片（Xuefu Zhuyu Tablets，XZT）是由血府逐瘀湯經(jīng)現(xiàn)代工藝制作而成的復(fù)方制劑，始載于清代著名醫(yī)家王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)》中，由柴胡、地黃、桃仁、當(dāng)歸、赤芍、麩炒枳殼、川芎、甘草、牛膝、紅花、桔梗11味中藥組成，具有活血祛瘀、行氣止痛的功效。臨床上用于氣滯血瘀所致的胸痹、頭痛日久、痛如針刺而有定處、內(nèi)熱煩悶、失眠多夢、心悸怔仲、急躁善怒等癥[1-3]。方中桃仁活血祛瘀，主要含揮發(fā)油類、氨基酸、蛋白質(zhì)類、黃酮及其苷類等。紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛，主要含有羥基紅花黃色素A、山柰素等成分。川芎活血行氣止痛，為“血中氣藥”，主要含揮發(fā)油、生物堿、多糖等。赤芍擅長涼血、祛瘀、止痛，主要含鞣質(zhì)、黃酮、揮發(fā)油、萜類及其苷類等。當(dāng)歸具有補(bǔ)血、活血之功，主要含黃酮、皂苷、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)油、氨基酸等多種活性成分。牛膝長于活血通經(jīng)，祛瘀止痛；桔梗開宣肺氣、載藥上行。二者合用可舒暢全身氣機(jī)血脈。生地涼血滋陰、養(yǎng)血活血；柴胡疏肝解郁、升達(dá)清陽；枳殼理氣行滯；五藥合用，開胸行氣，調(diào)節(jié)全身氣機(jī)，氣行則血行，氣機(jī)調(diào)暢則能促進(jìn)血液正常運(yùn)行。甘草調(diào)和諸藥，祛除毒性。這些藥配合起來，共同起到行氣止痛，活血祛瘀而不傷陰液，活血而不傷血之功效[4-10]。

中成藥復(fù)方制劑由多味中藥材組方而成，每味藥材又含有多種成分，因此復(fù)方制劑中有效成分復(fù)雜多樣，具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)僅對所含單一成分進(jìn)行定量分析，難以全面控制其質(zhì)量，因此，多指標(biāo)成分評價(jià)模式已逐步應(yīng)用于相關(guān)質(zhì)量控制中[11-13]。劉立輝[14]建立HPLC測定XZT赤芍中的芍藥苷的含量。但文獻(xiàn)對XZT的報(bào)道較少并且存在所測指標(biāo)單一等問題，無法系統(tǒng)地評價(jià)中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量。一測多評法（QAMS）具有操作成本低、簡單、快捷的優(yōu)點(diǎn)，適用于藥效成分復(fù)雜多樣的中藥及中藥制劑，符合中藥多成分、多功效的作用特點(diǎn)[15-16]。因此，為了更好地控制XZT的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立XZT的指紋圖譜，并采用QAMS法，以苦杏仁苷為內(nèi)參物，同步測定其主要活性成分阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、芍藥苷、新橙皮苷，以期為該制劑的質(zhì)量控制和評價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Waters e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；色譜柱為Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CPA225D電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q型純水機(jī)。

1.2 試藥

對照品阿魏酸（批號110773-201614）、橙皮苷（批號110721-201818）、柚皮苷（批號110722-201815）、芍藥苷（批號110736-201842）、苦杏仁苷（批號110820-201808）、新橙皮苷（批號111857-201703），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，購自于中國食品藥品檢定研究院。

枳殼（麩炒）為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥未成熟果實(shí)；當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels.的干燥根；川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖；赤芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根；桃仁（炒）為薔薇科桃屬植物桃(L.) Batsch.的干燥成熟種子；柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡DC.的干燥根；牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝Bl.的干燥根；紅花為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥花；甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根；桔梗為桔?？平酃僦参锝酃?Jacq.) A.DC.的干燥根；地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根，以上均由陜西海天制藥有限公司提供，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍高級工程師鑒定均為正品。

XZT，每片質(zhì)量0.42 g，批號190402、190403、190404、190501、190502、190503、190504、190602、190704、190803，分別編號S1～S10，由陜西海天制藥有限公司提供。甲醇（批號V1LG3H）和乙腈（批號UCNA1H）均為色譜純，上?；裟犴f爾貿(mào)易有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min：5%～10%乙腈；3～12 min：10%～15%乙腈；12～13 min：15%～18%乙腈；13～15 min：18%～22%乙腈；15～22 min：22%～25%乙腈；22～30 min：25%～5%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm、215 nm（苦杏仁苷、芍藥苷）、254 nm（阿魏酸）、270 nm（橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷）；進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按苦杏仁苷計(jì)算不低于1×105，各組分離度良好（分離度＞1.5）。外標(biāo)法檢測波長215 nm，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和阿魏酸對照品適量，用甲醇稀釋，即得含苦杏仁苷123.3 μg/mL、芍藥苷83.3 μg/mL、柚皮苷113.3 μg/mL、新橙皮苷123.3 μg/mL、橙皮苷156.6 μg/mL、阿魏酸60.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 本品除去薄膜衣后研成細(xì)粉，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，放置過夜后，超聲（功率250 W、頻率40 kHz）處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例（柴胡29.4 g、當(dāng)歸88.2 g、地黃88.2 g、赤芍58.8 g、紅花88.2 g、桃仁117.6 g、枳殼58.8 g、甘草29.4 g、川芎44.1 g、牛膝88.2 g、桔梗44.1 g），分別制備缺枳殼、缺赤芍、缺桃仁、缺當(dāng)歸川芎的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得各陰性樣品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批XZT樣品（批號190803），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算所有共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對峰面積RSD值均小于2.0%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號190803），按照“2.2.2”項(xiàng)下操作條件平行制備6份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算所有共有峰的相對保留時(shí)間和樣品含量。結(jié)果表明，各色譜峰的樣品含量的RSD值均小于2.0%。

1-苦杏仁苷 2-芍藥苷 3-阿魏酸 4-柚皮苷 5-橙皮苷 6-新橙皮苷

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號190803），室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積RSD值分別為1.11%、2.69%、2.75%、2.10%、2.31%、0.94%，表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立 取10批次的XZT樣品，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。將10批樣品所得各色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜軟件（2012A版）軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)S1樣品圖譜為參照圖譜，采用多點(diǎn)校正方式（時(shí)間窗寬度為0.1 min），用平均數(shù)法生成指紋圖譜和對照指紋圖譜（圖2）。通過對10批次樣品指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)圖中有24個(gè)峰為所有樣品溶液色譜圖中的共有色譜峰，因此，確定此24個(gè)色譜峰為XZT的共有峰。其中16號峰分離度以及對稱性良好，故作為參照峰（S）。

2.3.5 相似度評價(jià) 對10批XZT樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度的計(jì)算，結(jié)果S1～S10樣品的相似度分別為0.999、0.997、0.992、0.995、0.998、0.999、0.998、0.996、0.993、0.998，結(jié)果表明10批XZT的相似度均大于0.990，說明10批次XZT樣品的質(zhì)量相對穩(wěn)定。

2.3.6 共有峰指認(rèn)歸屬 采用混合對照品（圖3）對共有峰進(jìn)行指認(rèn)，與對照指紋圖譜相對保留時(shí)間進(jìn)行比對（圖3），確定了其中6個(gè)共有峰，分別為1號峰（苦杏仁苷）、2號峰（芍藥苷）、3號峰（阿魏酸）、4號峰（柚皮苷）、5號峰（橙皮苷）、6（新橙皮苷），結(jié)果說明XZT與其組方藥材之間存在良好的相關(guān)性。

2.4 指標(biāo)成分含量測定的方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的（苦杏仁苷123.3 μg/mL、芍藥苷83.3 μg/mL、柚皮苷113.3 μg/mL、新橙皮苷123.3 μg/mL、橙皮苷156.6 μg/mL、阿魏酸60.0 μg/mL）的混合對照品溶液I加甲醇稀釋2、4、10、50、100倍制得混合對照品溶液II～VI，將不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液I～VI按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度作為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表1，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 10批XZT指紋圖譜及對照指紋圖譜(R)

1-苦杏仁苷 2-芍藥苷 3-阿魏酸 4-柚皮苷 5-橙皮苷 6-新橙皮苷

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，測得苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.52%、0.39%、0.26%、0.24%、0.38%、0.29%，說明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號190803），室溫下于制備后0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為1.11%、2.69%、2.75%、2.10%、2.31%、0.94%，結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號190803），按照“2.2.2”項(xiàng)下條件平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，測得苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.82%、2.30%、1.29%、1.60%、1.98%、2.22%，說明該方法的重復(fù)性良好。

表1 各成分的回歸方程、線性范圍和檢測線、定量限

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一批樣品（批號190803）約1 g，稱取6份，精密稱定，分別加入與XZT各成分相等含量的對照品溶液，再按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率分別為99.12%、99.72%、101.14%、98.54%、101.01%、97.58%，RSD分別為2.13%、2.61%、2.16%、2.09%、1.68%、1.85%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 QAMS建立

2.5.1s/i的測定 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液分別進(jìn)樣1、3、5、7、9、11 μL，記錄各成分峰面積，以苦杏仁苷為內(nèi)參物，采用多點(diǎn)校正法，按照下面公式分別計(jì)算芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的s/i，結(jié)果5個(gè)待測成分與內(nèi)參物s/i的RSD值均小于2%，見表2。

s/is/fsC/ACs

s為苦杏仁苷對照品的峰面積，s為苦杏仁苷對照品的質(zhì)量濃度，A為待測成分峰面積，C為待測成分的質(zhì)量濃度

2.5.2 不同儀器和不同色譜柱考察 考察了Waters e2695和Agilent 1260 2種高效液相色譜儀及Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱對s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同儀器和色譜柱適用性良好。結(jié)果見表3。

表2 各成分的fs/i

2.5.3 不同柱溫對s/i的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260色譜儀和Diamonsil Plus C18色譜柱考察了柱溫25、30、35 ℃對s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同柱溫對各成分無顯著影響。結(jié)果見表4。

2.5.4 不同體積流量對s/i的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260色譜儀和Diamonsil Plus C18色譜柱考察了體積流量為0.8、0.9、1.0 mL/min時(shí)對s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同體積流量的變化對各成分的s/i無明顯影響。結(jié)果見表5。

2.5.5 不同檢測波長對s/i的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260色譜儀和Diamonsil Plus C18色譜柱考察了檢測波長為213、215、217 nm時(shí)對s/i的影響，并計(jì)算RSD，結(jié)果均小于3%，表明不同檢測波長的變化對各成分的s/i無明顯影響。結(jié)果見表6。

表3 不同儀器和色譜柱對fs/i的影響

表4 不同柱溫對fs/i的影響

表5 不同體積流量對fs/i的影響

綜上幾種因素，說明該方法對s/i耐用性良好。

2.6 待測組分色譜峰定位

取混合對照品溶液，選取3只不同品牌色譜柱，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以苦杏仁苷為內(nèi)參物，計(jì)算其他5種成分相對保留時(shí)間（s/i），對待測組分進(jìn)行定位，并計(jì)算RSD，結(jié)果各待測成分相對保留值得RSD均小于5%，表明采用相對保留值法對待測成分定位是合理的。結(jié)果見表7。

2.7 QAMS與外標(biāo)法結(jié)果對比

取10批樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，采用QAMS法建立內(nèi)參物苦杏仁苷與芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的s/i，對10批XZT樣品中各成分進(jìn)行含量測定，同時(shí)采用外標(biāo)法對苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷進(jìn)行含量測定，并以相對誤差（relative error，RE）來表示2種方法測得結(jié)果的差異，RE＝(QAMS－外標(biāo)法)/外標(biāo)法（QAMS為QAMS測得的含量，外標(biāo)法為外標(biāo)法測得的含量）。結(jié)果見表8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外標(biāo)法與QAMS法計(jì)算所得到的組分含量基本一致，外標(biāo)法實(shí)測含量值與QAMS法所測成分含量值無顯著性差異。10批樣品中苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷外標(biāo)法與QAMS法綜合質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.351～2.433、2.684～2.802、0.173～0.183、1.845～1.980、1.912～2.026、1.084～1.310 mg/g，以苦杏仁苷、芍藥苷成分含量較高。

表6 不同檢測波長對fs/i的影響

表7 不同色譜柱測得的ts/i值

QAMS法是通過測定某個(gè)代表性成分，來計(jì)算出其他待測有效成分的含量，使其計(jì)算值與實(shí)測值符合定量方法學(xué)的要求，但是中藥成分復(fù)雜，對其研究也是一項(xiàng)復(fù)雜龐大的工程，QAMS法簡化了分析過程，降低分析成本，但在實(shí)際應(yīng)用中可能還存在著局限性，為了使QAMS法在同時(shí)測定中藥多成分中得到廣泛應(yīng)用，還需對QAMS法相關(guān)技術(shù)進(jìn)行深入研究。

表8 QAMS法與外標(biāo)法測得10批XZT中6種成分的質(zhì)量濃度

3 討論

3.1 XZT測定指標(biāo)成分的選定

XZT含量測定指標(biāo)及其測定方法的報(bào)道較少，而且已有的報(bào)道研究依然存在所測指標(biāo)單一等問題，未見更多組分同時(shí)在XZT測定中的報(bào)道，《中國藥典》2015、2020年版關(guān)于血府逐瘀制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以赤芍中的芍藥苷、麩炒枳殼中的柚皮苷、桃仁中的苦杏仁苷作為含量測定的指標(biāo)性成分。故本研究首次建立QAMS法結(jié)合指紋圖譜技術(shù)同時(shí)測定XZT中6個(gè)組分苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量，能較全面地評價(jià)其整體質(zhì)量。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（水及30%、50%、80%、100%甲醇），結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇用50%甲醇作為提取溶劑，已提取完全，且峰型較好，基線也平穩(wěn)，因此綜合考慮，選用50%甲醇作為提取溶劑。超聲時(shí)間（10、20、30 min），結(jié)果顯示20 min和30 min各共有峰峰面積無明顯差異，且峰面積均高于超聲10 min，說明超聲20 min已經(jīng)提取完全，因此超聲時(shí)間定為20 min。以所測6個(gè)組分苦杏仁苷、芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷、阿魏酸、新橙皮苷的提取效率為指標(biāo)，最終確定XZT供試品溶液的制備方法以50%醇作為提取溶劑、超聲提取時(shí)間為20 min。

3.3 流動相篩選

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%的磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同體系流動相，以XZT中所測成分柚皮苷、苦杏仁苷、芍藥苷、橙皮苷、阿魏酸、新橙皮苷分離效果為指標(biāo)，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相色譜峰峰型較好，各峰之間的分離度良好，基線較平穩(wěn)，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.4 內(nèi)參物的選定

建立QAMS法，內(nèi)參物的選定是關(guān)鍵，選定內(nèi)參物的標(biāo)準(zhǔn)是易得、價(jià)廉、性質(zhì)穩(wěn)定、峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定、供試品中的含量高[16]?？嘈尤受赵诠┰嚻啡芤褐芯哂幸陨蟽?yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)選定苦杏仁苷為內(nèi)參物。

3.5 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)測定的化學(xué)成分種類較多，有6種成分。因此，分別考察了210、215、254、270 nm波長下的樣品譜圖，通過比較分析在215 nm下的峰數(shù)目，峰形、分離度、對稱因子、理論塔板數(shù)等參數(shù)，結(jié)果顯示在215 nm波長下檢測到的圖譜出峰較多，基線平穩(wěn)，峰型良好，且干擾少，故選擇以215 nm作為含量分析波長。

4 結(jié)論

本研究首次建立了QAMS法結(jié)合指紋圖譜技術(shù)同時(shí)測定XZT 6種成分的含量，10批樣品指紋圖譜中共有24個(gè)峰，相似度均大于0.990。同時(shí)采用QAMS法和外標(biāo)法分別測定10批XZT 6種成分的含量，結(jié)果表明QAMS法測得的結(jié)果和外標(biāo)法測得的結(jié)果無顯著差異。指紋圖譜與QAMS聯(lián)用的方法，可客觀評價(jià)藥效成分復(fù)雜的復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，以期為該制劑質(zhì)量控制和評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S].一部.2020: 302.

[2] 李強(qiáng), 翟春苗, 石占利, 等.血府逐瘀膠囊改善慢性阻塞性肺疾病高齡患者血栓前狀態(tài)、炎癥因子和呼吸功能及其相關(guān)性分析 [J].中草藥, 2021, 52(14): 4268-4276.

[3] Yu Q, Su J, Zhu K,.The effect of Xuefu Zhuyu decoction on clopidogrel resistance and its association with the P2Y12 gene polymorphisms and promoter DNA methylation [J]., 2019, 32(6): 2565-2572.

[4] 杜元洪.血府逐瘀片預(yù)防血透患者動靜脈內(nèi)瘺血栓形成的臨床觀察 [D].恩施: 湖北民族大學(xué), 2019.

[5] 劉佳佳.通絡(luò)湯保留灌腸聯(lián)合血府逐瘀片內(nèi)服治療血瘀型輸卵管阻塞性不孕的臨床觀察 [D].太原: 山西中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[6] 呂雙宏, 王恒和.血府逐瘀湯臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].湖南中醫(yī)雜志, 2020, 36(10): 200-202.

[7] 張玲, 周慧.一測多評法在血府逐瘀丸質(zhì)量評價(jià)中的應(yīng)用 [J].中草藥, 2018, 49(7): 1588-1593.

[8] 周燕, 薛磊冰, 金佩芬.枳殼及其制劑血府逐瘀膠囊中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定 [J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2016, 33(6): 778-780.

[9] 傅春燕, 王惠余, 劉永輝, 等.基于UPLC-ESI-IT-TOF-MS方法對血府逐瘀湯中8個(gè)成分同時(shí)含量測定 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2020, 32(6): 1006-1013.

[10] 周軍, 孫艷, 張晶, 等.HPLC法測定血府逐瘀顆粒中芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷及甘草酸的含量 [J].藥物分析雜志, 2009, 29(8): 1253-1255.

[11] 鄔國棟, 郭葉, 李剛, 等.一測多評法同時(shí)測定蒙藥古日古木-13丸中6種成分 [J].中草藥, 2020, 51(6): 1542-1547.

[12] 王欣, 覃瑤, 王德江, 等.一測多評法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用進(jìn)展 [J].中成藥, 2016, 38(2): 395-402.

[13] 高喜梅, 池玉梅, 張雯, 等.指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價(jià)酸橙枳實(shí)質(zhì)量的研究 [J].中草藥, 2020, 51(9): 2548-2556.

[14] 劉立輝.高效液相色譜法測定血府逐瘀片中赤芍所含芍藥苷的含量 [J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(5): 772-773.

[15] 王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價(jià)模式方法學(xué)研究 [J].中國中藥雜志, 2006, 31(23): 1925-1928.

[16] 王智民, 錢忠直, 張啟偉, 等.一測多評法建立的技術(shù)指南 [J].中國中藥雜志, 2011, 36(6): 657-658.

Quality control of Xuefu Zhuyu Tablets based on HPLC fingerprint and quantitative analysis of multi-components by single-marker

MA Meng-ge1, YANG Sha2, TANG Zhi-shu1, 2, SONG Zhong-xing2, SHI Xin-bo2, JIA Ai-ling1, LIU Yan-ru2, MA Hu-qiang3, WANG Chang-li2, 3

1.College of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2.Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine Resources Industrialization by Shaanxi & Ministry of Education, Shaanxi Institute of TCM Industry, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 3.Shaanxi Haitian PharmaceuticalCo., Ltd., Xianyang 712000, China

To establish HPLC fingerprint of Xuefu Zhuyu Tablets (血府逐瘀片, XZT) and a quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) method for the simultaneous determination of six components of amygdalin, paeoniflorin, naringin, hesperidin, ferulic acid and neohesperidin in XZT, so as to prove the scientificity and feasibility of the method in the quality analysis for XZT.The similarity evaluation software (2012A) was used to analyze the similarity of 10 batches of samples.The relative factor (s/i) of paeoniflorin, ferulic acid, naringin, hesperidin and neohesperidin were established by HPLC method with amygdalin as internal standard, which were used to calculate the content of five constituents in the samples of XZT.Meanwhile, external standard method (ESM) was used to calculate the content of six constituents.The difference between QAMS and ESM was analyzed to evaluate the accuracy of QAMS.There were 24 common peaks in the fingerprints of 10 batches of samples with the similarities of more than 0.990.Thes/iof paeoniflorin, naringin, hesperidin, ferulic acid and neohesperidin were 1.169 6, 0.172 0, 0.363 3, 0.141 3 and 0.259 2, respectively.There was no significant difference in the content determination results of 10 batches of XZT calculated by the methods of QAMS and ESM, with RE < 3.0%.The fingerprints and QAMS method are stable and controllable, which can be used for the quality control of XZT.

Xuefu Zhuyu Tablets; quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS); fingerprint; amygdalin; paeoniflorin; ferulic acid; naringin; hesperidin; neohesperidin

R286.02

A

0253 - 2670(2021)22 - 6856 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.010

2021-06-02

陜西省中藥大品種品牌價(jià)值提升示范研究（202190025）；國家農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-21）

馬夢鴿（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)與新藥開發(fā)研究。Tel: 18843300105 E-mail: 1281956609@qq.com

通信作者：唐志書，男，博士，教授，主要從事中藥資源開發(fā)與中藥質(zhì)量分析研究。Tel: (029)38185060 E-mail: tzs6565@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]