基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)優(yōu)化經(jīng)典名方桃紅四物湯煎煮工藝

何 瑤，江華娟，成顏芬，杜克群，李敏敏，楊青波，王振中，傅超美，段 毅

基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)優(yōu)化經(jīng)典名方桃紅四物湯煎煮工藝

何 瑤1，江華娟1，成顏芬1，杜克群1，李敏敏1，楊青波2，王振中3, 4，傅超美1*，段 毅2*

1.西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550000 3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 4.中藥制劑過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

遵古優(yōu)化和科學(xué)評(píng)價(jià)桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）的煎煮工藝，為其經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)。以指紋圖譜概貌結(jié)合多指標(biāo)定量為綜合評(píng)價(jià)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。指紋圖譜研究采用SunFire-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液，體積流量為0.2 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；建立HPLC指紋圖譜，對(duì)色譜信息進(jìn)行主成分分析，進(jìn)一步建立UPLC多波長(zhǎng)檢測(cè)方法測(cè)定6個(gè)關(guān)鍵質(zhì)控成分含量，計(jì)算各樣品綜合得分，通過響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。建立了29個(gè)試驗(yàn)號(hào)TSD UPLC指紋圖譜，選擇16個(gè)共有峰，指認(rèn)出地黃苷D、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯共6個(gè)成分。主成分分析提取出4個(gè)主成分，綜合得分結(jié)果顯示15號(hào)工藝為最佳工藝。含量測(cè)定顯示，地黃苷D、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A 6種成分線性關(guān)系良好，綜合得分結(jié)果顯示，15號(hào)工藝為最佳工藝。進(jìn)一步根據(jù)回歸模型擬合，得到最優(yōu)工藝為加水量9.90倍、浸泡時(shí)間0.58 h、煎煮時(shí)間1.19 h、煎煮次數(shù)1.60次，最終確定TSD煎煮工藝為加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h。指紋圖譜質(zhì)量概貌結(jié)合關(guān)鍵質(zhì)控成分可作為TSD制備工藝的質(zhì)量評(píng)控方法，得出的最佳煎煮工藝穩(wěn)定可行，可用于經(jīng)典名方TSD復(fù)方制劑進(jìn)一步研究開發(fā)。

桃紅四物湯；經(jīng)典名方；煎煮工藝；指紋圖譜；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)；主成分分析；HPLC；UPLC；地黃苷D；苦杏仁苷；羥基紅花黃色素A；芍藥苷；阿魏酸；藁本內(nèi)酯

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）出自《婦科冰鑒》（清?柴得華），是國(guó)家公布的第一批經(jīng)典名方目錄方劑，也是2020年首批公布“古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息”的7個(gè)方劑之一。關(guān)鍵信息明確，該方原方為生地三錢（酒洗）、當(dāng)歸四錢（酒洗）、白芍錢五分（酒炒）、川芎一錢、桃仁十四粒（去皮尖研泥）、紅花一錢（酒洗），服用方法為水煎服，功效養(yǎng)血、活血、逐瘀，主治血虛血瘀證[1-3]?；谄浠钛痧龉πВ摲絼┰诂F(xiàn)代臨床上廣泛用于婦科、骨科、內(nèi)科，治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效率在90%以上，經(jīng)常用于治療骨折、術(shù)后血栓和（或）凝血等，以及TSD或單用、或與中西藥合用，治療冠心病、心絞痛、偏頭痛、腦卒中、面神經(jīng)炎、糖尿病及其并發(fā)癥等多種疾病，具有確切的臨床療效和較大的臨床價(jià)值[4-9]，將其開發(fā)為中藥經(jīng)典名方制劑有較大的臨床需求。

在經(jīng)典名方制劑研發(fā)中，遵古制備和構(gòu)建質(zhì)量控制體系是兩個(gè)核心要素。關(guān)鍵信息中公布TSD的服用方法為“水煎溫服”，沒有明確提及煎煮次數(shù)、加水量等參數(shù)，在研究中可根據(jù)衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)）相關(guān)規(guī)定對(duì)重要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化確定。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box- Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）是采用多元回歸方程擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)其分析來尋求最佳工藝參數(shù)，是解決多變量問題的一種有效統(tǒng)計(jì)方法，廣泛應(yīng)用于多因素優(yōu)化試驗(yàn)。BBD-RSM彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法在反映非線性關(guān)系中的不足，多因素多水平之間的關(guān)系通過數(shù)學(xué)模型建立可更穩(wěn)定準(zhǔn)確，在研究復(fù)雜非線性系統(tǒng)中提供了有利的方法[10-12]。而中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次、多途徑、整體作用的特點(diǎn)，少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)成分難以科學(xué)地評(píng)價(jià)制劑工藝優(yōu)劣和制劑質(zhì)量，進(jìn)而得到與方劑功能主治相關(guān)的最優(yōu)提取工藝，以保障臨床用藥的有效性和安全性。通過應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)構(gòu)建中藥復(fù)方的指紋圖譜和指標(biāo)成分含量測(cè)定，從定性和定量2個(gè)角度綜合優(yōu)化中藥復(fù)方工藝過程和關(guān)鍵參數(shù)，是建立科學(xué)合理中藥制備工藝體系的重要策略[13]。

課題組基于前期對(duì)基于質(zhì)量標(biāo)志物辨識(shí)原則和TSD制備過程關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)的辨識(shí)并結(jié)合成分可測(cè)性[14-15]，篩選得到6個(gè)成分作為TSD的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別為地黃苷D、阿魏酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯。因此，本實(shí)驗(yàn)在BBD-RSM設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，以指紋圖譜概貌、關(guān)鍵成分含量測(cè)定結(jié)果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)TSD煎煮工藝進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和參數(shù)優(yōu)化，可為其后續(xù)中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Dionex ULtiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)，包括7311959四元梯度泵、8153411進(jìn)樣器、6021984柱溫箱、8155073 DAD檢測(cè)器、7313241在線脫氣機(jī)和Chromelon Console工作站，賽默飛世爾科技有限公司；DL-720D型數(shù)控超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；FTS-10A型液體加熱器，潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海泉杰儀器有限公司；UPK-I-10T型優(yōu)普系列超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；SHB-IIIA型循環(huán)水式真空泵，北京中興偉業(yè)有限公司；DD5型臺(tái)式大容量低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 藥材

地黃（批號(hào)1904138，產(chǎn)地河南）、當(dāng)歸（批號(hào)1901137，產(chǎn)地甘肅）、白芍（批號(hào)1812034，產(chǎn)地安徽）、川芎（批號(hào)1901002，產(chǎn)地四川）、桃仁（批號(hào)1905004，產(chǎn)地北京）、紅花（批號(hào)2003015，產(chǎn)地新疆）6味藥材購(gòu)自道地產(chǎn)區(qū)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定專業(yè)裴瑾教授鑒定，紅花為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥花，桃仁為薔薇科桃屬植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子，地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2020年版要求。上述藥材經(jīng)實(shí)驗(yàn)室炮制得到酒炙地黃、酒炙當(dāng)歸、酒炙紅花、川芎、燀桃仁、酒炙白芍。

1.3 對(duì)照品及試劑

對(duì)照品地黃苷D（批號(hào)wkq20051709）、阿魏酸（批號(hào)wkq19030705）、芍藥苷（批號(hào)wkq19090808）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)wkq20061509）、苦杏仁苷（批號(hào)wkq20061207）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)wkq20012006）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。色譜純磷酸（批號(hào)2019122601）、乙腈（批號(hào)WXBC8826V）、甲醇（批號(hào)WXBC9153V）購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 供試品和對(duì)照品溶液制備

2.1.1 供試品溶液 按古籍記載處方的2.68倍量，稱取酒炙地黃30 g、酒炙當(dāng)歸40 g、酒炒白芍15 g、川芎10 g、酒炙紅花10 g、燀桃仁10 g，各試驗(yàn)號(hào)樣品按表1因素水平進(jìn)行煎煮，合并煎液，定容到2300 mL（飲片量0.05 g/mL），取10 mL，4000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 分別精密稱定芍藥苷、苦杏仁苷對(duì)照品15.795、6.435 mg，加入甲醇定容到5 mL，溶解制成質(zhì)量濃度分別為3.195、1.287 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；分別精密稱定地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品5.035、2.625、5.650、5.000 mg，加入甲醇定容到10 mL，溶解制成質(zhì)量濃度分別為503.5、262.5、565.0、500.0 μg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2 BBD-RSM因素和水平設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，并參考衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)）相關(guān)規(guī)定，分別對(duì)浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，選取加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）、煎煮時(shí)間（C）、煎煮次數(shù)（D）為考察因素，因素水平見表1，得到29個(gè)試驗(yàn)樣品。

2.3 TSD指紋圖譜概貌評(píng)價(jià)研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱為SunFire-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～17%乙腈；10～35 min，17%～22%乙腈；35～40 min，22%～65%乙腈；40～45 min，65%～80%乙腈；45～50 min，80%乙腈；體積流量為0.2 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；230 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。精密吸取空白溶液甲醇、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。

表1 TSD煎煮工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取試驗(yàn)號(hào)1樣品，按照“2.1”項(xiàng)下方法制得的同一供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，選擇出峰穩(wěn)定、響應(yīng)值高、峰面積較大的阿魏酸為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2%，表明本方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取試驗(yàn)號(hào)1樣品，按照“2.1”項(xiàng)下方法制得的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24、48 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，以阿魏酸為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取試驗(yàn)號(hào)1樣品，按照“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，記錄指紋圖譜，以阿魏酸為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 指紋圖譜分析 經(jīng)各對(duì)照品溶液色譜圖的保留時(shí)間比對(duì)，選擇了特征明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的16個(gè)色譜峰為共有峰，16個(gè)色譜峰中指認(rèn)出6個(gè)成分，分別是1號(hào)峰（地黃苷D）、9號(hào)峰（苦杏仁苷）、11號(hào)峰（羥基紅花黃色素A）、12號(hào)峰（芍藥苷）、13號(hào)峰（阿魏酸）、15號(hào)峰（藁本內(nèi)酯）。記錄各樣品色譜圖及峰面積信號(hào)值，分析不同煎煮工藝過程中16個(gè)共有峰相對(duì)峰面積變化過程，結(jié)果見圖1和表2。

2.3.6 指紋信息主成分分析（principal component analysis，PCA） 將指紋圖譜的16個(gè)共有峰峰面積分別導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行PCA，結(jié)果見表3和圖2。主成分特征值、累積方差貢獻(xiàn)率以特征 值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，共提取出4個(gè)主成分，得到主成分的累積方差貢獻(xiàn)率79.069%，故選取前4個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，它代表了16個(gè)成分量的79.069%的信息量，可較好地反映總體成分信息。在4個(gè)主成分中，特征值較大的是主成分1，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)52.903%，是信息量較全面的指標(biāo)。從表4中可以看出根據(jù)因子載荷矩陣，在主成分1中，除了5、14、1、9、7號(hào)色譜峰以外，其余11個(gè)成分的因子載荷非常接近，均是主成分1的重要貢獻(xiàn)成分，說明主成分1很好地表達(dá)了TSD多成分物質(zhì)群。

用計(jì)算得到的主成分對(duì)29個(gè)樣品進(jìn)行得分計(jì)算，將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，得到主成分表達(dá)式，再以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重得到主成分綜合模型，根據(jù)主成分綜合模型計(jì)算29個(gè)樣品的主成分得分及綜合得分值，如表5所示。綜合得分結(jié)果顯示，15號(hào)工藝為最佳工藝。

1-地黃苷D 9-苦杏仁苷 11-羥基紅花黃色素A 12-芍藥苷 13-阿魏酸 15-藁本內(nèi)酯

表2 不同煎煮工藝TSD樣品色譜峰峰面積

2.4 TSD多成分含量測(cè)定評(píng)價(jià)研究

2.4.1 色譜條件 按“2.3.1”項(xiàng)下描述色譜條件，分別在210 nm（地黃苷D和苦杏仁苷）、230 nm（芍藥苷）、328 nm（阿魏酸和藁本內(nèi)酯）、403 nm（羥基紅花黃色素A）波長(zhǎng)下檢測(cè)。

2.4.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，6種成分可達(dá)基線分離，各吸收峰的理論塔板數(shù)均不低于5000，分離度大于1.5，色譜圖見圖3。

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，混合定容至10 mL，制備得到混合對(duì)照品溶液母液，用甲醇通過2倍稀釋法分別稀釋2、4、8、16、32倍，制得各質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)控濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)（）和線性范圍分別為芍藥苷＝0.416 9＋0.410 5，＝0.999 8，線性范圍9.871 9～315.900 0 μg/mL；地黃苷D＝0.055 3－0.013 1，＝0.993 8，線性范圍1.573 4～50.350 0 μg/mL；阿魏酸＝1.056 4－0.851 5，＝0.999 1，線性范圍0.820 3～26.250 0 μg/mL；羥基紅花黃色素A＝0.566 1＋0.342 3，＝0.999 5，線性范圍1.765 6～56.500 0 μg/mL；苦杏仁苷＝0.426 9＋0.051 7，＝0.999 9，線性范圍4.021 9～128.700 0 μg/mL；藁本內(nèi)酯＝0.530＋0.011 3，＝0.999 7，線性范圍1.562 5～50.000 0 μg/mL。

表3 主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

*提取平方和載入的主成分

*select the principal component loaded by the sum of squares

圖2 公共因子碎石圖

2.4.4 精密度試驗(yàn) 將配制得到的混合對(duì)照品母液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各組分色譜峰峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為3.56%、0.79%、1.04%、0.60%、1.74%、1.33%，表明儀器精密度良好。

表4 初始因子載荷矩陣

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將試驗(yàn)號(hào)1制備的同一供試品溶液，室溫放置，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄各組分色譜峰峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為3.08%、1.03%、1.00%、1.86%、3.66%、3.96%，表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按試驗(yàn)號(hào)1的制備方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各組分色譜峰峰面積，計(jì)算其質(zhì)量濃度的RSD。結(jié)果地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度的RSD分別為3.17%、1.62%、1.02%、2.97%、1.40%、4.53%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 按試驗(yàn)號(hào)1的制備方法平行制備6份供試品溶液，每份精密量取1 mL，分別按樣品中各成分含量的100%水平加入地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯6種對(duì)照品，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算6種成分的加樣回收率。結(jié)果地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為99.0%、99.2%、98.5%、98.8%、98.6%、99.2%，RSD分別為0.94%、0.67%、1.40%、0.72%、1.05%、0.74%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表5 主成分綜合得分排序

1-地黃苷D 9-苦杏仁苷 12-芍藥苷 15-藁本內(nèi)酯 13-阿魏酸 11-羥基紅花黃色素A

2.4.8 多指標(biāo)含量測(cè)定評(píng)價(jià)結(jié)果 計(jì)算各指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果，賦予6個(gè)關(guān)鍵質(zhì)控成分相同權(quán)重（6個(gè)成分均代表了6味藥的核心關(guān)鍵成分，故賦予了相同的權(quán)重），1～6分別代表地黃苷D、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯。綜合評(píng)分＝(1/max＋2/max＋3/max＋4/max＋5/max＋6/max)/6進(jìn)行評(píng)價(jià)，如表6所示。綜合得分結(jié)果顯示，15號(hào)工藝為最佳工藝，與指紋圖譜綜合評(píng)分結(jié)果相同，說明這6種關(guān)鍵質(zhì)控成分可較好地代表TSD質(zhì)量概貌。

2.5 BBD-RSM回歸模型的建立及方差分析

采用Design Expert 8.05軟件，通過響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。分別對(duì)各因素水平進(jìn)行多元線性和非線性回歸，建立各指標(biāo)綜合評(píng)分（）對(duì)4個(gè)因素（加水量A、浸泡時(shí)間B、煎煮時(shí)間C、煎煮次數(shù)D）的2次回歸模型方程＝4.32＋0.46 A－0.06 B－0.20 C＋0.92 D－0.19 AB＋0.01 AC＋0.06 AD－0.03 BC－0.2 BD－0.05 CD－0.16 A2－0.05 B2－0.22 C2－0.23 D2。相關(guān)系數(shù)＝0.947 4，校正系數(shù)0.894 8，說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表6 TSD中6種指標(biāo)成分含量測(cè)定綜合評(píng)分結(jié)果

方差分析結(jié)果見表7，自變量1次項(xiàng)C，2次項(xiàng)BD、C2、D2顯著（＜0.05）；自變量1次項(xiàng)A、D極顯著（＜0.01），表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)榧逯蟠螖?shù)（D）＞加水量（A）＞煎煮時(shí)間（C）＞浸泡時(shí)間（B）。失擬項(xiàng)值為0.223 5＞0.05，對(duì)模型有利，說明無失擬因素存在。根據(jù)軟件擬合得到2次回歸方程等高線及響應(yīng)面圖，評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，來確定最佳煎煮工藝參數(shù)。通過等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用強(qiáng)，圓形則交互作用較弱，結(jié)果見圖4。根據(jù)模型擬合結(jié)果，加水量9.90倍、浸泡時(shí)間0.58 h、煎煮時(shí)間1.19 h、煎煮次數(shù)1.60次。結(jié)合研究過程中基于指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別得到的最佳工藝為加10倍量水、浸泡0.5 h、每次煎煮1 h，最終確定TSD煎煮工藝為加10倍量水、浸泡0.5 h、煎煮2次、每次1 h。

表7 方差分析結(jié)果

圖4 4因素對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖

2.6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

選擇最佳煎煮工藝條件（加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h）進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，按上述方法進(jìn)行指紋圖譜和含量測(cè)定，計(jì)算得到指紋圖譜相似度分別為0.998、0.976、0.989，3批驗(yàn)證樣品含量測(cè)定的綜合得分如表8所示，分別為1.194、1.208、1.276，預(yù)測(cè)值為1.247，基本吻合，說明優(yōu)化得到的提取工藝條件較為穩(wěn)定，具備可行性。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

現(xiàn)代數(shù)理統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，開辟了用數(shù)學(xué)方法研究中藥復(fù)方成分變化規(guī)律的新領(lǐng)域，也為經(jīng)典名方工藝研究提供了強(qiáng)有力的工具。本課題基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)TSD提取工藝有較大影響。已開展的TSD煎煮工藝研究，多以單因素為其評(píng)價(jià)指標(biāo)，難以科學(xué)評(píng)價(jià)中藥復(fù)方的提取工藝，且得到的工藝參數(shù)與古籍記載相去甚遠(yuǎn)，遵古煎煮與現(xiàn)代工藝參數(shù)研究是經(jīng)典名方TSD復(fù)方制劑研發(fā)的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)。故本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)構(gòu)建中藥復(fù)方的指紋圖譜和指標(biāo)成分含量測(cè)定，從“定性和定量”2個(gè)角度綜合優(yōu)化中藥復(fù)方工藝過程和關(guān)鍵參數(shù)。

《中國(guó)藥典》2020年版中TSD中6味飲片明確規(guī)定了7個(gè)定量檢測(cè)指標(biāo)，羥基紅花黃色素A、山奈酚、苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷、梓醇和地黃苷D[16]。本實(shí)驗(yàn)基于課題組前期制備過程質(zhì)量標(biāo)志物的篩選[15]確定地黃苷D、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯6個(gè)成分作為指標(biāo)成分對(duì)TSD提取工藝進(jìn)行考察。地黃苷D為地黃中的主要活性成分，在《中國(guó)藥典》2020年版中首次被收載為含測(cè)成分，其具有補(bǔ)血、降低血糖[17]等藥理作用?？嘈尤受諡樘胰手械闹饕行С煞郑F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有心血管保護(hù)、抗胃潰瘍、抑制肝纖維化、免疫調(diào)節(jié)和抑制、抗腫瘤、止咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛等多方面的藥理活性[18]。羥基紅花黃色素A為紅花中的主要有效成分，且在紅花中含量較高，其具有抗心血管疾病、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)代謝等多種藥理作用。芍藥苷為白芍中的主要有效成分，其具有抗炎、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用。阿魏酸和藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸和川芎的主要活性成分，阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、調(diào)血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌、抗病毒、抗癌等藥理活性[19]；藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸和川芎揮發(fā)油中的主要成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)通過指紋圖譜和6個(gè)指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)分析得到的最佳工藝均為15號(hào)，表明6個(gè)指標(biāo)成分可大致代表TSD中的化學(xué)成分進(jìn)行工藝評(píng)價(jià)，也印證了課題組前期經(jīng)過研究預(yù)測(cè)得到的關(guān)鍵質(zhì)量質(zhì)控指標(biāo)科學(xué)合理，可以代表TSD的整體質(zhì)量，則可以作為TSD制備過程的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行量質(zhì)傳遞研究。通過指紋圖譜和指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)分析得到的最佳工藝均為15號(hào)（加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮時(shí)間1 h，煎煮3次），通過BBD-RSM對(duì)工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得到的最佳煎煮工藝為加水量9.90倍、浸泡時(shí)間0.58 h、煎煮時(shí)間1.19 h、煎煮次數(shù)1.60次。其中，煎煮次數(shù)是對(duì)質(zhì)量影響最大的因素，而在經(jīng)典名方研究過程中，煎煮次數(shù)也一直是備受爭(zhēng)議的問題，關(guān)鍵信息中公布TSD的服用方法為“水煎溫服”，沒有明確提及煎煮次數(shù)等參數(shù)，故課題組尊古宜今，綜合古籍對(duì)經(jīng)典名方的記載以及生產(chǎn)過程中對(duì)提取率的考慮，經(jīng)過BBD-RSM分析后，得到最優(yōu)工藝為煎煮1.60次，根據(jù)實(shí)際情況設(shè)定為2次。指紋圖譜和指標(biāo)成分含測(cè)篩選到的最佳煎煮工藝為3次，通過響應(yīng)面優(yōu)化明確2次可較大程度得將TSD中的有效成分進(jìn)行提取，在保證有效成分轉(zhuǎn)移率的同時(shí)還降低了成本。故基于可操作性選擇最佳工藝條件為，加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h。同時(shí)通過驗(yàn)證說明該提取工藝條件較為穩(wěn)定，具備可行性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 清·柴得華.婦科冰鑒 [M].于崢, 魏民, 楊威校注.北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2012: 5.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.關(guān)于發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批) 》的通知[EB/OL].( 2018-04-13) [2018-12-10].http://kjs.satcm.gov.cn/zhengcewenjian/2018-0416/7107.html.

[3] 成顏芬, 江華娟, 王琳, 等.經(jīng)典名方桃紅四物湯化學(xué)指紋圖譜及9種成分含量測(cè)定研究 [J].中草藥, 2020, 51(3): 653-661.

[4] 王升菊, 劉倩倩, 江華娟, 等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討桃紅四物湯治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效成分及作用機(jī)制 [J].中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(22): 5373-5382.

[5] Zuo C, Zhang Y, Wang J,.Deciphering the intervention mechanism of Taohong Siwu Decoction following the abnormal uterine bleeding rats based on serum metabolic profiles [J]., 2019, 170: 204-214.

[6] Zhang Y Y, Wang J C, Zuo C J,.Protective effect of Taohong siwu decoction on abnormal uterine bleeding induced by incomplete medical abortion in rats during early pregnancy [J]., 2018, 66(7): 708-713.

[7] 白晶, 陳黎明, 郭盛君, 等.桃紅四物湯+五苓散口服治療踝關(guān)節(jié)骨折術(shù)后腫脹25例 [J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志, 2021, 29(1): 59-61.

[8] 董少陽(yáng), 薛鵬宇, 張毅立, 等.桃紅四物湯加減對(duì)組合式外固定架治療股骨轉(zhuǎn)子間骨折患者凝血功能的影響 [J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2021, 36(1): 35-40.

[9] 謝夏陽(yáng).溫經(jīng)湯配合桃紅四物湯對(duì)月經(jīng)不調(diào)患者性激素水平的影響與安全性分析 [J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與健康研究電子雜志, 2021, 5(4): 122-124.

[10] 吳振起, 高暢, 楊璐, 等.基于層次分析法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選養(yǎng)陰清肺湯加味提取工藝 [J].中草藥, 2019, 50(12): 2862-2867.

[11] 楊凱, 馬子豪, 李源, 等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化白及多糖/聚乙烯醇濕法紡絲工藝及纖維性能評(píng)價(jià) [J].中草藥, 2020, 51(14): 3645-3654.

[12] 曾海蓉, 李婷娜, 冉倩, 等.基于熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桂枝芍藥知母顆粒復(fù)方提取工藝 [J].中草藥, 2020, 51(1): 84-90.

[13] 張鐵軍, 劉昌孝.新形勢(shì)下中藥新藥研發(fā)的思路與策略 [J].中草藥, 2021, 52(1): 1-8.

[14] 聶欣, 成顏芬, 王琳, 等.桃紅四物湯化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(4): 226-234.

[15] 江華娟, 李敏敏, 何瑤, 等.基于HPLC指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別的經(jīng)典名方桃紅四物湯制備過程質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [J].中草藥, 2021, 52(4): 1000-1010.

[16] 中國(guó)藥典[S].一部.2020: 91-339.

[17] 謝彩俠, 李雅靜, 張苗, 等.懷地黃中地黃苷A, 地黃苷D及益母草苷含量快速分析方法的建立 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(6): 47-54.

[18] 李露, 戴婷, 李小龍, 等.苦杏仁苷藥理作用的研究進(jìn)展 [J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2016, 37(1): 63-66.

[19] 張欣, 高增平.阿魏酸的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2020, 22(1): 138-147.

[20] Xie Q X, Zhang L L, Xie L,.-ligustilide: A review of its pharmacokinetics and pharmacology [J]., 2020, 34(8): 1966-1991.

[21] 何樹苗, 陳元堃, 曾奧, 等.藁本內(nèi)酯藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展 [J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 37(2): 152-156.

Optimization of decocting process of Taohong Siwu Decoction based on Box- Behnken response surface methodology and comprehensive quality evaluation

HE Yao1, JIANG Hua-juan1, CHENG Yan-fen1, DU Ke-qun1, LI Min-min1, YANG Qing-bo2, WANG Zhen- zhong3, 4, FU Chao-mei1, DUAN Yi2

1.State Key Laboratory of Southwest Characteristic Traditional Chinese Medicine Resources,College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2.Guizhou Yibai Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550001, China 3.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 4.State Key Laboratory of New-tech of Traditional Chinese Medicine Preparation Process, Lianyungang 222001, China

To optimize and scientifically evaluate of the decoction process of Taohong Siwu Decoction (桃紅四物湯, TSD) according to ancient law, so as to lay a foundation for the study of traditional Chinese medicine compound preparation of classical prescription.Using fingerprint profiles combined with multi-index quantitative determination as a comprehensive evaluation, Box-Behnken response surface design was used to optimize water consumption, soaking time, time of decoction, and frequency of decoction.Fingerprinting was performed on the SunFire-C18column (150 mm × 3.0 mm, 3.5 μm）with acetonitrile-0.5% phosphoric acid aqueous solution as mobile phase, flow rate was 0.2 mL/min, column temperature was 25 ℃, and detection wavelength was 230 nm.The HPLC fingerprint was established, and the comprehensive score of each test sample was calculated by principal component analysis of the chromatographic peaks.Furthermore, the content of the six quality control components was detected by UPLC multiwavelength detection, each sample comprehensive score was calculated, and decoction process was optimized by response surface methodology.The HPLC fingerprint of 29 test samples of TSD was established.A total of 16 chromatographic peaks were selected as the common peaks of the fingerprint and six ingredients were identified including rehmannioside D, amygdalin, paeoniflorin, ferulic acid, hydroxysafflor yellow A, ligustilide with good linear relation.The result of comprehensive score showed that process number 15 was the best process.According to the regression model fitting, the optimal process was obtained as follows: adding 9.90 times of water, soaking time 0.58 h, decocting time 1.19 h and decocting times 1.60 times.Finally, the decocting process of TSD was determined as follows: adding 10 times of water, soaking for 0.5 h, decocting twice, 1 h for each time.Fingerprint quality profile combined with key quality control components can be used to evaluate the quality of the preparation process of TSD.The optimal decoction process is stable and feasible, which can be used for further research and development of the classical prescription TSD.

Taohong Siwu Decoction; classical prescription; decoction technology; fingerprints; Box-Behnken design-response surface methodology; comprehensive quality evaluation; principal component analysis; HPLC; UPLC;rehmannioside D; amygdalin; hydroxysafflor yellow A; paeoniflorin; ferulic acid; ligustilide

R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 6845 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.009

2021-06-16

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFS0256）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020YFS0567）；中藥制劑過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目（SKL2020Z0305）

何 瑤，副教授，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: 20660306@qq.com

通信作者：傅超美，教授，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: chaomeifu@126.com

段 毅，主管中藥師，主要從事藥學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: 121928757@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]