與SARS-CoV有交叉免疫反應(yīng)的SARS-CoV-2 S蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

高競溪 高珂星 魯非 紀(jì)鋒 郭志剛

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210046）

由SARS-CoV-2侵染機(jī)體引發(fā)的新型冠狀病毒肺 炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19） 具 有較為強(qiáng)烈的人際傳染能力［1-2］，新冠疫情總體呈現(xiàn)暴發(fā)性流行趨勢［3］，給中國乃至世界帶來了巨大損失。由于現(xiàn)階段預(yù)防措施及治療手段的不足，疫情難以控制，故疫苗和藥物的研制已成為全球關(guān)注的焦點。SARS-CoV-2為RNA病毒，多呈球狀，直徑在60 nm-140 nm之間，且表現(xiàn)出部分多形性，外周分布有獨特的尖峰結(jié)構(gòu)（9-12 nm），整體呈日冕狀［4］。SARS-CoV-2主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：棘突蛋白（spike protein，S）、核衣殼蛋白（nucleocapsid phosphoprotein，Np）、包膜蛋白（envelope protein，E）和膜蛋白（membrane protein，M）。其中 S蛋白是由S1和S2兩個亞基組成的三聚體Ⅰ類融合蛋白，主要起介導(dǎo)病毒與細(xì)胞附著（S1）和囊膜與細(xì)胞膜融合（S2）的作用［5］。與SARS-CoV相似，SARS-CoV-2通過S蛋白識別并結(jié)合人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II（human angiotensin converting enzyme 2，hACE2）進(jìn)而入侵機(jī)體［6-7］，由此推測S蛋白對SARS-CoV-2的入侵、致病起到一定的調(diào)節(jié)作用，具有較高的研究價值。

冠狀病毒是變異最快、最多樣化的病毒群之一，SARS-CoV-2作為其中的一員具有快速突變的潛能［8］，尋找其較為保守的區(qū)段，可以為研制具有相對廣譜性的抗病毒藥物和疫苗提供依據(jù)，對預(yù)防由冠狀病毒變異引發(fā)的新問題起到關(guān)鍵性作用。本研究構(gòu)建了基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹以期探究SARS-CoV-2與SARS-CoV S蛋白的同源性，同時為預(yù)測S蛋白未來的演化方向與速率提供信息。

雖然SARS-CoV-2與SARS-CoV在基因結(jié)構(gòu)和組成上存在較大差異［7］，但二者同屬于Sarbecovirus亞屬SARS病毒種具有較近的親緣關(guān)系。研究指出SARS-CoV-2 S蛋白的抗原決定簇與SARS-CoV S蛋白的抗原決定簇相似度較高［9-10］，已有研究表明，從SARS-CoV痊愈者體內(nèi)分離制備的SARS-CoV單克隆抗體S309可作為交叉中和SARS-CoV-2的抗體［11］，二者互相佐證提高了本研究的可行性。S蛋白作為一個整體，各個表位的狀態(tài)均有可能影響其結(jié)構(gòu)與功能?，F(xiàn)有研究多專注于S蛋白中結(jié)合功能性受體hACE2的抗原表位［12-13］，而其他表位的相關(guān)研究信息卻較少。由此，本研究分析了SARSCoV-2 S蛋白的氨基酸序列，并通過與SARS-CoV S蛋白氨基酸序列的比對確定了目標(biāo)區(qū)段，進(jìn)一步綜合預(yù)測出可能的通用B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位。旨在為研究病毒介導(dǎo)的識別、結(jié)合、內(nèi)吞［6］機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，尋找通用抗體的精確靶點，為表位疫苗提供設(shè)計方向。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取不同國家地區(qū)SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229E毒株的S蛋白氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2株S蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建 以多株不同冠狀病毒為研究對象（表1），采用MEGA5.05軟件中的Neighbor-joining法分析各毒株的S蛋白氨基酸序列并構(gòu)建基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，應(yīng)用MegAlign軟件分析不同冠狀病毒間的遺傳距離。

1.2.2 SARS-CoV-2與SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列對比及跨膜分析 采用MegAlign軟件對表1中的SARS-CoV-2與SARS-CoV毒株S蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析；另采用TMHMM Server在線軟件對SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株（WHU01）的S蛋白進(jìn)行跨膜分析。

表1 研究所用的冠狀病毒株Table 1 Coronavirus strains used in this study

1.2.3 Wuhan-Hu-1株S蛋白整體及目標(biāo)區(qū)段的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用Phyre2在線軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測Wuhan-Hu-1株S蛋白整體及目標(biāo)區(qū)段的三維結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用Chimera軟件模擬其三維立體結(jié)構(gòu)。

1.2.4 Wuhan-Hu-1株S蛋白目標(biāo)區(qū)段的B細(xì)胞抗原表位參數(shù)分析 以DNAStar軟件Protean模塊中的多種方法分別剖析Wuhan-Hu-1株S蛋白的目標(biāo)區(qū)段，步驟如下：首先對目標(biāo)區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)（Garnier-Robson法和Chou-Fasman法）、柔性區(qū)段（Karplus-Schulz法）、表面可能性（Emini法）進(jìn)行預(yù)測；然后分析目標(biāo)區(qū)段的親水性指數(shù)（Kyte-Doolittle法），再預(yù)測其抗原指數(shù)和抗原表位指數(shù)（分別用Jameson-Wolf法和Kolaskar-Tongaonkar法（http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input））；最后，參考S蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，在目標(biāo)區(qū)段內(nèi)綜合預(yù)測可與SARS-CoV發(fā)生交叉免疫反應(yīng)的SARSCoV-2 S蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

本研究以SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株（WHU01）S蛋白和其他不同國家地區(qū)的人類冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列為分析對象，采用Neighbor-joining法（步長1 000，boot-strap值＞60%）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果如圖1所示。MegAlign軟件分析指示：不同國家地區(qū)分離的SARS-CoV-2毒株S蛋白氨基酸序列存在極高相似性（99.9%-100%），Wuhan-Hu-1株S蛋白氨基酸序列與所列出的SARS-CoV參考株（QXC1、ExoN1、TC3、CHUKtc46NP、CHUKtc51L、CHUKtc55NS）S蛋白氨基酸序列的相似性為77.4%-77.5%， 與 MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63毒株的相似性分別為30.2%、28.3%-28.4%、21.4%-21.5%、20.3%。結(jié)果表明不同國家地區(qū)間的SARS-CoV-2毒株S蛋白氨基酸序列差異性很?。籗ARS-CoV-2與SARS-CoV毒株的S蛋白氨基酸序列相似度相較于其他4種冠狀病毒高兩倍以上，指示二者的S蛋白中可能存在相似甚至相同的B細(xì)胞抗原表位。

圖1 SARS-CoV-2及代表冠狀病毒的S蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of amino acid sequence of S protein in SARS-CoV-2 strain and other representative viruses of Coronavirus

2.2 目標(biāo)區(qū)段的選擇

分別以6個不同地區(qū)、不同時間取樣的毒株為樣本，進(jìn)行SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列比對，并對Wuhan-Hu-1株S蛋白進(jìn)行跨膜分析進(jìn)而選定目標(biāo)區(qū)段。序列比對如圖2所示，944-1 215區(qū)段相似度較高（95.6%），其中存在兩段完全一致的連續(xù)區(qū)段（944-1 054、1 151-1 215位），指示此區(qū)域很可能存在二者共同的抗原表位。圖3的S蛋白跨膜分析指示，1 237-1 273位氨基酸殘基處于囊膜內(nèi)側(cè)，1 214-1 236位氨基酸殘基處于跨膜區(qū)段，而1-1213位氨基酸殘基則大概率位于膜外，位于膜外的區(qū)段更可能作為優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位。綜合上述分析，本研究選取位于囊膜外且保守度最高的區(qū)段944-1 213（270aa），進(jìn)行抗原表位分析，如圖2紅色方框所示。

圖2 SARS-CoV-2 S蛋白與SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment of amino acid sequence of S protein in SARS-CoV-2 and SARS-CoV strain

圖3 Wuhan-Hu-1株S蛋白跨膜分析Fig.3 Transmembrane analysis of S protein in Wuhan-Hu-1 strain

2.3 Wuhan-Hu-1株S蛋白整體及目標(biāo)區(qū)段的結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線工具Phyre2預(yù)測Wuhan-Hu-1株S蛋白及目標(biāo)區(qū)段的三維結(jié)構(gòu)。由圖4-A可知，S蛋白整體呈現(xiàn)“Y”型，存在3個由β-折疊和α-螺旋組成的疏水核心。α-螺旋分布于S蛋白的局部區(qū)域，β-折疊多集中于蛋白內(nèi)部，起連接作用的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲則廣泛分布于蛋白的表面，由此推測S蛋白具有較強(qiáng)的可變性。目標(biāo)區(qū)段分析結(jié)果圖4-B顯示，氨基酸序列前端和末端都存在α-螺旋且前端更長，局部存在β-折疊，中部存在較多的無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，指示該區(qū)域的部分區(qū)段具備作為優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位所需的結(jié)構(gòu)特點。

圖4 Wuhan-Hu-1株S蛋白整體及目標(biāo)區(qū)段的結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Structure prediction of whole and target region of S protein in Wuhan-Hu-1 strain

2.4 Wuhan-Hu-1株S蛋白的抗原表位參數(shù)分析

柔性區(qū)段（Karplus-Schulz法）分析結(jié)果（圖5-A）顯示，Wuhan-Hu-1株S蛋白的944-1 213位氨基酸區(qū)域（目標(biāo)區(qū)段）中柔性區(qū)段超過52%，占比較多且呈分散分布（表2）。

親水性指數(shù)（Kyte-Doolittle法）分析（圖5-B）指示，目標(biāo)區(qū)段中具有親水性的區(qū)段呈均勻分布，其中靠近羧基端的氨基酸序列所跨區(qū)段最大、具有最高的親水性指數(shù)，表明該區(qū)段極有可能作為病毒的抗原表位。

表面可能性（Emini法）分析（圖5-C）表明，目標(biāo)區(qū)段整體的表面可能性較高，其中1 146-1 162氨基酸區(qū)段表面可能性指數(shù)最高且跨區(qū)最長（表2），指示該區(qū)段具有作為B細(xì)胞抗原表位的潛力。

Jameson-Wolf法預(yù)測結(jié)果（圖5-D）顯示，目標(biāo)區(qū)段中均勻分布有多個抗原指數(shù)偏高的區(qū)段，其中位于1 136-1 171位的氨基酸區(qū)域抗原指數(shù)最高可達(dá)3.00，該區(qū)域同時也是跨區(qū)最大的區(qū)段（表2），指示其大概率可作為B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

表2 Wuhan-Hu-1株S蛋白目標(biāo)區(qū)段的柔韌性、親水性、表面可能性和抗原指數(shù)Table 2 Flexibility regions, hydrophilicity, surface probability and antigenic index of S protein target region in Wuhan-Hu-1 strain

圖5 Wuhan-Hu-1株S蛋白目標(biāo)區(qū)段抗原表位參數(shù)分析Fig.5 Analysis of antigen epitope parameters in the target region of S protein in Wuhan-Hu-1 strain

Kolaskar-Tongaonkar法分析結(jié)果圖6顯示，目標(biāo)區(qū)段的抗原指數(shù)最小值為0.926，最大值為1.215，均值為1.040。

圖6 Wuhan-Hu-1株S蛋白目標(biāo)區(qū)段抗原表位指數(shù)分析Fig.6 Antigen epitope index analysis of the target region of S protein in Wuhan-Hu-1 strain

2.5 Wuhan-Hu-1株S蛋白目標(biāo)區(qū)段的B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果綜合分析

綜合目標(biāo)區(qū)段內(nèi)柔韌性、親水性、表面可能性、抗原性、抗原表位指數(shù)的預(yù)測結(jié)果，如果抗原指數(shù)≥ 1.040（均值），表面可能性指數(shù)≥ 1，親水性指數(shù)≥ 0，位于細(xì)胞膜外且其內(nèi)部或附近存在β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等柔性區(qū)段，同時占據(jù)不少于6個氨基酸殘基，則該區(qū)段最有可能作為目標(biāo)抗原表位。結(jié)合結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，本研究從目標(biāo)區(qū)段內(nèi)共篩選出符合以上條件的8個優(yōu)勢抗原表位區(qū)段，如表3所示，推測這些區(qū)段作為SARS-CoV-2 S蛋白B細(xì)胞抗原表位較其他區(qū)域更具優(yōu)勢，且其中的部分區(qū)段大概率能引起SARS-CoV-2與SARS-CoV的交叉免疫反應(yīng)。

表3 可與SARS-CoV發(fā)生交叉免疫反應(yīng)的SARS-CoV-2株S蛋白B細(xì)胞抗原表位Table 3 B cell epitopes of S protein in SARS-CoV-2 strain which can cross-immunize with SARS-CoV

3 討論

3.1 抗原表位的作用

抗原表位通常為位于抗原分子外表面上較松散、易扭曲的區(qū)段，是由6-15個氨基酸殘基、多糖殘基或核苷酸組成的具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的基團(tuán)［14］。抗原表位既是抗原與相應(yīng)受體結(jié)合時結(jié)構(gòu)和功能上必需的最小單位，也是免疫細(xì)胞與抗原特異性識別的關(guān)鍵分子，故抗原表位的存在可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并表達(dá)相應(yīng)抗體以保護(hù)機(jī)體。對于疫苗的制備，小分子蛋白更易做到快速、大量地表達(dá)，表位疫苗相較減毒疫苗能達(dá)到更高的安全性，故蛋白質(zhì)抗原表位的鑒定對多肽疫苗和新型藥物的研制具有重要意義［15］。

本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取了Wuhan-Hu-1株S蛋白的氨基酸序列（1 273 aa），空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，Wuhan-Hu-1株S蛋白整體呈現(xiàn)“Y”型，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等連接結(jié)構(gòu)多廣泛散布于蛋白表面，即S蛋白的可變性較強(qiáng)，為其與hACE2的特異性結(jié)合奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3.2 準(zhǔn)確預(yù)測SARS-CoV-2株與SARS-CoV株S蛋白共同抗原表位的重要性

S蛋白分為S1和S2兩個功能亞基，前者含A/B/C/D四個核心區(qū)域并介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的附著［15］，后者高度保守且介導(dǎo)病毒的膜融合過程［16］。由于S蛋白在新冠病毒入侵機(jī)體的過程中發(fā)揮著不可替代的作用，自COVID-19暴發(fā)以來一直備受關(guān)注。日前，周強(qiáng)團(tuán)隊測定了SARS-CoV-2受體結(jié)合區(qū)與hACE2配合物的晶體結(jié)構(gòu)［13］，更加直觀地闡明了將S蛋白作為SARS-CoV-2疫苗、藥物設(shè)計靶標(biāo)的重要意義。

表位是剖析抗原的構(gòu)造、功能及其與抗體特異性反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ)，不同的生物大分子表位若存在相似的空間構(gòu)象，就可能與同一種抗體的互補決定區(qū)相契合，從而引發(fā)交叉反應(yīng)［17］。研究顯示，SARS-CoV-2毒株S蛋白的抗原決定簇與SARSCoV毒株存在較多相似之處［9-10］，加之其都通過S蛋白與hACE2結(jié)合入侵機(jī)體［6-7］，推測兩者的S蛋白存在較為保守的區(qū)段。本研究以不同地區(qū)、不同時間取樣的毒株為樣本構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，證實了兩者的S蛋白氨基酸序列相似性相比于其他4種冠狀病毒最高（77.5%）且具有共同起源和相似的感染模式，與大多數(shù)其它研究結(jié)果一致。作為單鏈RNA病毒，經(jīng)過較為長期的演化，冠狀病毒的變異可能會使疫苗或單抗的效果受到影響。目前對于SARSCoV-2在何時、何處發(fā)生基因突變難以預(yù)測。但基于病毒生存、增殖的需要，重要基因區(qū)段如對病毒細(xì)胞嗜性的改變起到?jīng)Q定性作用的S基因［18-19］等即使發(fā)生突變也難以保留。本研究的目標(biāo)區(qū)段位于SARS-CoV-2和SARS-CoV均較為保守的S蛋白區(qū)段，隨機(jī)突變在本研究目標(biāo)基因序列中積累的可能性較小［20］，因此針對S蛋白抗原表位設(shè)計的疫苗和藥物研發(fā)在短期內(nèi)受SARS-CoV-2變異影響的風(fēng)險不大。對于SARS-CoV-2 S蛋白而言，現(xiàn)有研究尚未檢測到其表位的突變，將這些表位作為抗體設(shè)計的靶標(biāo)可能在一定程度上保護(hù)機(jī)體免受SARS-CoV-2的侵染。SARS-CoV-2感染人類細(xì)胞的機(jī)制復(fù)雜，在未識別宿主細(xì)胞時S蛋白的存在形式為亞穩(wěn)態(tài)的預(yù)融合構(gòu)象；S1亞單位與宿主受體識別并結(jié)合后，融合前三聚體的亞穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)被打破，S1亞單位脫離；同時S2亞單位轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾髽?gòu)象穩(wěn)定存在，進(jìn)而介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合以致病毒入侵機(jī)體［16，22］。目前，位于S1亞基的N端結(jié)合結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合位點廣受關(guān)注，與其相鄰的S2亞基主要負(fù)責(zé)病毒與細(xì)胞膜的融合，對病毒的結(jié)合能力也具有重要意義［12］。此前姜世勃等［22］研制出一種針對人冠狀病毒S2亞基中HR1結(jié)構(gòu)域的泛冠狀病毒融合抑制劑，這都指示未來的研究可通過靶向S2亞基較保守表位的中和抗體來抑制病毒的侵染，從而起到預(yù)防作用。以位于病毒表面S2亞基的抗原為研究對象，深入研究非受體結(jié)合域抗原表位，并檢驗其是否能在體內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用，對于進(jìn)一步了解交叉免疫反應(yīng)的機(jī)制具有重要意義。

本研究通過序列比對，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與SARS-CoV毒株S蛋白囊膜外存在一高度保守區(qū)段944-1 213（270aa），故對該區(qū)段進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位多參數(shù)綜合預(yù)測。

3.3 抗原表位與多種影響因素之間的關(guān)系

Hopp和Woods共同開創(chuàng)的親水性參數(shù)預(yù)測法為抗原表位的研究奠定了基礎(chǔ)［23］，此后科研人員又相繼發(fā)表了多種參數(shù)和算法，豐富并發(fā)展了B細(xì)胞抗原表位的相關(guān)研究。先前的預(yù)測結(jié)果指示，單一參數(shù)方案并不能準(zhǔn)確預(yù)測抗原表位，提示此后研究應(yīng)綜合考慮多種參數(shù)方案，尤以可能性方案（hydrophilicity）、可塑性方案（flexibility）、抗原性方案（antigenicity）及二級結(jié)構(gòu)（secondary structure）預(yù)測最為重要［24-25］。

為適應(yīng)與抗體結(jié)合時構(gòu)象的改變，B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位應(yīng)兼有靈活移動性、較好柔韌性以及位于蛋白質(zhì)表面等特點。本研究分析了Wuhan-Hu-1株S蛋白的氨基酸序列（1 273aa），參照與SARS-CoV株S蛋白氨基酸序列比對結(jié)果并佐以跨膜分析，選定研究的目標(biāo)區(qū)段為944-1 213位氨基酸區(qū)段（270 aa）；結(jié)合多種參數(shù)的預(yù)測結(jié)果，對目標(biāo)區(qū)段B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了綜合性分析，最終篩選出8個SARS-CoV-2與SARS-CoV潛在共用的B細(xì)胞抗原表位氨基酸區(qū)段：959-966、973-979、1 003-1 011、1 030-1 037、1 057-1 070、1 079-1 085、1 123-1 132、1 174-1 179。

3.4 共享表位疫苗的重要性與安全性

縱觀冠狀病毒的疫情發(fā)展史，冠狀病毒在不可預(yù)測的時間反復(fù)出現(xiàn)并造成了嚴(yán)重影響［26］，通用冠狀病毒抗體、疫苗的生產(chǎn)或許可以填補特異性防治手段的缺位，助力解決由冠狀病毒帶來的不確定性隱患。對于抗體及疫苗的研制，由Fc或補體系統(tǒng)介導(dǎo)產(chǎn)生的抗體依賴增強(qiáng)（antibody dependent enhancement，ADE）現(xiàn)象廣受關(guān)注。體外研究發(fā)現(xiàn)一種SARS-CoV抗體，可影響其S蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致已被抗體結(jié)合的病毒仍具有結(jié)合宿主細(xì)胞的能力，甚至擁有Fc受體的免疫細(xì)胞更易被感染［27］。由此可見，ADE現(xiàn)象不僅會在兩次感染同一病毒不同毒株時產(chǎn)生，即使是初次感染若采用不適當(dāng)?shù)目贵w治療也有導(dǎo)致ADE現(xiàn)象產(chǎn)生的風(fēng)險。雖然目前體內(nèi)實驗還沒有證據(jù)表明新冠抗體會引發(fā)ADE現(xiàn)象，但鑒于通用抗體的特殊性，更需警惕ADE現(xiàn)象的發(fā)生以確?？贵w或疫苗的安全可靠性。SARS-CoV-2在9個月的擴(kuò)散與變異中已產(chǎn)生兩種亞型，這要求研發(fā)人員充分考慮兩種病毒的各亞型并加強(qiáng)臨床前研究。

未來表位疫苗的研制，還需解決短肽的設(shè)計、高效表達(dá)并提純可溶性高活性抗原的方法等問題。2020年6月2日發(fā)表的專利顯示，利用大腸桿菌制備參考n-s優(yōu)勢表位的融合蛋白可用于患者的輔助診斷，在新型冠狀病毒總抗體檢測中靈敏度和特異性均為100%［28］。由此可見通過大腸桿菌表達(dá)的抗原表位短肽仍具有免疫原性，為表位疫苗的研制提供了信心。無論是抗體還是疫苗，進(jìn)入臨床使用前均需要充分的動物實驗及長期的臨床實驗來驗證其是否能夠達(dá)到通用疫苗的療效及其安全性。

對于本研究的應(yīng)用價值，相較于通過單細(xì)胞測序技術(shù)以及高通量抗體分離與篩選技術(shù)從血漿中分離抗體，利用生物信息學(xué)科學(xué)地預(yù)測抗原表位并由此篩選構(gòu)建相應(yīng)抗體更具針對性和普適性。從本研究的角度出發(fā)，生產(chǎn)通用抗體若依靠從治愈者體內(nèi)篩選得到，鑒于抗體產(chǎn)生的隨機(jī)性，恰好篩選出所需抗體的可能性極低，而通過預(yù)測區(qū)段并研制相應(yīng)抗體效率更高。同時實驗驗證出具有抗原性的短肽也可以為表位疫苗的設(shè)計提供信息。目前，人類對病毒蛋白表位的認(rèn)知尚處于初級階段，較為保守的S2亞基表位被結(jié)合是否會影響病毒的侵染、致病能力尚待考究，通用表位疫苗的研制及其安全性有待驗證。

4 結(jié)論

本研究通過SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白序列比對和跨膜分析得到了二者高度保守的區(qū)段（944-1 213 aa），并結(jié)合親水性指數(shù)、柔性區(qū)段、蛋白質(zhì)表面可能性和抗原指數(shù)等參數(shù)，篩選出了8個SARS-CoV-2與SARS-CoV潛在共用的B細(xì)胞抗原表位氨基酸區(qū)段：959-966、973-979、1 003-1 011、1 030-1 037、1 057-1 070、1 079-1 085、1 123-1 132、1 174-1 179。