WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中的作用

張桐 李智強(qiáng) 伍國(guó)強(qiáng)

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050）

植物在整個(gè)生命周期中會(huì)遇到各種各樣的生物和非生物脅迫，包括病蟲(chóng)害、干旱、高溫、低溫、高鹽堿和營(yíng)養(yǎng)缺失等［1-3］。為應(yīng)對(duì)這些不利環(huán)境，植物在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中從形態(tài)、生理、細(xì)胞以及分子水平上形成各種生存機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子是在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，可以與靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合。在已報(bào)道的植物基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾類(lèi)編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，能與順式作用元件W-box發(fā)生特異性相互作用。W-box主要存在于與抗病蟲(chóng)害、干旱、低溫、鹽堿等相關(guān)抗性基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其通過(guò)介導(dǎo)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控植物抗性。WRKY不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本文就WRKY的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分類(lèi)、調(diào)控方式、表達(dá)模式和近年來(lái)在植物響應(yīng)非生物和生物脅迫中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)研究方向加以展望。

1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)

WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其第一個(gè)成員發(fā)現(xiàn)于甘薯（Ipomoea batatas）中并命名為SPF1［4］。近年來(lái)，在許多植物中鑒定出WRKY家族成員。在不同物種中，WRKY成員數(shù)量有所差異，在油菜（Brassica napus）中發(fā)現(xiàn)了 343個(gè)成員［5］，而在馬尾松（Pinus massoniana）中僅鑒定到31個(gè)成員［6］（表 1）。

表1 不同物種WRKY家族成員Table 1 WRKY family members in various plant species

2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分類(lèi)及調(diào)控方式

WRKY家族的命名源于其最顯著的特征：WRKY結(jié)構(gòu)域，這是1個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的區(qū)域，在家族成員中高度保守。該結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)或2個(gè)N端的WRKYGQK七肽序列和1個(gè)C端的鋅指結(jié)構(gòu)。在一些植物中WRKYGQK的七肽序列也 可 以 被 WRKYGKK、WRKYGEK、WRKYGSK或WRKYDQK替代［52］。該結(jié)構(gòu)域能夠與啟動(dòng)子區(qū)W-box［（T）（T）TGAC（C/T）］特異結(jié)合，TGAC是W-box的核心保守序列，與WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶點(diǎn)的特異性直接相關(guān)，一次突變會(huì)顯著降低結(jié)合活性，甚至完全消失。盡管WRKY對(duì)W-box具有固定的結(jié)合偏好性，但其對(duì)該元件的某些類(lèi)型或排列的親和性可能會(huì)發(fā)生變化［53］。此外，它還是細(xì)胞表面受體和特化代謝基因之間的信號(hào)節(jié)點(diǎn)，也是網(wǎng)絡(luò)基序的核心組成部分；其拓?fù)涮卣魍?dú)立于詳細(xì)的反應(yīng)機(jī)制和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，因此可以很容易的調(diào)節(jié)，以產(chǎn)生預(yù)期的表達(dá)動(dòng)態(tài)和代謝輸出［54］。

依據(jù)WRKY七肽序列數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將WRKY蛋白分為3類(lèi)：I類(lèi)WRKY蛋白含有2個(gè)保守的WRKY七肽序列和1個(gè)C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）的鋅指結(jié)構(gòu)；II類(lèi)和III類(lèi)WRKY蛋白都只含有1個(gè)WRKY七肽序列，不同的是II類(lèi)蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，而III類(lèi)WRKY蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）。其中大部分家族成員屬于II類(lèi)WRKY蛋白，依據(jù)結(jié)構(gòu)特征將其進(jìn)一步分為IIa-IIe五個(gè)亞組。II、III類(lèi)家族成員的單個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域在序列上更接近于I類(lèi)蛋白的C端而不是N端，說(shuō)明C末端和單個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域在功能上是等同的，構(gòu)成了主要的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

大部分WRKY通過(guò)激活或抑制激素應(yīng)答基因來(lái)調(diào)控植物生長(zhǎng)和逆境脅迫。這些激素包括水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、乙烯（ethylene，ETH）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）等。Goyal等［41］分析了25個(gè)甘草（Glycyrrhiza glabra）GgWRKYs 在8種不同脅迫下的調(diào)控模式，有23個(gè)GgWRKYs對(duì)非生物脅迫有響應(yīng)，其中17個(gè)是激素誘導(dǎo)的。水稻（Oryza sativa）OsWRKY36通過(guò)抑制GA信號(hào)來(lái)降低株高和籽粒大小［55］。過(guò)量表達(dá)番茄（Solanum lycopersicum）SlWRKY23的轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）對(duì)ETH、JA和GA介導(dǎo)的根生長(zhǎng)表現(xiàn)出超敏感性，這種超敏感性與激素應(yīng)答基因（ERF1和ARF5）的表達(dá)量增高密切相關(guān)，表明SlWRKY23是通過(guò)調(diào)控激素應(yīng)答基因抑制擬南芥根的生長(zhǎng)［56］。小 麥（Triticum aestivum）TaWRKY42-B通 過(guò) 與JA合成基因AtLOX3及其同源基因TaLOX3相互作用來(lái)促進(jìn)葉片衰老［57］。橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）HbWRKY82調(diào)控多個(gè)激素信號(hào)基因（EIN3、ABF3和ABF4）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在ETH和ABA介導(dǎo)的葉片衰老和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，并通過(guò)ETH和活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號(hào)途徑參與植株再生過(guò)程［58］。Cui等［59］在油菜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的WRKY轉(zhuǎn)錄因子BnaWSR1。采用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀定量 PCR（chromatin immune precipitation-quantitative PCR，ChIP-qPCR）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，BnaWSR1直接與ICS1、Rboh 和SAG14的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，促進(jìn)SA和ROS的合成，從而加速葉片衰老。棉花（gossypium hirsutum）GhWRKY22通過(guò)調(diào)控JA抑制因子JAZ的表達(dá)來(lái)抑制花藥和花粉發(fā)育［60］。密羅木（Myrothamnus flabellifolia）MfWRKY17過(guò)量表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽和抗旱性；進(jìn)一步研究表明，MfWRKY17過(guò)量表達(dá)植株中的ABA響應(yīng)基因（NECD3和RAB18）顯著上調(diào)，說(shuō)明MfWRKY17在應(yīng)激反應(yīng)途徑中作為調(diào)控這些響應(yīng)基因的正調(diào)控因子［61］。

3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式

WRKY在植物體內(nèi)并非是組成型表達(dá)，而受各種環(huán)境因子（生物和非生物脅迫）的誘導(dǎo)［62］。Li等［16］分析了芝麻（Sesamum indicum）SiWRKYs在非生物脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)有33個(gè)SiWRKYs和26個(gè)SiWRKYs分別對(duì)澇漬和干旱脅迫響應(yīng)強(qiáng)烈。鹽脅迫下，獼猴桃（Actinidia chinensis）AcWRKY29、AcWRKY40、AcWRKY48、AcWRKY55、AcWRKY95和AcWRKY96的轉(zhuǎn)錄水平升高，而AcWRKY38的轉(zhuǎn)錄水平降低［22］。Jiang等［63］在毛果楊（Populus trichocarpa）PtrWRKYs的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)各種與應(yīng)激和防御反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)，有61個(gè)PtrWRKYs受到生物和非生物脅迫的誘導(dǎo)。在紅薯（Ipomoea batatas）中，IbWRKY2在葉中的表達(dá)水平顯著高于莖、毛根、須根和貯藏根［64］。在馬鞭草（Verbena bonariensis）中，VbWRKY32在葉中的轉(zhuǎn)錄水平高于莖和根［65］。在橡膠樹(shù)中，HbWRKY14在乳膠中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于樹(shù)皮、葉、花和根［66］。這些結(jié)果表明，WRKY表達(dá)不僅受各種環(huán)境因子的誘導(dǎo)，而且具有一定的組織特異性。

3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答非生物逆境脅迫中的作用

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遇到各種非生物脅迫，包括干旱、鹽堿、極端溫度、營(yíng)養(yǎng)缺失等，這些不利的環(huán)境條件會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在逆境條件下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)逆境基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆性［67］。

3.1.1 對(duì)干旱脅迫的響應(yīng) 干旱是限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量最主重的環(huán)境因素之一。長(zhǎng)期的干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物光合速率下降，CO2吸收減少，生物積累量和產(chǎn)量下降。Ma等［68］研究表明，過(guò)量表達(dá)大豆（Glycine max）GmWRKY16的轉(zhuǎn)基因擬南芥，經(jīng)干旱脅迫后復(fù)水處理，存活率超過(guò)75%，其脯氨酸（proline，Pro）含量和ABA積累量均高于野生型；而丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和葉片失水率均低于野生型。Wei等［69］研究表明，過(guò)量表達(dá)GmWRKY54的轉(zhuǎn)基因大豆耐旱性明顯增強(qiáng)；相反，GmWRKY54 的 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）植株對(duì)干旱更為敏感。值得注意的是，GmWRKY54并非在ABA和Ca2+信號(hào)通路中調(diào)節(jié)下游干旱相關(guān)基因的表達(dá)，而是在上游激活A(yù)BA受體和SnRK2激酶，從而增強(qiáng)大豆的抗旱性，并提高其在干旱條件下的產(chǎn)量。干旱脅迫下，過(guò)量表達(dá)AtWRKY57的轉(zhuǎn)基因水稻葉片失水率、細(xì)胞死亡率、MDA含量和相對(duì)電解質(zhì)滲漏率（electrolyte leakage，EL）均低于野生型，而Pro含量和ROS清除酶活性均高于野生型；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因植株中，干旱脅迫應(yīng)答基因（OsP5CS、OsNCED5、OsDREB1A、OsDREB2A、OsRab21和OsRab16D）的表達(dá)量均顯著提高［70］。在干旱脅迫下，過(guò)量表達(dá)杭白菊（Chrysanthemum morifolium）CmWRKY10的轉(zhuǎn)基因植株中ABA響應(yīng)基 因（DREB1A、DREB2A、CuZnSOD、NCED3A和NCED3B）的表達(dá)水平明顯上調(diào)；此外，ABA積累增強(qiáng)了ROS活性，使得過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的活性增加［71］。說(shuō)明CmWRKY10通過(guò)ABA信號(hào)通路調(diào)節(jié)杭白菊的抗旱能力。SlWRKY81通過(guò)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞H2O2介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉負(fù)向調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)［72］。9-順式類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-type carotenoid dioxygenases，NCED）是干旱脅迫下合成ABA的關(guān)鍵酶，NCED的過(guò)量表達(dá)可以增強(qiáng)ABA的積累，從而提高植物的抗旱能力。Liu等［73］利用酵母單雜交（yeast onehybrid，Y1H）、EMSA實(shí)驗(yàn)和瞬時(shí)表達(dá)分析等方法，證實(shí)杜梨（Pyrus betulaefolia）PbrWRKY53能夠結(jié)合PbrNCED1啟動(dòng)子區(qū)W-box元件，在干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮正調(diào)控作用。這些結(jié)果表明，WRKYs在植物應(yīng)答干旱脅迫中起著重要作用。

3.1.2 對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng) 土壤鹽堿化是世界范圍內(nèi)主要的非生物脅迫之一，而農(nóng)業(yè)用地的持續(xù)鹽堿化威脅著作物的產(chǎn)量，且在灌溉區(qū)尤為突出［74］。正常條件下，轉(zhuǎn)GmWRKY49的擬南芥與野生型植株相比生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異；但在高鹽（200 mmol/L NaCl）脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的成活率、蓮座直徑、EL和Pro含量均高于野生型［75］。地被菊（Dendranthema grandiflorum）DgWRKY4通過(guò)提高光合能力，促進(jìn)ROS清除系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)，維持膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)，上調(diào)鹽脅迫相關(guān)基因（DgDREB1A、DgDREB2A、DgCSD1和DgCSD2）的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)提高植物的耐鹽性［76］。然而，CmWRKY17作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，使得杭白菊對(duì)鹽脅迫更為敏感［77］。在高鹽條件下，過(guò)量表達(dá)葡萄（Vitis vinifera）VvWRKY30的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗氧化酶活性增強(qiáng)，ROS含量下降，說(shuō)明VvWRKY30通過(guò)調(diào)節(jié)ROS清除系統(tǒng)來(lái)提高葡萄的耐鹽性［78］。在NaCl處理下，GhWRKY34通過(guò)維持Na+/K+穩(wěn)態(tài)平衡，激活細(xì)胞內(nèi)鹽脅迫響應(yīng)基因（RD29A、ABF4、SOS1 和SOS2）等方式來(lái)適應(yīng)高鹽環(huán)境［79］。Lv等［80］采用 Y1H和瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦蕎（Fagopyrum tataricum）FtWRKY46可以特異性結(jié)合下游靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box。鹽脅迫后，外源表達(dá)FtWRKY46的轉(zhuǎn)基因植株的種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)、葉綠素和Pro含量均顯著高于野生型，而MDA含量則顯著低于野生型。此外，鹽脅迫相關(guān)蛋白（SOS1、SOS2、SOS3和NHX1）基因也被激活。在過(guò)量表達(dá)蘋(píng)果（Malus domestica）MdWRKY30的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中，鹽脅 迫 響 應(yīng) 基 因（ABI1、ABF3、RD22、RD29A、DREB1A、CAT1、SOD1和 VHP1）的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，其中ABI、ABF和RD29A被認(rèn)為是非生物脅迫下ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子［81］。說(shuō)明MdWRKY30可能通過(guò)ABA依賴的方式響應(yīng)鹽脅迫。這些結(jié)果表明，WRKYs通過(guò)調(diào)控下游鹽脅迫響應(yīng)基因來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽性。

3.1.3 對(duì)高溫脅迫的響應(yīng) 高溫對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量有抑制作用，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可提高農(nóng)作物對(duì)高溫的耐受性。在高溫40℃/33℃（晝/夜）環(huán)境下，AtWRKY30過(guò)量表達(dá)小麥后，轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)含水量、葉綠素、Pro、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及抗氧化酶（CAT、SOD、POX和APX）活性均顯著高于野生型，而MDA含量和H2O2水平明顯低于野生型。此外，轉(zhuǎn)基因植株中脅迫應(yīng)答基因（ERF5a、DREB1、DREB3、WRKY19、TIP2和AQP7）的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)［82］。TaWRKY33過(guò)量表達(dá)擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株的種子發(fā)芽率和根系生長(zhǎng)量均高于野生型；特別值得一提的是，轉(zhuǎn)基因株系在高溫處理后的存活率超過(guò)50%，而野生型的存活率不到30%，且與脅迫相關(guān)基因（ABA1、ABA2、ABI1、ABI5和RD29A）在轉(zhuǎn)基因植株中被激活［83］。Li等［84］以AtWRKY25過(guò)量表達(dá)植株和缺失突變體植株為材料，探究了AtWRKY25在高溫脅迫響應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)AtWRKY25的植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性，且與熱脅迫相關(guān)基因（HsfA2、HsfB1、HsfB2a和Hsp101）的表達(dá)量顯著上調(diào)；而缺失突變體在不同生長(zhǎng)階段對(duì)高溫表現(xiàn)出敏感性。Li等［85］研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，AtWRKY25/AtWRKY26和AtWRKY25/AtWRKY33雙重突變體及AtWRKY25/AtWRKY26/AtWRKY33三重突變體植株對(duì)熱脅迫的敏感性明顯增強(qiáng)；相反，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33過(guò)量表達(dá)植株耐熱能力顯著提高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33調(diào)控?zé)嵴T導(dǎo)的乙烯依賴反應(yīng)過(guò)程，并在這3個(gè)基因中表現(xiàn)出正向交叉調(diào)控作用。由此說(shuō)明，AtWRKYs正向調(diào)節(jié)熱應(yīng)激反應(yīng)的乙烯激活途徑，并在植物的耐熱性中發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。這些結(jié)果表明，WRKYs在植物應(yīng)答高溫脅迫中起著重要作用。

3.1.4 對(duì)低溫脅迫的響應(yīng) 低溫被認(rèn)為是限制作物產(chǎn)量主要的非生物脅迫之一。Li等［21］在毛竹（Phyllostachys edulis）中發(fā)現(xiàn)了121個(gè)PheWRKYs 成員，并對(duì)81個(gè)PheWRKYs在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)，有28個(gè)基因受到低溫脅迫的上調(diào)或下調(diào)。在紅梅（Prunus mume）PmWRKYs成員中，受到冷脅迫上調(diào)和下調(diào)2倍以上的基因數(shù)分別為6個(gè)和11個(gè)［33］。OsWRKY71過(guò)量表達(dá)水稻后，轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫（4℃以上）下的存活率、光合速率和干鮮重都明顯高于野生型植株［86］。Wang等［65］研究表明，在低溫脅迫下，VbWRKY32過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的Pro和可溶性糖含量及抗氧化酶活性顯著提高，而EL、MDA、H2O2、O2-積累量明顯降低；此外，轉(zhuǎn)基因植株中低溫響應(yīng)基因（VbSOD、VbPOD、VbCAT、VbAPX6、VbAMY3、VbBAM1 和VbP5CS）的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。Yokotani等［87］利用離子滲漏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低溫（4℃）條件下，過(guò)量表達(dá)OsWRKY76的轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的離子滲漏明顯低于野生型。說(shuō)明OsWRKY76可通過(guò)保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷而賦予水稻耐寒性。茄子（Solanum melongena）SmWRKY26和SmWRKY32可以正向調(diào)控冷脅迫響應(yīng)［51］。

3.1.5 對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺失的響應(yīng) 植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要各種營(yíng)養(yǎng)元素，包括大量元素和微量元素。而營(yíng)養(yǎng)虧缺會(huì)誘發(fā)植物葉片褪綠和生長(zhǎng)缺陷。迄今為止，已報(bào)道的與營(yíng)養(yǎng)元素脅迫相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子甚少，且以磷（phosphorus，P）、氮（nitrogen，N）、鐵（ferrum，F(xiàn)e）和鋅（zinc，Zn）為主。P是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物生命周期中扮演著多重功能，它還是關(guān)鍵分子（如ATP、核酸和磷脂）的組成成分［88］。在P虧缺條件下，過(guò)量表達(dá)海島棉（Gossypium barbadense）GbWRKY1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株 Pi饑餓癥狀減弱［89］。Dai等［90］研究表明，過(guò)量表達(dá)OsWRKY74顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Pi饑餓的耐受性；此外，還發(fā)現(xiàn)OsWRKY74過(guò)量表達(dá)植株對(duì)Fe、N等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)虧缺脅迫有著不同的反應(yīng)，與Pi脅迫類(lèi)似，F(xiàn)e脅迫顯著增強(qiáng)了OsWRKY74的表達(dá)，而N脅迫抑制了OsWRKY74的表達(dá)。在缺P(pán)條件下，AtWRKY45過(guò)量表達(dá)株系中磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（phosphate transporter1；1，PHT1；1）表達(dá)增強(qiáng)；而AtWRKY45-RNAi株系中PHT1；1的表達(dá)被輕微抑制［91］。由此說(shuō)明，AtWRKY45通過(guò)上調(diào)PHT1；1的表達(dá)而增強(qiáng)擬南芥對(duì)P虧缺的耐受性。此外，AtWRKY25和AtWRKY33的異源表達(dá)對(duì)Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP3和ZIP4的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性影響，但卻抑制了植物在Zn虧缺條件下的生長(zhǎng)缺陷［92］。上述結(jié)果說(shuō)明，WRKYs在植物響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)元素虧缺方面扮演著重要角色。

3.1.6 對(duì)其他非生物逆境脅迫的響應(yīng) 植物除了受干旱、鹽堿、高溫、低溫和營(yíng)養(yǎng)缺失脅迫外，還受到其他非生物脅迫，如離子脅迫、激素脅迫和損傷脅迫等。高濃度NH4+對(duì)植物組織有毒害作用，可導(dǎo)致多種反應(yīng)。Gao等［93］研究表明，在NH4+毒害下，AtWRKY23突變體中的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ammonium transporters 1；2，AMT1；2）被誘導(dǎo)，致使NH4+在根中大量積累，最終出現(xiàn)主根生長(zhǎng)緩慢、側(cè)根數(shù)量減少和葉片萎黃等現(xiàn)象。鋁（aluminum，Al）是地殼中含量最豐富的金屬之一，當(dāng)pH值低于5時(shí)，Al3+會(huì)抑制作物根系的伸長(zhǎng)、水分和養(yǎng)分的吸收。Chun等［94］研究表明，AtWRKY47的缺失突變可顯著降低植株對(duì)Al3+耐受性，而過(guò)量表達(dá)則可增強(qiáng)植株的耐鋁性。OsWRKY22通過(guò)與檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的W-box結(jié)合，促進(jìn)Al3+誘導(dǎo)檸檬酸分泌，從而提高水稻對(duì)Al3+脅迫的耐受性［95］。番茄SlWRKY42直接與Al3+耐受基因SlALMT9啟動(dòng)子區(qū)域的W-box結(jié)合，改變SlALMT9的表達(dá)水平，負(fù)向調(diào)控Al3+脅迫響應(yīng)［96］。AtWRKY13過(guò)量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)鎘（cadmium，Cd）積累量減少，從而增強(qiáng)對(duì)Cd的耐受性；而AtWRKY13缺失突變使Cd積累量增加和敏感性增強(qiáng)［97］。在黃麻（Corchorus capsularis）中，21個(gè)CcWRKYs對(duì)GA脅迫有響應(yīng)。通過(guò)順式作用元件（cis-acting element）分析表明，這些CcWRKYs啟動(dòng)子中有GARE-motif、P-box和TATC-box等與GA反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，可以提高黃麻的株高等性狀。由此說(shuō)明CcWRKYs參與GA脅迫下韌皮纖維損傷的發(fā)育［46］。Kang等［98］研究表明，過(guò)量表達(dá)HbWRKY83能顯著提高損傷反應(yīng)基因HbEIN3s和ROS清除系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)水平，對(duì)橡膠生產(chǎn)起到正向調(diào)控作用。

3.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物逆境脅迫中的作用

生物逆境脅迫包括病原菌的侵染和植食性昆蟲(chóng)的取食，為了應(yīng)對(duì)這些脅迫，植物進(jìn)化出了包括信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和生理生化反應(yīng)在內(nèi)的響應(yīng)機(jī)制，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在獲得性抗性中發(fā)揮了重要作用。

3.2.1 對(duì)病原菌脅迫的響應(yīng) WRKY已被證實(shí)在植物應(yīng)答病原菌中發(fā)揮重要作用。一些WRKY在植物對(duì)病原菌脅迫的防御中起正向調(diào)控作用。在菊花中，CmWRKY15的過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柄銹菌（Puccinia horiana）的耐受性，且內(nèi)源SA含量也增加；相反，CmWRKY15-RNAi植株增加了對(duì)柄銹菌的敏感性，內(nèi)源SA含量降低［99］。說(shuō)明CmWRKY15通過(guò)影響SA信號(hào)途徑在菊花對(duì)柄銹菌的抗性中發(fā)揮正向調(diào)控作用。過(guò)量表達(dá)MdWRKY100能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株對(duì)炭疽病菌（Colletotrichum）的抗性，而RNAi植株對(duì)炭疽病菌更敏感［100］。過(guò)量表達(dá)CaWRKY27的轉(zhuǎn)基因辣椒（Capsicum annuum）對(duì)青枯病（Ralstonia solanacearum）的抗性增強(qiáng)；相反，病毒誘導(dǎo)的CaWRKY27基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）增強(qiáng)了辣椒對(duì)青枯病的敏感性［101］。由此可見(jiàn)，CaWRKY27在辣椒對(duì)青枯病感染的抗性應(yīng)答中起正向調(diào)節(jié)作用。Wang 等［102］研究發(fā)現(xiàn)，芍藥（Paeonia lactiflora）PlWRKY65對(duì)細(xì)鏈孢霉（Alternaria tenuissima）感染具有正向調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)鏈孢霉感染時(shí)，該基因表達(dá)水平上調(diào)；而PlWRKY65-VIGS植株比野生型植株對(duì)細(xì)鏈孢霉感染更為敏感，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的感染癥狀。與空載體轉(zhuǎn)基因植株相比，沉默GmWRKY40的大豆毛狀根對(duì)大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）感染的敏感性增強(qiáng)［103］。Liu 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，月季（Rosa chinensis）RcWRKY41在灰霉病（Botrytis cinerea）侵染的早期到晚期其表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，而RcWRKY41沉默植株對(duì)灰霉病的抗性降低。

另外，也有些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)病原菌脅迫的防御中起負(fù)向調(diào)控作用。TaWRKY3是抗病抑制因子，SnRK1通過(guò)磷酸化和破壞TaWRKY3阻遏子的穩(wěn)定性提高小麥對(duì)白粉?。˙lumeria graminis）的免疫力［104］。過(guò)量表達(dá)OsWRKY76使得轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟?。∕agnaporthe oryzae）的敏感性增強(qiáng)［87］。Zheng 等［105］研 究 表 明，AtWRKY25 在 SA介導(dǎo)的紫丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）防御反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。過(guò)量表達(dá)AtWRKY25的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)紫丁香病菌的敏感性增強(qiáng)，病原菌感染后，AtWRKY25兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA插入突變體植株表現(xiàn)出較輕的病癥。相類(lèi)似的是，AtWRKY38或AtWRKY62的過(guò)量表達(dá)降低了擬南芥對(duì)紫丁香假單胞菌的抗性，而突變體對(duì)紫丁香假單胞菌的抗性增強(qiáng)［106］。可見(jiàn)AtWRKYs在擬南芥對(duì)紫丁香假單胞菌的抗性起負(fù)向調(diào)控作用。這些結(jié)果表明，WRKYs通過(guò)正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控方式參與植物對(duì)病原菌脅迫的防御。

3.2.2 對(duì)植食性昆蟲(chóng)脅迫的響應(yīng) 大多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在逆境環(huán)境或病原菌感染等相關(guān)刺激下被轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，而在蟲(chóng)害脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子報(bào)道較少。植物寄生線蟲(chóng)（nematodes）可以通過(guò)影響寄主基因的表達(dá)來(lái)建立取食位點(diǎn)，最終會(huì)影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育［107］。擬南芥被根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne）和胞囊線蟲(chóng)（Heterodera）感染后，AtWRKY23的表達(dá)迅速上調(diào)；而AtWRKY23基因敲除植株對(duì)胞囊線蟲(chóng)的敏感性下降［108］。此外，還發(fā)現(xiàn)AtWRKY23的表達(dá)是由植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的。表明生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因AtWRKY23參與植物和寄生線蟲(chóng)的相互作用。Skibbe等［109］研究發(fā)現(xiàn)，NaWRKY3和NaWRKY6在煙草（Nicotiana attenuata）對(duì)食草動(dòng)物的抗性中起著至關(guān)重要的作用，NaWRKY3和NaWRKY6-VIGS植株在溫室和自然界中更容易受到食草動(dòng)物的傷害。Atamian等［110］發(fā)現(xiàn)SlWRKY70-VIGS會(huì)增強(qiáng)番茄對(duì)蚜蟲(chóng)（Macrosiphum euphorbiae）的抗性，說(shuō)明SlWRKY70在番茄對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性中起負(fù)向調(diào)控作用。相反，AtWRKY22通過(guò)抑制SA信號(hào)通路增強(qiáng)擬南芥對(duì)蚜蟲(chóng)的敏感性［111］。胰蛋白酶抑制劑（kunitz trypsin inhibitor，KTIs）被認(rèn)為是對(duì)抗昆蟲(chóng)、食草動(dòng)物和病原體的天然防御蛋白。沉默NaKTI2使煙草上的斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲(chóng)具有更高的存活率。EMSA實(shí)驗(yàn)表明，NaWRKY3和NaWRKY6在體外可以直接與NaKTI2的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，說(shuō)明NaWRKYs可直接激活NaKTI2的轉(zhuǎn)錄，從而提高煙草的抗蟲(chóng)性［112］。

3.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用

WRKY轉(zhuǎn)錄因子除響應(yīng)生物和非生物脅迫外，還參與了植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和碳水化合物及次生代謝產(chǎn)物的合成［113］。OsWRKY29敲除和RNAi株系都增強(qiáng)了種子休眠，而過(guò)量表達(dá)株系的種子休眠減弱。ABA處理后，OsWRKY29敲除和RNAi株系比其過(guò)量表達(dá)株系表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性［114］。由此說(shuō)明，OsWRKY29作為ABA信號(hào)抑制因子來(lái)參與調(diào)控種子休眠。人參（Panax ginseng）PgWRKY6沉默顯著阻礙了胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，表明PgWRKY6可能促進(jìn)胚性愈傷組織的發(fā)育［115］。臘梅（Chimonanthus praecox）CpWRKY71參與了調(diào)控植株開(kāi)花和葉片衰老過(guò)程［116］。Hu等［117］通過(guò)EMSA和ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) MdWRKY72通過(guò)結(jié)合MdHY5啟動(dòng)子區(qū)的W-box元件間接或直接促進(jìn)MdMYB1的表達(dá)，從而增強(qiáng)花青素合成能力。Qu等［118］通過(guò)Y1H和EMSA分析發(fā)現(xiàn)，HbWRKY27正向調(diào)控天然橡膠關(guān)鍵生物合成基因HbFPS1的表達(dá)。板藍(lán)根（Isatis indigotica）Ii4CL3被證實(shí)是木脂素生物合成的核心基因；通過(guò)EMSA和雙熒光素酶（Dual-luciferase，Dual-LUC）實(shí)驗(yàn)表明，IiWRKY34通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子而激活I(lǐng)i4CL3的轉(zhuǎn)錄［119］。HbSRPP是一種含量豐富的橡膠顆粒相關(guān)蛋白，是橡膠樹(shù)合成天然橡膠的輔助因子。HbWRKY14可以與HbSRPP的啟動(dòng)子結(jié)合，并表現(xiàn)出抑制HbSRPP啟動(dòng)子的能力［66］。說(shuō)明HbWRKY14是橡膠合成的負(fù)調(diào)控因子。Hao等［120］通過(guò)EMSA、Y1H和Dual-LUC等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）OpWRKY2直接結(jié)合并激活喜樹(shù)堿核心通路基因OpTDC，作為喜樹(shù)堿生物合成的正向調(diào)節(jié)因子。二苯乙烯類(lèi)是重要的植物抗毒素，通過(guò)酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）和雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）實(shí)驗(yàn)表明，VqWRKY53通過(guò)調(diào)節(jié)VqMYB14和VqMYB15互作來(lái)增強(qiáng)二苯乙烯合成［121］。VviGT14是與酵母型葡萄漿果中糖基化單萜類(lèi)物質(zhì)積累相關(guān)的關(guān)鍵基因，VviWRKY40作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與VviGT14的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［122］。EMSA實(shí)驗(yàn)表明，PgWRKY4X與角鯊烯環(huán)氧化酶（squalene epoxidase，SE）啟動(dòng)子的W-box結(jié)合，而PgSE可以上調(diào)人參皂苷生物合成基因［123］。說(shuō)明PgWRKY4X可正向調(diào)控人參皂苷的生物合成。荷花（Nelumbo nucifera）NnWRKY40a和NnWRKY40b促進(jìn)芐基異喹啉類(lèi)生物堿（benzylisoquinoline alkaloid，BIA）的合成［29］。說(shuō)明WRKYs除響應(yīng)脅迫環(huán)境外，還在植物生長(zhǎng)發(fā)育，以及物質(zhì)代謝方面發(fā)揮著重要作用。

4 展望

WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要存在于高等植物中，且在植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫以及生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于對(duì)WRKYs的功能和調(diào)控機(jī)理我們認(rèn)識(shí)還很有限，諸如WRKYs在不同抗逆性作物品種中的表達(dá)模式是否存在差異；其通過(guò)調(diào)控哪些下游靶標(biāo)基因來(lái)維持作物體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡及對(duì)抗逆性有何影響等問(wèn)題，尚需深入研究。另外，WRKYs自調(diào)節(jié)模式以及涉及信號(hào)通路間的串?dāng)_和相互協(xié)調(diào)機(jī)制也有待于進(jìn)一步探究。隨著基因工程技術(shù)（過(guò)量表達(dá)、RNAi、miRNA和基因編輯等）的發(fā)展，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和作用機(jī)制將被闡明，可為農(nóng)作物的抗逆性遺傳改良提供理論支持與優(yōu)異基因資源。