增殖誘導(dǎo)配體蛋白的核酸適配體篩選與特異性研究

鄭芳芳 林俊生

（1. 泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，泉州 362011；2. 華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，泉州 362021）

APRIL是1998年由Hahne等［1］首先發(fā)現(xiàn)并克隆成功的腫瘤壞死因子家族新成員，其過表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、存活及腫瘤形成方面有獨特作用，體外研究顯示可溶性APRIL以劑量依賴方式促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞增殖，且在血清濃度很低的條件下也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速增殖［2］。因此，APRIL作為檢測腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤增殖的靶點具有可行性，潘超等［3］的研究也證實了這一點。

2013年，GAO等［4］研制了人源化抗APRIL抗體，可有效抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖，且具有降低免疫應(yīng)答的潛能。大量試驗研究也表明抗APRIL藥物在多種腫瘤治療方面具有極大的應(yīng)用前景［5-6］。截至目前已有多項APRIL藥物進(jìn)入臨床試驗階段。但APRIL藥物研發(fā)集中在抗體，抗體具有制備復(fù)雜、周期長、不易保存且價格昂貴等缺點，因此，探索一種低成本、制作簡便且易保存的APRIL藥物是十分必要的。

1990年，Szostak［7］和 Gold［8］兩 個 研 究 小組分別獨立地提出了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）體外篩選技術(shù)，通過SELEX技術(shù)篩選出的寡核苷酸，我們稱之為核酸適配體（aptamer），可與多種類型的靶分子特異性結(jié)合，具有分子量小、制備簡便、成本低、穩(wěn)定性高、低免疫原性、易于修飾等優(yōu)勢［9］，目前廣泛用于藥物輸送、生物技術(shù)和生化檢測方面，尤其在腫瘤標(biāo)志物、食品安全和環(huán)境污染物檢測上展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景［10-12］。本研究旨在利用磁珠-SELEX技術(shù)篩選出APRIL蛋白核酸適配體，并鑒定其親和力和特異性，為后續(xù)開展APRIL蛋白生物檢測方法的研究和腫瘤藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

80 nt隨機(jī)起始單鏈ssDNA文庫，兩端各為20 nt固定序列，中間為40 nt的隨機(jī)序列：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG（N40）CCTATGCGTGCTACCGTGAA、FAM-P1：5-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、Biotin-P1：5-biotin-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P1：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P2：5-TTCACGGTAGCACGCATAGG、Spacer18-P2：5-poly（dA20）-Spacer18-TTCACGGTAGCACG，相關(guān) DNA和文庫由上海生工合成。APRIL蛋白、BAFF蛋白購自南京金斯瑞公司，Dynabeads M-270 Carboxylic Aicd購 自Life Technologies Corporation公 司，F(xiàn)lash Hot Start MasterMix（Dye）購自康為公司，TritonX-100、礦物油購自sigma公司，EM90 oil購自ABIL公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司，Western印跡相關(guān)試劑購自上海碧云天公司，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 EDC/NHS介導(dǎo)的羧基和氨基偶聯(lián)反應(yīng)制備蛋白-磁珠復(fù)合物 PBS洗滌羧基磁珠4次，加入5 mg EDC和5 mg NHS，室溫反應(yīng)30 min，產(chǎn)物經(jīng)磁分離洗滌后，加入5 μg APRIL蛋白，室溫反應(yīng)1 h，磁分離洗滌，隨后加入1 mol/L乙醇胺封閉30 min，經(jīng)磁分離洗滌后所得磁珠即為APRIL-磁珠復(fù)合物，反篩所用BAFF-磁珠復(fù)合物制備方法同上。

1.2.2 乳濁液PCR（emulsion PCR，ePCR）結(jié)合長短鏈引物擴(kuò)增法制備次級文庫 取1 mL EM 90，25 μL Triton X-100和49 mL礦物油配制50 mL EM 90 oil，將文庫和EM 90 oil以1∶4（V/V）的比例混合，渦旋混勻，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得PCR產(chǎn)物，PCR 程序設(shè)置為：95℃，5 min；95℃，60 s，57℃，60 s，72℃，60 s，30個循環(huán)；72℃，5 min。將PCR產(chǎn)物高速離心破乳，收集到PCR產(chǎn)物后，加入正丁醇濃縮，棄去上層油層，取下層水相，加入等體積 2×尿素變性上樣緩沖液，95℃熱變性10 min，冰浴。PCR產(chǎn)物為不等長的雙鏈DNA，帶有Spacer18-P2的單鏈DNA比另一條鏈長20個堿基，8%尿素變性PAGE可將兩條鏈分開，取PCR產(chǎn)物上樣，300 V電泳30 min后，將膠置于紫外燈下觀察，帶有FAM-P1的鏈會發(fā)出熒光，將發(fā)出熒光的目的條帶切下，經(jīng)煮膠分離收集得到單鏈DNA，再用正丁醇濃縮，棄油層，取水相置于微量透析裝置中4℃透析過夜，獲得的透析產(chǎn)物即為次級文庫。

1.2.3 磁珠偶聯(lián)法篩選過程 將人工合成適配體文庫溶于200 μL結(jié)合緩沖液中，沸水煮沸5 min，冰浴10 min，室溫恢復(fù)10 min，加入到經(jīng)結(jié)合緩沖液洗滌4次的APRIL-磁珠復(fù)合物中，室溫孵育1 h，洗滌4次后，加入200 μL結(jié)合緩沖液，煮沸10 min以洗脫磁珠上的文庫，收集到的文庫經(jīng)ePCR大量擴(kuò)增，長短鏈法回收后得到次級文庫，所得次級文庫經(jīng)核酸定量后，投入下一輪篩選。

1.2.4 斑點印跡（dot blotting）監(jiān)測篩選進(jìn)程 取0.5 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）點至硝酸纖維素膜中，同時設(shè)立空白對照組；待硝酸纖維素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封閉液封閉1 h；將處理好的生物素標(biāo)記的次級文庫加到硝酸纖維素膜上，孵育2 h，Western洗滌液洗膜3次；加入1∶1 000稀釋的HRP 標(biāo)記的鏈酶親和素溶液，孵育1 h，洗滌液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min，觀察膜片顯色情況。

1.2.5 適配體的高通量測序和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用引物擴(kuò)增文庫（文庫和第4、5、6、7輪）后，送安徽昂普拓邁公司進(jìn)行高通量測序，用DNAMAN進(jìn)行同源性分析并用在線工具M(jìn)fold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）預(yù)測其可能的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.6 適配體親和性和特異性的鑒定

1.2.6.1 斑點印跡 取 1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）、1 μL BAFF 蛋 白（1 μg/μL）、1 μL BSA 蛋 白（1 μg/μL）點至硝酸纖維素膜中，同時設(shè)立空白對照組；待硝酸纖維素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封閉液封閉1 h；將處理好的生物素標(biāo)記的候選適配體加到硝酸纖維素膜上，孵育2 h，Western洗滌液洗膜3次；加入1∶1 000稀釋的HRP 標(biāo)記的鏈酶親和素溶液，孵育 1 h，洗滌液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min，觀察膜片顯色情況，與對照組比較分析適配體的特異性。另取4×1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）分別點至硝酸纖維素膜中，封 閉 后， 分 別 與 20 ng/μL、50 ng/μL、100 ng/μL、200 ng/μL生物素標(biāo)記的候選適配體孵育2 h，再與1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的鏈酶親和素溶液孵育1 h，TMB顯色后觀察膜片顯色情況，陽性表明序列具有與APRIL蛋白結(jié)合的能力，分析其親和性。

1.2.6.2 酶聯(lián)寡核苷酸吸附實驗（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA） 標(biāo)記生物素的后續(xù)適配體作為一抗，HRP標(biāo)記的鏈酶親和素作為二抗，測定適配體特異性：將APRIL蛋白、BAFF蛋白、BSA包被于酶標(biāo)板，設(shè)置空白對照孔，加入等量的包被液，4℃過夜；洗滌液漂洗3次，加入封閉液封閉2 h，洗滌液漂洗3次；加入變性好的一抗，孵育2 h，洗滌液漂洗3次；加入1∶2 000稀釋的二抗，孵育1 h，洗滌液漂洗3次；加入TMB顯色，讀取OD450值。類似的方法測定其親和力：將APRIL蛋白包被微孔板，與不同濃度（2.5、5、10、25、50、100、200 nmol/L）的一抗反應(yīng)，獲得OD450值。

1.2.6.3 qPCR法測平衡解離常數(shù)（Kd） 制備APRIL-磁珠復(fù)合物（方法同1.2.1），用等量的APRIL-磁珠復(fù)合物分別與不同濃度的候選適配體孵育30 min，熱洗脫10 min，磁分離，收集洗脫緩沖液作為qPCR的模板，用qPCR法測定洗脫緩沖液中適配體的拷貝數(shù)。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 上述Dot blotting、ELONA、qPCR實驗均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間多樣本均數(shù)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 SELEX篩選APRIL蛋白特異性適配體

采用磁珠偶聯(lián)靶標(biāo)-SELEX方法（圖1），經(jīng)過7輪篩選，從隨機(jī)ssDNA文庫中篩選APRIL蛋白的核酸適配體。先將隨機(jī)ssDNA文庫與偶聯(lián)有靶標(biāo)的磁珠孵育，去除大部分未能與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA，再引入修飾后的不等長引物進(jìn)行乳濁液PCR擴(kuò)增，通過尿素變性PAGE分離獲得ssDNA次級文庫。在篩選過程中，優(yōu)化篩選條件（表1），APRIL蛋白投入量逐漸減少，ssDNA與APRIL蛋白孵育時間逐漸減少，ssDNA投入量第一輪投入1 000 pmol，第二輪及之后調(diào)整為200 pmol。第1-3輪通過正向篩選，盡可能地富集能與APRIL蛋白特異性結(jié)合的適配體。為了增加篩選到的適配體的特異性，去除文庫中的非特異性結(jié)合序列，在第4-7輪中引入與APRIL具有高同源性的B細(xì)胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）蛋白進(jìn)行負(fù)向篩選。

圖1 適配體篩選過程Fig.1 Aptamer selection procedure

表1 表1 APRIL適配體篩選條件優(yōu)化Table 1 Optimization of the selection conditions of the APRIL aptamers

2.2 候選核酸適配體的序列分析和選擇

斑點印跡鑒定第2、4、6、7輪的ssDNA次級文庫對APRIL蛋白的富集情況，Image J軟件分析顯示，第2、4、6、7輪的結(jié)合率分別為15.6%、20.1%、40.6%、38.9%，可見，隨著篩選輪數(shù)增加，ssDNA次級文庫與APRIL蛋白的結(jié)合率逐步增加，而到第7輪結(jié)合率比第6輪略低，表明篩選輪數(shù)增加不能再提高序列富集程度，可以終止篩選過程。對初始文庫和第4、5、6、7輪次級文庫進(jìn)行高通量測序，獲得的序列總數(shù)分別為11.0340萬、16.0346萬、141.7842萬、203.2927萬、127.3063萬條，獲得的候選序列隨著篩選輪數(shù)增加，富集程度也一定程度的增加，選擇序列中8個頻率較高的核酸序列合成（表2）。在線軟件Mfold預(yù)測這8條候選序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示候選序列均具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且富含鳥嘌呤，其結(jié)合自由能（dG）如表2所示，Apt16的dG值最低，Apt3的dG值最高。自由能越低，表明適配體與靶分子的結(jié)合親和力越好，故優(yōu)先選擇Apt16作為候選核酸適配體之一，摒棄Apt3。莖環(huán)結(jié)構(gòu)通常被視為核酸適配體與靶分子的識別和結(jié)合部位，比較剩余6條候選序列，發(fā)現(xiàn)Apt2、Apt10莖環(huán)數(shù)目最多，進(jìn)一步比較Apt2和Apt10的鳥嘌呤含量（G%），發(fā)現(xiàn)Apt10的G%比Apt2高，說明Apt10比Apt2更易形成G-四聯(lián)體，故選擇Apt10作為另一候選核酸適配體。最終，本研究選擇Apt10和Apt16這2條序列作為候選核酸適配體序列（圖 2）。

圖2 預(yù)測候選適配體Apt10和Apt16結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted secondary structures of Apt10 and Apt16

表2 候選序列信息Table 2 Sequences of candidate aptamers

2.3 候選適配體Apt10和Apt16親和性和特異性分析

2.3.1 Dot-blotting分析適配體特異性和親和力 生物素標(biāo)記的候選適配體Apt10和Apt16與HRP標(biāo)記的鏈酶親和素作用，進(jìn)行特異性分析，結(jié)果顯示（圖3），Apt10和Apt16能夠特異性結(jié)合APRIL蛋白，TMB顯色，出現(xiàn)不同亮暗程度的斑點，且Apt16處的斑點比Apt10處淡，BAFF、BSA和結(jié)合緩沖液無斑點出現(xiàn)，說明適配體Apt10和Apt16與BAFF、BSA和結(jié)合緩沖液不結(jié)合或者極弱結(jié)合，表明Apt10和Apt16具有較高的特異性，Apt10比Apt16更高。

圖3 斑點印跡法檢測Apt10和Apt16的特異性Fig.3 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

候選適配體Apt10和Apt16進(jìn)行Dot-blotting親和力分析，結(jié)果顯示（圖4），隨著APRIL蛋白濃度降低，TMB顯色斑點逐漸變小變暗，當(dāng)APRIL蛋白濃度低于20 ng/μL時，TMB顯色后無斑點出現(xiàn)。

圖4 斑點印跡法檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.4 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

2.3.2 ELONA 測定適配體的特異性和親和力分析 候選適配體Apt10和Apt16 進(jìn)行ELONA特異性分析（圖5），結(jié)果表明Apt10和Apt16適配體均對APRIL蛋白顯著結(jié)合，對BAFF、BSA和結(jié)合緩沖液無反應(yīng)性，結(jié)果與Dot-blotting試驗一致，說明適配體Apt10和Apt16具有顯著特異性（P＜0.001）。候選適配體Apt10和Apt16進(jìn)行ELONA親和力分析（圖6），結(jié)果顯示吸光度隨生物素標(biāo)記的Apt10和Apt16濃度增加而增加，結(jié)果與Dot-blotting試驗一致。GraphPad Prism 5軟件非線性回歸擬合得解離常數(shù)Kd。Apt10的Kd值為（18.40±1.47）nmol/L，Apt16的Kd值為（14.61±1.33）nmol/L。

圖5 ELONA檢測Apt10和Apt16的特異性Fig.5 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

圖6 ELONA檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.6 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

2.3.3 qPCR法測解離常數(shù)（Kd） qPCR法測得洗脫緩沖液中適配體的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示（圖7），洗脫緩沖液中適配體的拷貝數(shù)隨著Apt10和Apt16濃度增加而增加，結(jié)果與Dot-blotting和ELONA結(jié)果一致，GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行非線性擬合，計算 得 到 Kd，Apt10的 Kd 值 為（365.90±155.60）nmol/L，Apt16的 Kd值 為（328.50±85.77）nmol/L（圖7）。qPCR法測得的Kd值與ELONA測得Kd值都在nmol/L范圍內(nèi)，表明篩選得到了親和力較強(qiáng)的APRIL適配體。

圖7 qPCR法檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.7 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by qPCR

3 討論

APRIL作為TNF受體家族的重要成員，在體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。APRIL可通過膜結(jié)合型及可溶型兩種形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［13］。抑制APRIL活性，可有效抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖，且具有降低免疫應(yīng)答的潛能［14-15］。目前尚無APRIL適配體藥物用于腫瘤的檢測與治療。

SELEX技術(shù)作為一種極其有用的分子生物學(xué)工具，經(jīng)過30年的發(fā)展，在臨床診斷和疾病治療中取得了巨大的成果，篩選方法也日臻成熟，改進(jìn)的SELEX 篩選方法層出不窮，但至今仍沒有固定的篩選標(biāo)準(zhǔn)［16］。結(jié)合實驗條件，本研究采用磁珠-SELEX法篩選。磁珠-SELEX是目前篩選最常用且成熟的方法，操作簡單，不需要特殊的分離設(shè)備，但篩選過程為開放性操作，在磁珠分離、單鏈制備等過程中，樣品與空氣接觸，只有幾十個堿基的分子易形成氣溶膠對后續(xù)的篩選造成污染，因此本研究引入乳濁液PCR，將水相加入油相中，形成“油包水”乳化劑，每個乳液都可作為一個微反應(yīng)器，獨立平行地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了模板間的污染，也減少了試劑和樣品的消耗［17-18］；篩選過程中單鏈的分離也至關(guān)重要，本研究采用長短鏈法分離單鏈，PCR擴(kuò)增形成的長度不同的單鏈變性后經(jīng)尿素PAGE電泳分離，方法直觀、效率高，且不影響適配體的結(jié)構(gòu)［19］；在篩選過程中，逐漸加大篩選壓力，如調(diào)整靶分子和次級文庫的投入量，縮短孵育時間等，以獲得與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)的寡核苷酸，第4、5、6、7輪增加反篩步驟，剔除非特異性序列和特異性較差序列，保證篩選的成功率。

篩選獲得的適配體能否更好地應(yīng)用于后續(xù)的研究，對其親和力和特異性進(jìn)行表征是關(guān)鍵，常見的表征方法有：納米金比色法、表面等離子體共振法、流式細(xì)胞儀、等溫滴定量熱法、石英晶體微天平法、SYBR Green I染料檢測法、qPCR法、Dot-blotting、ELONA等，表征的方法很多，這些的表征方法都有一定的局限性，不同的方法可能會得到不同的結(jié)果［20］，因此本研究聯(lián)合采用Dot-blotting、ELONA、qPCR進(jìn)行檢測，所得的結(jié)果是一致的，證明本研究篩選出了特異親和的APRIL適配體，ELONA與qPCR測得的Kd值不同，可能與檢測時對靶分子和適配體處理方法不同有關(guān)，如ELONA法出現(xiàn)靶分子與板非特異性結(jié)合，qPCR法洗脫過程中洗脫下非特異性結(jié)合序列。有研究顯示，使用分子模擬技術(shù)對獲得適配體進(jìn)行優(yōu)化，在保留其特異性的基礎(chǔ)上可以提高親和力和穩(wěn)定性［21］，因此，本課題后續(xù)將對核酸適配體Apt10進(jìn)行模擬優(yōu)化實驗，以進(jìn)一步研究適配體與靶分子的結(jié)合機(jī)制，優(yōu)化適配體，為探索APRIL蛋白檢測和拮抗劑研究提供靈敏特異的識別分子。

4 結(jié)論

本研究以APRIL蛋白為靶標(biāo)，采用磁珠-SELEX法進(jìn)行核酸適配體篩選，篩選過程中優(yōu)化篩選條件，經(jīng)過7輪篩選獲得富集度高的篩選產(chǎn)物，對產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，從測序結(jié)果中挑選出高親和力的APRIL適配體Apt10和Apt16，并對其親和力和特異性進(jìn)行表征，研究結(jié)果表明篩選獲得的Apt10和Apt16均能特異性結(jié)合APRIL，親和力均在nmol/L范圍內(nèi)，且Apt10優(yōu)于Apt16。