長莖葡萄蕨藻脅迫條件下RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選與驗證

李恬靜薇 鄒瀟瀟 朱軍 鮑時翔

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，秦皇島 066000；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，?？?571101）

熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）是一種能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增并對其進(jìn)行簡單的分析的方法，通過在反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，監(jiān)測PCR過程中的熒光信號強(qiáng)度來進(jìn)行分析。RT-qPCR具有靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單便捷等優(yōu)點［1-2］。RT-qPCR被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究中，然而RT-qPCR的準(zhǔn)確性受到許多因素的影響，包括RNA樣本質(zhì)量和提取方法的差異，以及反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率［3-5］，所得的結(jié)果需要進(jìn)行校準(zhǔn)后才具有生物學(xué)意義。

最常用的RT-qPCR校準(zhǔn)方法是使用一個或多個內(nèi)參基因。內(nèi)參基因作為參照的基因在各組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在研究基因的表達(dá)水平中常被用作數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)，以消除RT-qPCR不同樣品的差距和RT-qPCR操作中的誤差。最普遍使用的內(nèi)參基因為內(nèi)源性參照基因，也叫看家基因（持家基因），在生物體各細(xì)胞組織中都能表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物是維持細(xì)胞生命活動必須的蛋白質(zhì)，如肌動蛋白（Actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、微管蛋白基因（Tubulin）和核糖體蛋白（18S）等。但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，這些常用內(nèi)參基因在不同的物種，不同的組織細(xì)胞，不同的發(fā)育階段和實驗條件都存在較大的表達(dá)差異［6-7］。在擬南芥和雜交白楊不同組織中發(fā)現(xiàn)幾種常用內(nèi)參基因（TUB、Actin、UBQ和EF1a）的表達(dá)大多不穩(wěn)定，如果使用不適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會直接影響RT-qPCR的結(jié)果準(zhǔn)確性［8］。因此，在將內(nèi)參基因用于RT-qPCR校準(zhǔn)之前，需要對每個特定實驗系統(tǒng)的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)的評估。目前，已經(jīng)開發(fā)出了幾種用于內(nèi)參基因篩選的軟件如geNorm［9］、NormFinder［10］和 BestKeeper［11］等，可以在給定的實驗條件下從一組候選基因中篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

目前，已經(jīng)有關(guān)于一些物種內(nèi)參基因的篩選的報道，如百合［12］、芹菜［13］、石蒜［14］、西瓜［15］、馬鈴薯［6］、龍眼［16］等。類似的內(nèi)參基因的篩選在藻類中也有相關(guān)報道，如條斑紫菜［17］、壇紫菜［18］、赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）［19］、紅色赤潮藻（Akashiwo sanguinea）［20］等。然而目前還沒有用于蕨藻RT-qPCR分析的內(nèi)參基因篩選的報道。

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隸屬于綠藻門（Chlorophyta）蕨藻屬（Caulerpa），俗稱“海葡萄”，是一種單細(xì)胞多核生物，但根據(jù)其形態(tài)學(xué)差異，可以分為3個部分，直立枝，匍匐莖和假根。海葡萄作為一種在熱帶地區(qū)廣泛分布的大型經(jīng)濟(jì)綠藻，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值。首先其營養(yǎng)豐富，含有多種人體必需的氨基酸、維生素［21］、礦質(zhì)元素和不飽和脂肪酸［22］，且脂肪含量低，是潛在的高營養(yǎng)價值保健食品，在日本和東南亞都被視為高級食材。同時長莖葡萄蕨藻還可以改善海洋環(huán)境，為海洋動物提供餌料以及良好的棲息環(huán)境對提高生物多樣性和維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)具有重大意義［23］。目前在中國的東南沿海城市已經(jīng)開始了大規(guī)模的海葡萄養(yǎng)殖，但產(chǎn)量和品質(zhì)參差不齊，其中不適宜鹽度、溫度、光照都會對長莖葡萄蕨藻的生長產(chǎn)生影響［24］。為了更深入的分析長莖葡萄蕨藻的抗逆分子機(jī)制，可以使用RT-qPCR來分析其在脅迫條件下的基因表達(dá)情況。選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Φ贸鰷?zhǔn)確可靠的RT-qPCR分析結(jié)果至關(guān)重要。

本研究使用RT-qPCR對長莖葡萄蕨藻5個候選內(nèi)參基因：ClACT（肌動蛋白），ClGAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶），ClTUB（β微管蛋白），Cl18S（18S核糖體RNA）和ClEF1a（延伸因子1-alpha）在不同部位（匍匐莖和直立枝）和不同脅迫處理條件下表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并使用比較Ct值法，BestKeeper，geNorm和NormFinder軟件對5個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析和比較。此外分別使用分析得出的最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因來對熱激蛋白90（ClHSP90）和甾體傳感結(jié)構(gòu)域（ClSSD）的表達(dá)水平（已經(jīng)明確這兩個基因在脅迫條件下的表達(dá)情況）［25］進(jìn)行校準(zhǔn)來驗證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。為分析長莖葡萄蕨藻甚至蕨藻在脅迫條件下抗逆機(jī)制提供了重要理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的長莖葡萄蕨藻樣品全部來自本實驗室在海南省昌江長莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖基地。挑選生長狀態(tài)良好、藻體健壯的樣品，使用無菌海水清洗幾次后在光照培養(yǎng)箱中溫度27℃，光照40 μmol/（s · m2）， 鹽 度 30 ‰， 晝 夜 光 周 期 為12L∶12D暫養(yǎng)一周，然后進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 在潔凈的1 L燒杯中分別加入800 mL無菌海水，向其中投放適量潔凈藻體，分別置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理方法如表1所示，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，處理4 h后，分別取其匍匐莖和直立枝用紙吸干表面水分，迅速放于液氮中，置于-80℃冰箱中儲存。

表1 長莖葡萄蕨藻樣品處理方法Table 1 Sample processing method of C. lentillifera

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 稱取400-500 mg冷凍樣品，放入液氮中充分研磨，使用OMEGA 公 司 的 E.Z.N.A.Plant RNA Kit（R6827-01）提取各個長莖葡萄蕨藻樣品的總RNA，提取過程中使 用 OMEGA RNase-Free DNaseⅠ Set（E1091-01）處理消除基因組DNA污染。使用微量分光光度計（Nanodrop） 測量RNA 濃 度（ng/μL）、A260/280和A260/230。同時使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，來判斷所提取的長莖葡萄蕨藻樣品總RNA的總量和純度。隨后，使用Thermo公司的RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit（K1622），以所提取的長莖葡萄蕨藻樣品總RNA為模板（2 μg）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用已知基因引物進(jìn)行PCR，再對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，放置于-20℃冰箱中儲存。

1.2.3 候選內(nèi)參基因的篩選與引物設(shè)計 以NCBI中已有的內(nèi)參基因序列（如Actin、GAPDH、EF1a、TUB、18S等）為參考，利用本地BLAST搜索長莖葡萄蕨藻基因組（本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù)）的同源序列，從比對結(jié)果中篩選出每個基因得分最高且E-value最低的序列，作為各內(nèi)參基因的參考序列，分別命名為ClACT、Cl18S、ClGAPDH、ClEF1a和ClTUB。利用 PrimerPremier 5 軟件設(shè)計基因特異引物，克隆驗證各內(nèi)參基因的序列后，再以驗證無誤的序列為模板，設(shè)計RT-qPCR引物。以cDNA為模板，通過檢測普通PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物和分析產(chǎn)物的溶解曲線，檢測各引物的特異性。經(jīng)初步分析，5個候選內(nèi)參基因（表2）滿足RT-qPCR的實驗要求，故用作后續(xù)研究。

表2 長莖葡萄蕨藻5個候選內(nèi)參基因的RT-qPCR引物Table 2 RT-qPCR primers for five candidate internal reference genes of C. lentillifera

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及基因的擴(kuò)增效率 通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定每對引物的擴(kuò)增效率。將對照組樣品的cDNA進(jìn)行稀釋（ClACT、ClGAPDH、ClEF1a、ClTUB進(jìn)行5倍濃度稀釋，Cl18S由于與其他基因相比表達(dá)豐度較高所以進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋），各組樣品均稀釋5個濃度梯度。以不同稀釋倍數(shù)的樣品cDNA為模板，分別進(jìn)行RT-qPCR，以Ct值為Y軸，起始模板濃度為X軸（log5，Cl18S為log10）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算引物擴(kuò)增效率。計算公式如下：

1.2.5 候選內(nèi)參基因RT-qPCR分析 分別以不同樣品cDNA為模板，利用5對候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用TranStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141）配制RT-qPCR反應(yīng)體系，每對引物的每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

每個反應(yīng)體系中含有2 μL的稀釋cDNA模板和10 μL 的 2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix， 上游和下游引物各1 μL，6 μL的無菌水，最終體積為20 μL。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；然后從55℃緩慢升溫至95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)RT-qPCR的數(shù)據(jù)結(jié)果，使用EXCEL 2016和Origin 9.1比較各個樣品的Ct值并繪制Ct值分布箱型圖，再分別使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 三個內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件進(jìn)行5個基因片段在脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定性的分析。

1.2.7 內(nèi)參基因可靠性驗證 根據(jù)篩選結(jié)果，選擇篩選出來的最優(yōu)和最差的內(nèi)參基因做為標(biāo)準(zhǔn)化因子，分別對不同環(huán)境脅迫下（光照脅迫360 μmol/（s·m2）；溫 度 脅 迫 37℃ ；鹽 度 脅 迫40‰）熱激蛋白90（ClHSP90）和甾體傳感結(jié)構(gòu)域（ClSSD）基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。表3為ClHSP90和ClSSD引物序列。

表3 ClHSP90 和 ClSSD 引物序列Table 3 Primer sequences of ClHSP90 and ClSSD

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與質(zhì)量檢測

將提取出的總RNA樣品使用微量分光光度計進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：各樣品的總RNA濃度較高，峰圖優(yōu)良，A260/280在2.0左右，A260/230大于2.0。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果顯示：所提取的總RNA的28S和18S條帶清晰明亮，沒有其他雜帶。以上結(jié)果均說明所提取的RNA的濃度和純度較高，可以滿足后續(xù)實驗的要求。

圖1 長莖葡萄蕨藻總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from C. lentillifera

2.2 候選內(nèi)參基因的引物特異性和PCR效率

使用對照組的cDNA為模板對所設(shè)計的候選內(nèi)參基因和用于驗證的差異表達(dá)基因引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，條帶單一，明亮，沒有雜帶和引物二聚體現(xiàn)象。使用不同的樣品對各個候選內(nèi)參基因和用于驗證的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR，將得到的熔解曲線匯總（圖2），結(jié)果顯示每個基因各個樣品的溶解曲線峰值重合率較高，且只有單一的峰，在達(dá)到Tm值之前沒有雜峰出現(xiàn)。進(jìn)一步測序分析表明，所有測序擴(kuò)增片段均與引物設(shè)計所用序列相匹配。各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性R2均大于99%，擴(kuò)增效率均在90%-105%之間（表2）。

圖2 長莖葡萄蕨藻5個候選內(nèi)參基因和2個差異表達(dá)基因熔解曲線Fig. 2 Melting curve of 5 candidate internal parameters and two differential expression genes of C. lentillifera

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

如表4、5所示，本研究使用比較Ct值法、BestKeeper、geNorm、NormFinder軟件分析了5個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，包括不同實驗條件（溫度脅迫、鹽度脅迫和光照脅迫）以及不同組織部位（匍匐莖和直立枝）。BestKeeper可以計算出每個基因產(chǎn)生配對的相關(guān)系數(shù)（r）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，相關(guān)系數(shù)越大，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。NormFinder和geNorm程序都能最終獲得各個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，表達(dá)穩(wěn)定值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。

表4 5個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性BestKeeper、geNorm和NormFinder分析結(jié)果Table 4 Analysis results of the stability of five candidate reference genes by BestKeeper, geNorm and NormFinder

使用LightCycler?96軟件分析候選內(nèi)參基因的Ct表達(dá)譜（圖3）。Ct（閾值周期）值是擴(kuò)增曲線和閾值線之間的交點，它是RT-qPCR反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對量度。在本研究中，所有數(shù)據(jù)中候選內(nèi)參基因的Ct值在7.28-27.30之間。在長莖葡萄蕨藻中，Cl18S的轉(zhuǎn)錄豐度最高（Cl18S在所有樣品中的Ct值的算術(shù)平均值最小，為8.30，圖3-F）；ClTUB在所有樣本子集中的表達(dá)量均較低（ClTUB在所有樣品中的Ct值的算術(shù)平均值最大，為24.94，圖3-F）。Cl18S和ClACT基因的Ct值分布相對集中（7.28-10.99和19.53-23.53），因此Cl18S和ClACT的基因表達(dá)相對穩(wěn)定。ClEF1a值的Ct分布較分散（19.92-26.22），因此與其他基因相比，ClEF1a的基因表達(dá)最不穩(wěn)定。

圖3 候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)譜Fig. 3 Expression profile of candidate internal reference genes in samples

通過計算每個候選內(nèi)參基因4種分析結(jié)果（Ct值分布標(biāo)準(zhǔn)差，BestKeeper SD值，geNorm M值和NormFinder表達(dá)穩(wěn)定值）的幾何平均值對實驗結(jié)果進(jìn)行了整合，并對其進(jìn)行了綜合排序（表5）。當(dāng)考慮所有樣品時，ClACT的穩(wěn)定性最好（SD=0.67，M=0.685，NormFinder穩(wěn)定值=0.175）其次為Cl18S（SD=0.68，M=0.765，NormFinder穩(wěn) 定 值 =0.352）。ClTUB穩(wěn)定性最差（SD=0.86，M=1.077，NormFinder穩(wěn)定值=0.706）。在長莖葡萄蕨藻的匍匐莖和直立枝中ClACT和Cl18S的穩(wěn)定性都很高，ClTUB穩(wěn)定性都較差，ClGAPDH在匍匐莖中表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。在光照脅迫條件下，ClGAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，ClTUB的穩(wěn)定性較差。在鹽度脅迫下ClACT和ClGAPDH則表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，ClEF1a的穩(wěn)定性最差。在溫度脅迫條件下ClGAPDH和Cl18S的穩(wěn)定性較好，ClTUB的穩(wěn)定性最差。綜合以上結(jié)果，ClACT在大多樣品中表達(dá)穩(wěn)定性都較好，但會受到光照脅迫的影響，ClGAPDH在光照脅迫條件下穩(wěn)定性最好，但在其他處理樣本中穩(wěn)定性存在差異。

表5 5個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序Table 5 Stability rankings of five candidate reference genes

使用geNorm來確定來內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。該軟件可以分析引入一個新內(nèi)參基因?qū)?biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異系數(shù)（Vn/Vn+1）的影響，并根據(jù)Vn/Vn+1來確定在特定實驗條件下最適內(nèi)參基因數(shù)目。在我們的研究中，光照脅迫處理組的所有V值低均于0.15，其他處理組V值大多在0.15-0.25之間，多數(shù)實驗組的V2/3值在0.15-2.00之間（圖4）。

圖4 geNorm軟件確定最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig. 4 Number of the most suitable reference genes determined by geNorm software

2.4 篩選出的內(nèi)參基因的驗證

綜合4種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ClACT，ClGAPDH和Cl18S在長莖葡萄蕨藻中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，但由于Cl18S在長莖葡萄蕨藻中的表達(dá)豐度與其他基因差異較大，不適宜作為內(nèi)參基因使用。ClTUB在長莖葡萄蕨藻中大多處理樣本中表達(dá)穩(wěn)定性都較差。所以分別使用ClACT、ClGAPDH和ClTUB作為校準(zhǔn)內(nèi)參基因分析ClHSP90和ClSSD相對表達(dá)水平來驗證所篩選出的內(nèi)參基因的可靠性。結(jié)果表明，兩個基因（ClHSP90和ClSSD）的表達(dá)水平在脅迫環(huán)境下均上調(diào)，并且當(dāng)使用ClACT或ClGAPDH作為內(nèi)參基因時，觀察到相似的變化模式。但是，使用ClTUB（最不穩(wěn)定）進(jìn)行校準(zhǔn)時，可以明顯的觀察到HSP90和SSD在光照脅迫下的表達(dá)水平被高估（圖5），與實際情況不符。顯然是由于樣品中ClTUB表達(dá)的穩(wěn)定性低引起的，這表明在RT-qPCR分析中選擇合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

圖5 使用不同內(nèi)參基因分析HSP90（A）和SSD（B）在長莖葡萄蕨藻脅迫條件下的相對表達(dá)量Fig. 5 Analysis of relative expressions of HSP90（A）and SSD（B）by different reference genes under the stress of C. lentillifera

3 討論

實時熒光定量PCR的靈敏性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，已經(jīng)成為研究基因表達(dá)的重要方法之一。為了獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和結(jié)果，實驗中的每一步都需要做好，包括RNA的質(zhì)量，引物設(shè)計，實驗操作等，但除了這些，選擇合適的內(nèi)參基因也是必不可少的步驟。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該具備以下幾個條件：（1）同種生物的不同組織部位不同生長階段都能穩(wěn)定表達(dá)［26］；（2）在各種環(huán)境下都能穩(wěn)定表達(dá)，不受各種生物和非生物脅迫影響［27］；（3）在實驗材料中不存在假基因；（4）表達(dá)豐度與目標(biāo)基因相近［28］。

由于不同的分析方法的側(cè)重點不同，所以給出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序結(jié)果也不同。例如在擬南芥中Actin和EF1a基因在geNorm分析結(jié)果中為最穩(wěn)定的兩個基因，而這兩個基因在NormFinder分析結(jié)果中的排名卻相對靠后［29］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，ClGAPDH的穩(wěn)定性在不同的分析方法之間差異很大。因此，為了獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，最好使用不同的軟件進(jìn)行綜合分析。在某些物種中，相同內(nèi)參基因在不同組織部位中的穩(wěn)定性可能有所不同。EF1a基因在脅迫條件下的大葉龍膽葉片中表達(dá)較穩(wěn)定，但在根或不同發(fā)育階段的組織中表達(dá)不穩(wěn)定［30］。但在我們的研究中，通過比較長莖葡萄蕨藻不同部位的候選內(nèi)參基因的排序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其直立枝和匍匐莖各個基因的排列順序雖有差別，但篩選出的最佳內(nèi)參基因都為ClACT，而ClTUB基因的穩(wěn)定性都較差。這可能與長莖葡萄蕨藻作為單細(xì)胞多核生物的形態(tài)特征有關(guān)。同時我們發(fā)現(xiàn)光照脅迫條件下長莖葡萄蕨藻內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序與其他樣品之間存在一定差異，這可能與長莖葡萄蕨藻在光照脅迫條件下的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制有關(guān)，但由于長莖葡萄蕨藻對光照脅迫的調(diào)控機(jī)制尚未明確，具體原因還需要進(jìn)一步研究才能確認(rèn)。

Actin即肌動蛋白基因，是細(xì)胞中的一種重要的骨架蛋白，并且同時在細(xì)胞移動，細(xì)胞分泌，細(xì)胞吞噬等起到重要作用，在不同物種間表現(xiàn)出高度的保守性。在研究條斑紫菜葉狀體在不同環(huán)境脅迫下的基因表達(dá)情況時，可以選擇肌動蛋白Actin作為內(nèi)參基因［31］。本研究發(fā)現(xiàn)長莖葡萄蕨藻中ClACT表達(dá)最穩(wěn)定，最適合作為研究脅迫條件下長莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況時的內(nèi)參基因。在使用RT-qPCR研究萊茵衣藻，獼猴桃和龍眼的基因表達(dá)情況時，也通常使用Actin作為內(nèi)參基因［32-34］。GAPDH即甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，是糖酵解反應(yīng)中的一個酶，廣泛分布于各種組織中的細(xì)胞，并且?guī)缀踉谒薪M織中都有較高水平的表達(dá)，同種生物的不同組織的表達(dá)水平也幾乎一致。已經(jīng)有研究證明GAPDH在衣藻中表達(dá)最穩(wěn)定，最適合作為內(nèi)參基因［35］。本研究中ClGAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性與其他候選基因相比處于較高水平，可以作為內(nèi)參基因。同時，在其他物種如李子［36］，枸杞［37］等中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。

研究中Cl18S在長莖葡萄蕨藻中的表達(dá)豐度較高，與其他基因表達(dá)豐度差異很大，不適宜做為優(yōu)先考慮的內(nèi)參基因。在其他的物種的研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論，如18SrRNA在對龍眼［16］和馬鈴薯［6］等進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選時，18SrRNA也都顯示出較高的表達(dá)豐度。Tubulin在進(jìn)化中具有高度的保守性，所以常在RT-qPCR中被用做內(nèi)參基因。例如Tubulin在壇紫菜不同生長階段表達(dá)穩(wěn)定，豐度適合，可作為內(nèi)參基因［18］。但本研究中ClTUB在長莖葡萄蕨藻不同組織部位中、光照脅迫條件下和溫度脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性都相對較差，所以并不適合作為長莖葡萄蕨藻的內(nèi)參基因。

geNorm軟件計算得出的V值可以用于確定最佳內(nèi)參基因數(shù)，通常將0.15用作臨界值，這意味著當(dāng)Vn/Vn+1小于0.15時，不需要額外增加內(nèi)參基因。但是，實際上0.15作為臨界值過于理想化，在大多數(shù)研究中都很難達(dá)到［9］，因此可以根據(jù)實驗結(jié)果對其進(jìn)行微調(diào)?；诖藰?biāo)準(zhǔn)，建議使用兩個篩選出的最穩(wěn)定基因作為內(nèi)參基因來對脅迫條件下長莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況進(jìn)行校準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本研究分析和比較了5個候選內(nèi)參基因長莖葡萄蕨藻不同脅迫條件和不同組織部位的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示使用兩個合適的內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)化，可在長莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況研究中獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。在所有測試的實驗條件下，ClACT和ClGAPDH的組合都是最佳內(nèi)參基因組合，而ClTUB表達(dá)穩(wěn)定性較差不適合作為內(nèi)參基因。ClHSP90和ClSSD基因表達(dá)驗證表明，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ谠赗T-qPCR中獲得準(zhǔn)確的結(jié)果至關(guān)重要。本研究為使用RT-qPCR分析脅迫條件下長莖葡萄蕨藻基因表達(dá)提供了理論支持。