一株微桿菌CBA01對球形棕囊藻的溶藻特性與生理響應(yīng)研究

王靈 向文洲 衛(wèi)華寧 呂金亭 吳華蓮 吳后波

（1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣州 511458；4. 中國科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院，廣州 510301）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化和城市化的迅速推進(jìn)，海洋水體的污染和富營養(yǎng)化日趨嚴(yán)重，其中最顯著的就是赤潮爆發(fā)的頻率和規(guī)模也逐漸呈現(xiàn)增長趨勢［1］。赤潮發(fā)生后，嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)和漁業(yè)資源，導(dǎo)致海洋環(huán)境惡化從而嚴(yán)重破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)［2］。棕囊藻（Phaeocystis）是一種廣溫廣鹽性的定鞭金藻，廣泛分布在我國沿海海域，是我國南海海域頻繁爆發(fā)赤潮的藻種之一［3］。近年來，我國沿海地區(qū)棕囊藻引發(fā)的赤潮頻繁爆發(fā)，棕囊藻藻體含有的膠質(zhì)和糖的囊體會(huì)緊緊貼在魚鰓上，引起魚類窒息死亡，同時(shí)分泌溶血毒素破壞水體環(huán)境，影響近海魚蝦養(yǎng)殖，造成重大經(jīng)濟(jì)損失［4］。因此，解決棕囊藻赤潮危機(jī)也成為了當(dāng)前海洋環(huán)境研究的重點(diǎn)問題。

目前，治理赤潮普遍采用傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法，如機(jī)械除藻、使用化學(xué)除藻藥劑等方法。然而這些傳統(tǒng)方法卻存在諸多因素的限制，如成本、安全性等，且治理效率低易造成二次污染［5-7］。隨著對赤潮防治研究的深入，人們漸漸發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌對藻類的生長發(fā)育起著潛在的調(diào)控作用。在利用傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法防治效果收效甚微的情況下，人們開始把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到海洋細(xì)菌上，通過細(xì)菌溶藻來抑制藻體生物量，從而抑制有害藻華的爆發(fā)［8-9］。如今，溶藻細(xì)菌作為赤潮防治的新方法，開始引起國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。目前關(guān)于溶藻細(xì)菌如何裂解藻細(xì)胞進(jìn)行溶藻的機(jī)理以及溶藻細(xì)菌中具有溶藻作用的活性物質(zhì)的分離鑒定都仍處于研究階段［10］。因此，研究溶藻細(xì)菌對球形棕囊藻的作用機(jī)制對當(dāng)前生物防治赤潮爆發(fā)具有重要意義。

本課題組之前從位于海南省三亞市天涯鎮(zhèn)的能源綠藻Picochlorum sp. SCSIO-45015開放池中，分離出一株入侵生物藍(lán)細(xì)菌Cyanobacterium sp SCSIO-45682［11］。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在該藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物對微藻的侵染過程中，起主導(dǎo)作用的不是藍(lán)細(xì)菌自身，而是附生于該藍(lán)細(xì)菌的多株細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)室前期已探究了一株對鹽生杜氏藻有強(qiáng)烈溶藻作用的細(xì)菌CBA02［11］。本研究將對另一株同樣具有溶藻效應(yīng)的細(xì)菌CBA01的溶藻特性及其作用機(jī)制展開研究。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期研究，初步鑒定其為微桿菌屬M(fèi)icrobacterium sp. CBA01，且在對該株菌溶藻范圍的廣譜性測定中發(fā)現(xiàn)該菌對球形棕囊藻Phaeocystis globosa SCSIO-45315具有強(qiáng)烈的溶藻效應(yīng)。因此，本研究以球形棕囊藻為研究對象，對細(xì)菌CBA01的溶藻特性和溶藻機(jī)制進(jìn)行初步探究，確定其溶藻方式及溶藻活性特性，并測定了該菌株在溶藻過程中藻細(xì)胞生理活性變化，初步揭示其作用機(jī)制，為生物防治赤潮奠定理論基礎(chǔ)。此外，該株溶藻菌發(fā)現(xiàn)于微藻戶外養(yǎng)殖池中，對其溶藻機(jī)制的挖掘，也有效推動(dòng)了防治微藻大規(guī)模養(yǎng)殖中溶藻菌入侵污染的技術(shù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株CBA01為實(shí)驗(yàn)室分離得到的藍(lán)細(xì)菌Cyanobacterium sp. SCSIO-45682的共附生細(xì)菌，屬微桿菌（Microbacterium sp.）。該藍(lán)細(xì)菌于2013年由本實(shí)驗(yàn)室從海南省三亞市天涯鎮(zhèn)的被污染微藻開放養(yǎng)殖池中分離獲得。實(shí)驗(yàn)藻種球形棕囊藻Phaeocystis globosa SCSIO-45315藻種由中國科學(xué)院南海海洋研究所經(jīng)濟(jì)微藻種質(zhì)庫提供。

1.2 方法

1.2.1 藻株的培養(yǎng)方法 菌株CBA01培養(yǎng)采用2216E培養(yǎng)基［12-13］，于 28℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用藻種均采用 F/2 培養(yǎng)基［14］，于溫度25±1℃、光照強(qiáng)度 4 000 lx、光暗比12 h∶12 h條件下培養(yǎng)。

1.2.2 菌株CBA01生長曲線的測定 挑取固體培養(yǎng)基上的菌株CBA01單菌落接種至2216E液體培養(yǎng)基中，設(shè)置3組平行，28℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。每12 h取樣測定OD600，用測定的數(shù)據(jù)構(gòu)建細(xì)菌的生長曲線，分析各生長階段。

1.2.3 葉綠素a含量和溶藻率的測定 采用丙酮法測定葉綠素a的含量［15］。溶藻率計(jì)算公式：

其中，CC表示對照組葉綠素濃度，CT表示實(shí)驗(yàn)處理組葉綠素濃度。

1.2.4 菌株CBA01的溶藻效應(yīng)研究

1.2.4.1 不同發(fā)酵時(shí)間的菌液對溶藻活性的影響 分別取5 mL培養(yǎng)了24 h、48 h、72 h、120 h、192 h、240 h的CBA01菌液加入到100 mL處于對數(shù)生長期的球形棕囊藻藻液中，以在藻液中加入等量 2216E 培養(yǎng)基作為空白對照組，每組設(shè)2個(gè)平行，于溫度（25±1）℃、光照強(qiáng)度 4 000 lx、光暗比12 h∶12 h條件下培養(yǎng)。藻菌共培養(yǎng)，每隔2 d定時(shí)取樣，測定藻液中葉綠素a的含量并計(jì)算溶藻率。

1.2.4.2 不同添加量的菌液對溶藻活性的影響 細(xì)菌CBA01于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，分別取2 mL、3 mL、5 mL的菌液量加入到100 mL對數(shù)生長期的球形棕囊藻藻液中，空白對照組處理和培養(yǎng)條件同上。藻菌共培養(yǎng)，定時(shí)取樣并計(jì)算溶藻率。

1.2.4.3 藻液不同初始濃度對溶藻活性的影響 細(xì)菌CBA01于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，分別將球形棕囊藻液的OD680調(diào)至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，各組取100 mL藻液加入5 mL的菌液，空白對照組處理和培養(yǎng)條件同上。藻菌共培養(yǎng)，定時(shí)取樣并計(jì)算溶藻率。

1.2.4.4 細(xì)菌CBA01的溶藻作用方式 細(xì)菌CBA01于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，取菌液10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和細(xì)菌菌體。菌體用無菌水洗滌3次后重懸，上清液過0.22 μm 濾膜后4℃冰箱保存待用。分別吸取5 mL原細(xì)菌培養(yǎng)液、上清液和菌體重懸液，分別加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養(yǎng)條件同上。藻菌共培養(yǎng)，定時(shí)取樣并計(jì)算溶藻率。

1.2.4.5 溫度對細(xì)菌CBA01無菌上清液溶藻活性的影響 制備細(xì)菌CBA01無菌上清液，分別在30℃、70℃和 100℃水浴以及 121℃高壓蒸汽滅菌鍋中處理30 min，自然冷卻至室溫，并各取5 mL無菌上清液加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養(yǎng)條件同上。藻菌共培養(yǎng)，定時(shí)取樣并計(jì)算溶藻率。

1.2.4.6 pH對細(xì)菌CBA01無菌上清液溶藻活性的影響 收集細(xì)菌CBA01無菌上清液，分別調(diào)節(jié)其pH至2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0，過夜處理后將其調(diào)回初始pH值。并各取5 mL無菌上清液加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養(yǎng)條件同上。藻菌共培養(yǎng)，定時(shí)取樣并計(jì)算溶藻率。

1.2.5 細(xì)菌CBA01無菌上清液對球形棕囊藻細(xì)胞生理活性的影響

1.2.5.1 粗酶液制備 取對數(shù)期的球形棕囊藻藻液，加入5 mL的CBA01無菌上清液進(jìn)行培養(yǎng)，以加入等量 2216E培養(yǎng)基作為空白對照組。分別收集處理0 h、24 h、48 h 的藻液，6 000 r/min、4℃離心10 min，收集藻細(xì)胞。將收集的藻細(xì)胞重懸于相應(yīng)勻漿介質(zhì)中，4℃ 超聲波破碎后細(xì)胞勻漿以 6 000 r/min、4℃離心10 min，上清液即為粗酶液［16］。

1.2.5.2 酶活性的測定 細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性均采用相應(yīng)試劑盒（南京建成生物工程公司、北京百奧萊博科技有限公司）進(jìn)行測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Oringin軟件，用One-way ANOVA分析進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P＜0.05 表示差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 菌株CBA01的生長曲線

每隔12 h取樣，測定菌株Microbacterium sp.CBA01的OD600，繪制生長曲線如圖1所示。從圖1中可以看出，CBA01生長延滯期為0-12 h，對數(shù)生長期為12-72 h，72 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，168 h后進(jìn)入衰退期。由此可選取細(xì)菌濃度較高的穩(wěn)定期進(jìn)行后續(xù)溶藻相關(guān)試驗(yàn)。

圖1 細(xì)菌CAB01的生長曲線Fig. 1 Growth curve of symbiotic bacteria CAB01

2.2 細(xì)菌CBA01的溶藻效果

菌液的發(fā)酵時(shí)間、添加量以及藻液初始濃度都是細(xì)菌溶藻作用強(qiáng)度的影響因素。其中細(xì)菌CBA01的溶藻作用與發(fā)酵時(shí)間成正相關(guān)（圖2-A），發(fā)酵時(shí)間為24 h和48 h時(shí)溶藻率較低，第6天溶藻率為10.23%±0.99%和37%±0.89%，從72 h后，各組中溶藻率變化趨勢類似，到第6天溶藻率分別為68.48%±0.92%、73.78%±7.55%、74.50%±8.79%和64.58%±1.53%，因此以72 h作為菌液的發(fā)酵時(shí)間。細(xì)菌CBA01的溶藻能力隨菌液添加量增加而增加（圖2-B）。當(dāng)菌液添加量為2 mL和3 mL時(shí)，溶藻率雖在上升但變化幅度不明顯，培養(yǎng)第6天溶藻率僅為14.08%±8.46%和49.63%±1.85%，而添加量為5 mL時(shí)，第6天溶藻率達(dá)到最大，為88.17%±0.94%，以此作為菌液最適添加量。藻液初始濃度越高，菌株CBA01溶藻效果越不明顯（圖2-C），藻菌培養(yǎng)第6天時(shí)，藻液初始OD680為0.1和0.2時(shí)，溶藻效果最好，為80.24%±5.43%和59%±0.34%；而藻液初始OD680為0.3、0.4和0.5時(shí)，第6天時(shí)溶藻率并不明顯，分別為23.05%±9.26%、29.53%±2.08%和20.40%±4.59%。

圖2 菌液不同發(fā)酵時(shí)間（A）、菌液不同添加量（B）及藻液不同初始濃度（C）對溶藻活性的影響Fig. 2 The effect of different fermentation time (A) and addition amount of bacterial solution (B) and different initial concentration of P. globosa (C) on algicidal activity

2.3 細(xì)菌CBA01的溶藻作用方式

為探究溶藻菌對球形棕囊藻的溶藻作用方式，分別對溶藻菌發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾收集菌體和無菌上清液的溶藻效果進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藻菌共培養(yǎng)過程中，細(xì)菌發(fā)酵液組與無菌上清液組的溶藻率幾乎同步增長，至培養(yǎng)第6天時(shí)，兩組溶藻率分別達(dá)到96.06%和95.39%，均顯著性高于細(xì)菌菌體組的溶藻率（P＜0.05）。

圖3 菌液不同處理對溶藻活性的影響Fig. 3 The effect of different addition treatment of bacterial solution on algicidal activity

2.4 細(xì)菌CBA01無菌上清液溶藻物質(zhì)的特性

溶藻細(xì)菌CBA01的無菌上清液經(jīng)過不同溫度處理后，如圖4-A所示。對棕囊藻仍表現(xiàn)出較高的溶藻效應(yīng)，但溶藻活性整體較之前的處理組出現(xiàn)略微下降，尤其是121℃處理組，溶藻率為42.95%±3.88%，其余組別溶藻率變化不大，分別為 51.32%±0.54%、53.22%±3%、53.75%±2.97%。上清液經(jīng)過不同pH處理后，溶藻效果如圖4-B所示。當(dāng)pH偏酸性時(shí)，各組溶藻率隨pH的增加而增加，且隨藻菌共培養(yǎng)時(shí)間而上升，上清濾液pH為 2.0、4.0、6.0時(shí)，培養(yǎng)至第6天時(shí)溶藻率分別為56.38%±3.96%、64.62%±8.26%、63.64%±0.34%；當(dāng)pH偏堿性時(shí)，CBA01溶藻物質(zhì)表現(xiàn)出對強(qiáng)堿較敏感，溶藻率顯著降低，上清濾液pH為8.0和10.0時(shí)，到第6天溶藻率分別為 53.95%±9.24%和18.13%±4.17%。

圖4 不同溫度（A）和酸堿（B）條件處理后的CBA01無菌上清液對球形棕囊藻的溶藻效果Fig. 4 Algicidal efficiency of CBA01 sterile filtrate treated with different temperature (A) and pH (B)conditions on P. globosa

2.5 細(xì)菌CBA01無菌上清液對球形棕囊藻細(xì)胞生理活性的影響

MDA作為細(xì)胞膜脂過氧化判斷的重要指標(biāo)，反映了機(jī)體細(xì)胞膜氧化損傷的程度。加入CBA01無菌上清液處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯上升，上清液處理48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01）（圖5-A）。SOD能夠清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基，防止其在細(xì)胞內(nèi)積累，從而對細(xì)胞產(chǎn)生危害。添加上清液處理后，藻細(xì)胞內(nèi) SOD 活性先上升后下降，而對照組的藻液 SOD 活性基本保持不變，培養(yǎng)24 h時(shí)，加入無菌上清液的藻液中SOD 的活性是對照組的1.8倍（P＜0.01），48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SOD活性有所下降，但仍是對照組的1.5倍（P＜0.01）（圖5-B）。POD能催化體內(nèi)過氧化氫反應(yīng)，有效降解細(xì)胞內(nèi)H2O2，從而防止H2O2在有機(jī)體內(nèi)積累，導(dǎo)致有機(jī)體傷害。加入上清液處理后，POD活性呈逐漸升高的趨勢，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對照組，且處理24 h和24 h 后活性分別升高至對照組的13.89倍和32.71倍（P＜0.01）（圖 5-C）。

圖5 無菌上清液對球形棕囊藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性的影響Fig. 5 Effect of sterile supernatant on the activity of antioxidant enzymes of P. globosa cells

2.6 葉綠素a含量的測定

CBA01無菌上清液對球形棕囊藻葉綠素a含量的影響見圖6。隨共培養(yǎng)時(shí)間的增加，經(jīng)上清液處理的藻液葉綠素a含量逐漸降低，至培養(yǎng)第6天時(shí)，葉綠素a含量降到最低為（0.14±0.01）μg/mL，較對照組下降95%（P＜0.01）。結(jié)果表明，溶藻物質(zhì)會(huì)破壞藻細(xì)胞的光合作用活性，影響光合作用效果，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞缺少能量供給而死亡。

圖6 無菌上清液對球形棕囊藻細(xì)胞葉綠素a含量的影響Fig 6 Effect of sterile supernatant on chlorophyll a activity of P. globosa cells

3 討論

3.1 溶藻細(xì)菌與赤潮的生物防治

有害藻華目前已成為全球性的海洋生態(tài)問題，對海洋環(huán)境、漁業(yè)養(yǎng)殖以及人類健康等都造成了嚴(yán)重威脅。近年來許多研究表明，將這類可抑制藻細(xì)胞生長，溶裂或殺死藻細(xì)胞的細(xì)菌稱為溶藻細(xì)菌，將這種特性稱為溶藻特性，但在部分文獻(xiàn)中，也有用殺藻活性來表示［17-18］。由于這類細(xì)菌易培養(yǎng)，能高效裂解藻細(xì)胞，安全性高等特性，深入研究溶藻細(xì)菌對藻類的溶藻特性以及作用機(jī)理有助于開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效、環(huán)境友好型生物除藻劑，現(xiàn)已成為當(dāng)今生物防治赤潮的研究熱點(diǎn)。

球形棕囊藻作為有害藻華的代表藻種之一，國內(nèi)外目前有關(guān)細(xì)菌對球形棕囊藻的溶藻作用研究相對較少，已有報(bào)道溶藻細(xì)菌多為鏈霉菌屬（Streptomyces）、 芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus） 等［19-21］。Zhang等［22］分離出一株鏈霉菌屬RPS（Streptomyces alboflavus RPS）通過分泌胞外活性物質(zhì)能抑制球形棕囊藻鞭毛活性，致使其鞭毛脫落而裂解死亡。Tan等［18］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Ts-12（Bacillus sp. Ts-12）可分泌一種環(huán)肽對球形棕囊藻表現(xiàn)出顯著的殺藻活性。陳麗娜報(bào)道了一株芽孢桿菌B1分泌的L-組氨酸對球形棕囊藻有明顯的溶藻效果［23］。本研究首次報(bào)道了從藍(lán)細(xì)菌中分離出的一株對球形棕囊藻具有很強(qiáng)的溶藻能力的菌株CBA01，該菌屬于放線菌類群（Actinobacteria）中的微桿菌屬（Microbacterium sp.），這進(jìn)一步豐富了球形棕囊藻的溶藻細(xì)菌資源庫，有助于開發(fā)綜合性多樣化的新型生物除藻劑，這對赤潮生物防治有重要的意義和應(yīng)用前景。

3.2 菌株CBA01的溶藻特性及溶藻機(jī)制

已有研究表明，溶藻細(xì)菌的溶藻特性受光照、溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間、菌和藻的生長狀態(tài)等多種因素的影響［24］。本研究首先對菌株CBA01菌液的溶藻特性進(jìn)行了初步分析，摸索CBA01菌液達(dá)到最佳溶藻活性的測試條件，為進(jìn)一步揭示溶藻作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，細(xì)菌的溶藻作用效應(yīng)與菌液發(fā)酵時(shí)間、菌液添加量成正相關(guān)關(guān)系，隨著菌液發(fā)酵時(shí)間的增長和菌液濃度提高，溶藻效應(yīng)隨之提高；而細(xì)菌的溶藻效應(yīng)與藻細(xì)胞初始濃度成負(fù)相關(guān)，藻細(xì)胞初始濃度越高，溶藻效應(yīng)越差。

在最適溶藻效應(yīng)條件下，本文進(jìn)一步對溶藻活性的成分進(jìn)行了確定。相關(guān)研究報(bào)道，溶藻細(xì)菌主要通過直接溶藻和間接溶藻兩種方式進(jìn)行溶藻作用，兩者區(qū)別在于，前者是細(xì)菌直接接觸藻細(xì)胞表明或侵入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡，后者是細(xì)菌分泌胞外活性物質(zhì)抑制或溶解藻細(xì)胞［25-26］。Imai等［27］1993年發(fā)現(xiàn)的一株噬胞纖維菌Cytophaga sp.能直接與藻細(xì)胞表面接觸將藍(lán)藻殺死。Zhao等［9］從一株Bacillus sp. B1 中分離得到多種能夠殺死球形棕囊藻的活性物質(zhì)。與前人結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明，上清液溶藻率與對照組細(xì)菌發(fā)酵液結(jié)果相似，遠(yuǎn)高于菌體組溶藻率，且在顯微鏡觀察下，菌體處理組藻細(xì)胞生長狀態(tài)正常，并無明顯溶藻現(xiàn)象，因此初步判斷菌株CBA01通過分泌具有胞外活性物質(zhì)間接溶藻，而菌體本身并無溶藻作用。同時(shí)，對CBA01的無菌上清液進(jìn)行不同溫度、pH處理，結(jié)果表明，CBA01分泌的胞外溶藻物質(zhì)在高溫處理下仍具有較高的溶藻活性，說明溶藻活性物質(zhì)具有一定耐高溫性，高溫下不易變形失活，因此初步推測該物質(zhì)不是易受高溫影響的蛋白質(zhì)或核酸等生物分子。同時(shí)，根據(jù)結(jié)果分析，pH對CBA01的溶藻活性也有顯著影響，尤其強(qiáng)堿條件下，溶藻效應(yīng)顯著降低，而酸性條件下，溶藻物質(zhì)的活性相對穩(wěn)定，并隨pH的增加而增加，這表明酸堿強(qiáng)度會(huì)影響溶藻物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及溶藻活性強(qiáng)度。對細(xì)菌CBA01溶藻特性的探索分析，有助于進(jìn)一步確定溶藻物質(zhì)的種類和化學(xué)結(jié)構(gòu)，為探索細(xì)菌CBA01的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

3.3 溶藻物質(zhì)對藻細(xì)胞生理活性的影響

外界環(huán)境刺激會(huì)引起機(jī)體發(fā)生氧化脅迫，細(xì)胞內(nèi)通過自身產(chǎn)生的抗氧化系統(tǒng)（包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化物質(zhì)）清除體內(nèi)過量的活性氧（ROS）來維持細(xì)胞內(nèi)平衡狀態(tài)，以保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境的損害。通過對細(xì)菌CBA01溶藻過程的觀察發(fā)現(xiàn)，CBA01溶藻物質(zhì)會(huì)破壞棕囊藻細(xì)胞內(nèi)部，致使細(xì)胞膨脹破碎，胞內(nèi)物質(zhì)外流，進(jìn)而細(xì)胞死亡。因此，本研究探究了溶藻作用初期藻細(xì)胞生理活性的變化，以進(jìn)一步揭示菌CBA01的溶藻作用機(jī)制。

機(jī)體通過非酶系統(tǒng)產(chǎn)生ROS，會(huì)攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用。因此作為膜脂過氧化終產(chǎn)物的丙二醛常作為反映機(jī)體非酶類抗氧化能力的指標(biāo)［28］。在本研究結(jié)果中，作為細(xì)胞膜完整性判斷指標(biāo)的MDA含量上升，說明溶藻物質(zhì)作用下，藻細(xì)胞細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，破壞細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。SOD作為第一個(gè)參與清除活性氧的保護(hù)酶，能清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基［29］。POD能催化體內(nèi)過氧化氫反應(yīng)，防止過氧化氫過多累積。本研究中兩種抗氧化酶，在溶藻作用下，酶活性整體呈上升趨勢，表明溶藻物質(zhì)損傷了球形棕囊藻細(xì)胞，刺激藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了過量的有害自由基，機(jī)體自身的防御機(jī)制開啟，清除體內(nèi)的有害自由基，因而SOD和POD活性上升。而后SOD活性變化趨勢逐漸減弱，說明隨著有害自由基的不斷積累，超出藻細(xì)胞自身修復(fù)力，酶活力下降，藻細(xì)胞受損程度逐漸加劇甚至死亡，達(dá)到溶藻目的。

這一結(jié)果也與已有研究結(jié)果相似。韓貝貝等［17］研究發(fā)現(xiàn)溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的MDA含量、SOD、POD的活性顯著上升。牛丹丹等［30］發(fā)現(xiàn)溶藻細(xì)菌YZ無菌濾液主要是通過降低保護(hù)酶活性、加大膜脂過氧化發(fā)揮對銅綠微囊藻的溶解作用。綜合上述研究結(jié)果，推測溶藻細(xì)菌CBA01入侵球形棕囊藻細(xì)胞，一方面可能通過刺激藻細(xì)胞內(nèi)短時(shí)間產(chǎn)生過量的有害自由基導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，從而影響藻細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，改變膜通透性，大量溶藻活性物質(zhì)進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)，最終細(xì)胞破裂死亡；另一方面也可能是CBA01溶藻物質(zhì)本身具有較強(qiáng)的氧化性，產(chǎn)生大量有害自由基，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)后進(jìn)入藻細(xì)胞后破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)致使細(xì)胞死亡。初步確定了CBA01對藻細(xì)胞生理活性的影響，但對其溶藻機(jī)理的深入研究仍需繼續(xù)，可在之后通過檢測溶藻物質(zhì)是否具有強(qiáng)氧化性來進(jìn)一步揭示溶藻作用的過程及作用部位。

3.4 溶藻物質(zhì)對藻細(xì)胞光合系統(tǒng)的影響

葉綠素a 能影響光能的吸收與能量轉(zhuǎn)換，是反映光合作用能力的重要指標(biāo)［31］。本研究中，溶藻細(xì)菌CBA01作用下，棕囊藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著下降，表明溶藻物質(zhì)會(huì)損傷藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)，抑制機(jī)體有機(jī)物供給和能量運(yùn)輸，影響藻細(xì)胞正常生長甚至引起藻細(xì)胞死亡。與本文研究結(jié)果相似，Hu等［32］研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌 Y4 胞外活性物質(zhì)會(huì)加速球形棕囊藻細(xì)胞光合色素分解，葉綠素a 含量顯著下降，影響光合系統(tǒng)Ⅱ光能轉(zhuǎn)化效率，從而對藻細(xì)胞損傷甚至死亡。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)菌株Microbacterium sp. CBA01通過胞外分泌溶藻物質(zhì)經(jīng)間接溶藻作用而導(dǎo)致球形棕囊藻的裂解，其分泌的溶藻活性物質(zhì)能耐高溫、適合酸性或中性環(huán)境，且溶藻活性受菌液發(fā)酵時(shí)間、添加量和藻液初始濃度等因素影響；菌株CBA01分泌的溶藻活性物質(zhì)在溶藻過程中，刺激藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的有害自由基，引起藻細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化損傷改變其通透性，大量胞外物質(zhì)侵入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致藻體死亡；同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葉綠素a合成受阻，從而抑制細(xì)胞正常生長代謝過程，最終細(xì)胞停止分裂，由此形成溶藻效應(yīng)。