Microbacterium sp. BD6在Cr（VI）污染農(nóng)田土壤修復(fù)中的應(yīng)用研究

楊宗政 趙曉宇 劉丹 許文帥 吳志國(guó)

（1. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；3. 天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

鉻被廣泛應(yīng)用于金屬電鍍、冶金、鉻酸鹽制造、印染等行業(yè)［1-2］，當(dāng)工業(yè)生產(chǎn)中各類廢水流入土壤，就會(huì)造成嚴(yán)重的土壤鉻污染問(wèn)題，尤其是Cr（VI）污染。Cr（VI）的毒性對(duì)土壤中的動(dòng)植物以及微生物都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響［3-4］。土壤中的Cr（VI）不僅會(huì)造成植物減產(chǎn)，還會(huì)在植物中發(fā)生生物積累后進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而影響動(dòng)物及人類的健康。因此，對(duì)Cr（VI）污染農(nóng)田進(jìn)行安全且有效地修復(fù)已成為亟待解決的難題［5］。

在眾多土壤修復(fù)方法中，微生物修復(fù)具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，是重要的土壤修復(fù)手段之一。Srivastava等［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，Cr（VI）脅迫會(huì)對(duì)植物系統(tǒng)造成破壞，堆肥及黑曲霉的共同作用可去除土壤中Cr（VI）污染，從而顯著改善小麥植株的生長(zhǎng)情況。陳土鳳等［7］利用Exiguobacterium sp.對(duì)土壤中的Cr（VI）進(jìn)行還原，小白菜的生長(zhǎng)情況及受到的氧化應(yīng)激情況明顯改善。可見(jiàn)，通過(guò)微生物修復(fù)Cr（VI）污染土壤，可緩解其對(duì)植物的毒性及氧化脅迫，并減少植株對(duì)Cr（VI）的吸收，對(duì)植物無(wú)公害化具有重大意義。微生物群落特征是表征土壤質(zhì)量變化的最敏感及最具潛力的指標(biāo)之一。土壤中的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)會(huì)在受到重金屬脅迫后發(fā)生變化，因此，通過(guò)微生物多樣性的變化反映土壤污染程度被廣泛采用［8-10］。

由于土壤環(huán)境復(fù)雜，對(duì)微生物適應(yīng)能力要求較高，因此，利用微生物修復(fù)Cr（VI）污染土壤還大多處于研究階段。本研究嘗試將課題組前期分離篩選的具有較好Cr（VI）還原特性的菌株Microbacterium sp. BD6［11］用于 Cr（VI）污染土壤修復(fù)中，對(duì)菌株BD6去除土壤中Cr（VI）的影響因素進(jìn)行了研究，并通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)及土壤微生物群落分析等試驗(yàn)對(duì)Cr（VI）的毒性及菌株BD6對(duì)Cr（VI）污染土壤的修復(fù)效果進(jìn)行表征，以期為實(shí)際修復(fù)Cr（VI）污染農(nóng)田土壤提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 菌株是本課題組分離自福建省廈門市某電鍍廠下水道的淤泥，菌株BD6 的16S rRNA 部分基因序列保存于GenBank，登陸號(hào)為MK611086。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸粉 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0；在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂 2 g/100 mL 即成LB固體培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基121℃ 高壓濕熱滅菌 20 min 后使用。含Cr（VI）培養(yǎng)基是根據(jù)所需Cr（VI）濃度向LB培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的Cr（VI）標(biāo)準(zhǔn)溶液［11］。

1.1.3 供試土壤來(lái)源 供試農(nóng)田土取自河南省安陽(yáng)市黃縣某農(nóng)田（北緯 35°95′，東經(jīng) 114°86′）。土壤有機(jī)質(zhì)含量為9.63 g/kg，pH值為7.2，全氮0.31 g/kg，總磷11.61 mg/kg，未檢測(cè)到Cr（VI）。土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，過(guò)孔徑為2 mm的篩網(wǎng)，含水率為6.1%。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 挑取劃線純化后的BD6菌株單菌落接入LB培養(yǎng)基中，于180 r/min、30℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后，離心后重懸于無(wú)菌水中制得濃度為3×108CFU/mL 的菌懸液備用。

1.2.2 配制Cr（VI）標(biāo)準(zhǔn)溶液 配制5 g/L Cr（VI）的標(biāo)準(zhǔn)溶液：將重鉻酸鉀在 120℃ 烘干 2 h，稱取14.1446 g 溶于1 L去離子水中，過(guò) 0.22 μm 濾膜以除菌，置于4℃冰箱中備用。

1.2.3 土壤中Cr（VI）含量測(cè)定 消解按照《危險(xiǎn)廢物鑒定標(biāo)準(zhǔn) 浸出毒性鑒別》（GB 5085.3-2007）中《附錄D 固體廢物 六價(jià)鉻分析的樣品前處理 堿消解法》的方法進(jìn)行。Cr（VI）測(cè)定按照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。

1.2.4 Cr（VI）還原率計(jì)算方法：

式中，η：Cr（VI）還原率%；C0：土壤中Cr（VI）初始濃度，mg/kg；C1：Cr（VI）還原后，按照1.2.3步驟測(cè)定得到的土壤中Cr（VI）濃度，mg/kg。

1.2.5 土壤條件對(duì)菌株BD6還原Cr（VI）的影響

1.2.5.1 土壤含水率的影響 按16%的接種量（16 mL菌液/100 g土，將菌液于土壤表面多點(diǎn)投加后進(jìn)行攪拌使其與土樣充分混合，下同）向Cr（VI）濃度為100 mg/kg的土壤（100 mg Cr（VI）/ kg含水率6.1%的自然風(fēng)干土，下同）中接種制備的菌液，向土壤中補(bǔ)充去離子水使土壤含水率分別為25%、30%、40%和50%，每組設(shè)置3平行，將樣品置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定其中Cr（VI）含量，考察土壤含水率對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.2 溫度的影響 同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣分別置于15、20、25、30、35和40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定土壤中Cr（VI）含量，考察溫度對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.3 老化時(shí)間的影響 同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，其中Cr（VI）老化土壤時(shí)間分別為新鮮制備土壤（0 h）、老化20 d土壤、老化60 d土壤，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定土壤中Cr（VI）含量，考察Cr（VI）老化土壤時(shí)間對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.4 其它重金屬離子的影響 向含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤中分別投加氯化銅、氯化鋅、氯化錳、氯化鎘、氯化鎳配制的溶液，使Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ni2+在土壤中的濃度分別達(dá)到 50 mg/kg土。同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，以只含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤作為對(duì)照，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置 3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定土壤中Cr（VI）含量，考察重金屬離子對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.5 接種量的影響 將制備的菌液分別按6%、12%、16%和26%的接種量向Cr（VI）濃度為100 mg/kg的土壤中接種，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定土壤中Cr（VI）含量，考察接種量對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.6 Cr（VI）初始濃度的影響 同1.2.5.1向Cr（VI）濃度分別為50、100、150和300 mg/kg土壤中接種菌株BD6，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定Cr（VI）含量，考察Cr（VI）初始濃度對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.6 電子供體的選擇以及菌株還原能力的測(cè)定 向 Cr（VI）濃度為100 mg/kg 的土壤中分別投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇和丙酮酸鈉（20 g電子供體/kg土）。將菌液同1.2.5.1步驟和接種量接種于以上土壤中，以不投加電子供體的Cr（VI）濃度為100 mg/kg 的土壤作為對(duì)照，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)測(cè)定土壤中Cr（VI）含量，考察不同電子供體對(duì)修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.7 盆栽實(shí)驗(yàn) 按照1.2.5.1步驟和接種量向含Cr（VI）100 mg/kg土壤中接種菌株BD6，設(shè)置土壤含水率為30%，置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。將處理96 h的土壤含水率調(diào)節(jié)為20%，與Cr（VI）含量分別為 0、5、10、20、30、50、80和 100 mg/kg土 壤，含水率為20%的土壤一起進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。挑選顆粒飽滿、形狀、質(zhì)量、大小均勻的黃豆播種于花盆中。每盆裝土30 g（含水率20%），播種2粒黃豆，每個(gè)土樣6盆平行，定時(shí)澆水，25 d 后收獲。觀察植株生長(zhǎng)形態(tài)，計(jì)算種子發(fā)芽率方法同文獻(xiàn)［13］，測(cè)定植株鮮重方法同文獻(xiàn)［14］，株高及植株內(nèi)總鉻含量測(cè)定方法同文獻(xiàn)［15］。

1.2.8 土壤微生物群落分析

1.2.8.1 土壤取樣及方法 取原土、100 mg/kg C（rVI）老化12 h土壤、菌株BD6修復(fù)100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修復(fù)組土壤及投加20 g丙三醇/kg土壤的菌株BD6修復(fù)100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修復(fù)組土壤（修復(fù)組土壤取修復(fù)時(shí)間為96 h、10 d、15 d的土壤）進(jìn)行高通量測(cè)序。取樣方法：（1）去除土壤表面覆蓋物。（2）用酒精棉擦拭采樣器，待酒精揮發(fā)完全后，使用采樣樣方處土壤浸潤(rùn)采樣器。后續(xù)每次更換樣方均需重復(fù)此步驟。（3）采用梅花型五點(diǎn)取樣法進(jìn)行混合取樣。（4）將混合好的土壤樣本分裝多份，每份5-10 g，置于-80℃冰箱保存，用于高通量測(cè)序。

1.2.8.2 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 以土壤樣本DNA為模板，采用包含“CTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC” 序列的下游引物擴(kuò)增原核生物16S rDNA的V3和V4高變區(qū)，進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列進(jìn)行OTU聚類（序列相似性設(shè)為97%）。然后對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成?；贠TU得到分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽平的方法，分別計(jì)算Ace、Chao1、Simpson、Shannon等α多樣性指數(shù)，反映群落的物種豐度和多樣性。通過(guò)RDP分類鑒定OUT代表性序列的微生物分類相對(duì)豐度。

1.2.9 菌株BD6在土壤中的定殖情況

1.2.9.1 土壤取樣及方法 取修復(fù)時(shí)間為0 h、96 h、10 d及15 d的含100 mg/kg C（rVI）的修復(fù)組土壤（與高通量測(cè)序土樣修復(fù)組取自同一處），采用熒光定量PCR法，考察菌株BD6在土壤中的定殖情況。取樣方法同1.2.8.1。

1.2.9.2 熒光定量PCR 以提取的土壤樣品的總DNA為模板，擴(kuò)增的目標(biāo)基因?yàn)榫闎D6的16S rRNA基因部分序列。所使用的引物為16S-F（5′-AAGTGACGGTACCTGCAGAA-3′）及 16S-R（5′-GTTGAGCCTCGGGATTTCAC-3′）。于 ABI 7900 Real-time PCR system（Applied Biosystems）擴(kuò)增儀上進(jìn)行絕對(duì)定量PCR 分析。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)不加模板的反應(yīng)管為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，Template 3 μL，正反 向 引 物 各 0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DMSO 0.5 μL，TransStart Taq Polymerase 0.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?：95℃5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。稀釋相應(yīng)的質(zhì)粒濃度從10-1到10-8，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0 軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同條件對(duì)菌株BD6還原Cr（VI）的影響

不同土壤條件對(duì)菌株BD6還原Cr（VI）的影響如圖1所示。菌株BD6對(duì)土壤中Cr（VI）的還原率隨著含水率的升高而增加，當(dāng)含水率達(dá)到30%及以上，菌株BD6對(duì)Cr（VI）還原效果較好。菌株BD6在不同溫度下對(duì)Cr（VI）的還原實(shí)驗(yàn)中，96 h時(shí)菌株BD6在25-40℃范圍內(nèi)對(duì)土壤中Cr（VI）的還原率均可達(dá)到90%以上，且去除效率隨著溫度的升高而提升，當(dāng)溫度低于25℃，菌株BD6對(duì)土壤中Cr（VI）的還原率則明顯降低。Cr（VI）老化土壤時(shí)間對(duì)菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響并不顯著，如圖1所示，菌株BD6對(duì)新制Cr（VI）污染土壤及Cr（VI）老化20 d、60 d的土壤的Cr（VI）還原率分別為90.8%、92.7%和91.5%。菌株BD6在分別含 50 mg/kg 土 的 Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+的 土壤中均可以對(duì)Cr（VI）進(jìn)行還原，但是還原效率會(huì)受到不同程度的抑制。與對(duì)照組相比，Cu2+、Cd2+、Ni2+較明顯抑制了還原效果，Zn2+的抑制作用較輕，Mn2+影響最小。接種量對(duì)菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響如圖1所示，隨著接種量增加，BD6對(duì)土壤中Cr（VI）還原率提高。綜合考慮修復(fù)效果及經(jīng)濟(jì)成本，選擇16 mL菌液/100 g土為最佳接種量。Cr（VI）初始濃度對(duì)菌株BD6還原Cr（VI）的影響如圖1所示，菌株BD6在48 h內(nèi)即可對(duì)初始濃度為50 mg/kg的土壤中Cr（VI）還原90%以上。96 h，菌株BD6可對(duì)初始濃度為100 mg/kg土壤中Cr（VI）還原90%以上。菌株BD6對(duì)Cr（VI）的96 h去除率隨著Cr（VI）初始濃度增加而降低。菌株BD6對(duì)土壤中濃度為100 mg/kg及以下的Cr（VI）有著較好還原效果。

圖1 不同條件對(duì)菌株BD6還原Cr（VI）的影響Fig.1 Effects of factors on the Cr（VI）reduction by strain BD6

2.2 不同電子供體對(duì)土壤修復(fù)的影響

添加電子供體能加快菌株BD6在液體培養(yǎng)基中還原Cr（VI）的速率，因此本研究對(duì)土壤修復(fù)中電子供體利用情況也進(jìn)行了測(cè)試。如圖2所示，投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇、丙酮酸鈉等均會(huì)對(duì)菌株BD6還原土壤中Cr（VI）有促進(jìn)作用。其中添加丙酮酸鈉作為電子供體的促進(jìn)效果最好，36 h對(duì)Cr（VI）的還原率即可達(dá)到90%；其次為添加丙三醇作為電子供體，48 h對(duì) Cr（VI）的還原率可達(dá)到90%。綜合考慮經(jīng)濟(jì)和實(shí)際使用因素，本研究依然使用丙三醇作為土壤修復(fù)中的外加電子供體。

圖2 不同電子供體對(duì)菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響Fig.2 Effect of different electron donors on Cr（VI）reduction in soil by strain BD6

2.3 Cr（VI）污染土壤修復(fù)前后對(duì)植株的影響

含不同濃度Cr（VI）土壤中種植大豆25 d后大豆植株的生長(zhǎng)情況，從圖3可以看出，對(duì)照組大豆生長(zhǎng)良好，株高較高，根部較為發(fā)達(dá)。隨著Cr（VI）濃度增大，植株高度、根系發(fā)達(dá)程度及發(fā)芽率明顯受到越來(lái)越嚴(yán)重的抑制，葉莖發(fā)黃且葉片稀少，當(dāng)Cr（VI）濃度達(dá)到100 mg/kg時(shí)大豆在土壤中發(fā)芽率也受到較大影響，而Cr（VI）濃度為100 mg/kg土壤經(jīng)菌株BD6修復(fù)的處理組中生長(zhǎng)的大豆植株則生長(zhǎng)情況良好。

圖3 大豆盆栽實(shí)驗(yàn)Fig.3 Soybean pot experiments

表1數(shù)據(jù)反映了植株各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)受土壤中Cr（VI）的影響。雖然當(dāng)Cr（VI）濃度達(dá)到100 mg/kg時(shí)，才會(huì)對(duì)發(fā)芽率產(chǎn)生一定影響，但較低Cr（VI）濃度已經(jīng)會(huì)對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，Cr（VI）含量分別為5、10、20、30、50、80和100 mg/kg的土壤中生長(zhǎng)的大豆植株相較于不含Cr（VI）的土壤中生長(zhǎng)的大豆植株，植株高度和重量隨Cr（VI）濃度升高而逐漸降低。本研究還對(duì)植株體內(nèi)吸收的鉻含量進(jìn)行了測(cè)定，隨著土壤中Cr（VI）濃度增大，植株內(nèi)的鉻含量也顯著增加。未經(jīng)處理的含Cr（VI）100 mg/kg土壤中生長(zhǎng)的大豆植株體內(nèi)鉻含量為5 mg/kg，含Cr（VI）100 mg/kg的土壤經(jīng)BD6處理后，植株中并未檢出鉻。以上結(jié)果表明，Cr（VI）對(duì)大豆植株生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性作用，菌株BD6對(duì)土壤的修復(fù)極大緩解了Cr（VI）對(duì)大豆植株的植物毒性，也降低了植株對(duì)鉻的吸收。

表1 植株各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)Table 1 Growth indicators of plants

2.4 Cr（VI）污染土壤修復(fù)對(duì)土壤微生物群落的影響

2.4.1 菌株BD6修復(fù)Cr（VI）污染土壤對(duì)微生物群落影響 通過(guò)16S rRNA基因V3+V4區(qū)域高通量測(cè)序分析土壤樣品，能夠反映樣品中細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu)的變化?？瞻淄寥溃╕）、含Cr（VI）100 mg/kg土壤（Cr）、菌株 BD6修復(fù)含 Cr（VI）100 mg/kg 96 h土壤（未加丙三醇A-96 h，添加丙三醇G-96 h）、修復(fù)10 d土壤（未加丙三醇A-10 d，添加丙三醇G-10 d）、修復(fù)15 d土壤（未加丙三醇A-15 d，添加丙三醇G-15 d）等樣品的微生物α多樣性如表2所示。在所有多樣性指數(shù)中，Ace與Chao1指數(shù)反映出無(wú)Cr對(duì)照組微生物豐度最高，含Cr組較低，在投加菌株BD6修復(fù)后微生物豐度指數(shù)普遍呈增大趨勢(shì)；Shannon和Simpson指數(shù)反映了微生物群落的多樣性，多樣性96 h時(shí)降到最低，而后又呈增大趨勢(shì)，且外加丙三醇組在微生物豐度和多樣性方面在同等條件下略大于未添加組或基本持平。表2中數(shù)據(jù)反映出Cr（VI）對(duì)微生物的毒性作用使土壤中微生物多樣性顯著降低，隨著菌株BD6對(duì)Cr（VI）污染土壤修復(fù)的時(shí)間增加，微生物豐度和多樣性相對(duì)于污染土壤有了顯著恢復(fù)。

表2 α多樣性指數(shù)Table 2 α diversity index

在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面，如圖4-A所示為門水平的物種分布柱狀圖，在菌株BD6修復(fù)Cr（VI）96 h后，優(yōu)勢(shì)菌門為Actinobacteria（放線菌門），次優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes（厚壁菌門），與原土微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同，當(dāng)修復(fù)時(shí)間達(dá)到10 d，已將Cr（VI）從土壤中基本去除的情況下，土壤中優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria（變形菌門），次優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes（厚壁菌門），與原土優(yōu)勢(shì)菌門相同。

在門水平上，優(yōu)勢(shì)菌一直是Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes和Actinobacteria，但是相對(duì)豐度則是有較大變化；對(duì)比是否添加丙三醇，微生物群落結(jié)構(gòu)在10 d時(shí)有著較大差異。對(duì)比Y和Cr樣品，雖然門水平看不出顯著差異，但從屬水平的菌落結(jié)構(gòu)來(lái)看Ramlibacter相對(duì)豐度迅速上升，該菌屬也是在重金屬環(huán)境下報(bào)道較多的一個(gè)優(yōu)勢(shì)種屬。在修復(fù)組中，隨著Microbacterium sp. BD6的加入，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生較大變化，從圖4-B中可以看到隨著修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，菌屬M(fèi)icrobacterium的相對(duì)豐度是不斷下降的。

2.4.2 菌株BD6在Cr（VI）污染土壤修復(fù)中的定殖 通過(guò)對(duì)菌株BD6在土壤中的qPCR檢測(cè)顯示，在最初48 h內(nèi) BD6在土壤中的數(shù)量會(huì)急劇減少，之后一直處于持續(xù)下降狀態(tài)，到15 d時(shí)，降低為最初接種量的3%以下，說(shuō)明菌株BD6在土壤中并不會(huì)成為優(yōu)勢(shì)菌。這與屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)（圖4-B）中顯示的微桿菌屬在群落中相對(duì)豐度持續(xù)下降的情況一致。

圖4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Structure composition of soil microbial community

3 討論

Cr（VI）污染土壤的生物修復(fù)具有經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，多種微生物已被報(bào)道用于土壤Cr（VI）修復(fù)，如硫酸鹽還原菌［16］、黑曲霉［6］、蠟樣芽胞桿菌［17］等。本課題組通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株BD6在液體培養(yǎng)基中具有高效Cr（VI）還原能力，于是本研究嘗試將該菌株用于土壤修復(fù)。菌株BD6為微桿菌屬，該菌屬應(yīng)用于Cr（VI）污染土壤修復(fù)還少見(jiàn)報(bào)道。由于土壤環(huán)境復(fù)雜，當(dāng)使用微生物修復(fù)土壤時(shí)，各方面因素都會(huì)對(duì)微生物修復(fù)土壤的效果產(chǎn)生影響，如接種量、Cr（VI）初始濃度、溫度和金屬離子等［18-19］。本研究在考察菌株BD6在液體培養(yǎng)基中還原特性基礎(chǔ)上［11］，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了菌株在土壤中還原Cr（VI）的特性和條件，與菌株BD6在液體中的Cr（VI）還原條件相比，隨著溫度升高在液體或土壤中都有著還原率升高的趨勢(shì)，但40℃時(shí)土壤中還原率明顯好于液體還原；重金屬離子在液體還原中對(duì)還原的抑制大小排序?yàn)镸n2+＞Cd2+＞Zn2+＞Ni2+，Cu2+有促進(jìn)還原的作用，而在土壤中對(duì)還原的抑制效果沒(méi)有液體中明顯且抑制大小順序?yàn)镃u2+＞Cd2+＞Ni2+＞Mn2+＞Zn2+。這可能與微生物所處的不同環(huán)境介質(zhì)有關(guān)。Cr（VI）在土壤中的老化時(shí)間也可能會(huì)影響鉻在土壤中的形態(tài)［20］，而微生物對(duì)不同形態(tài)的Cr（VI）去除效率可能不同［21］。本研究中菌株BD6對(duì)不同老化時(shí)間的土壤還原效率相近，由此可見(jiàn)，其適用于長(zhǎng)時(shí)間受到Cr（VI）污染的場(chǎng)地中。

在Cr（VI）污染土壤生物修復(fù)方面，有研究表明外源電子供體類物質(zhì)添加會(huì)起到較好的促進(jìn)Cr（VI）還原的作用［22-23］。各種電子供體存在情況下微生物對(duì)鉻還原活性不同，可能是因?yàn)檫€原酶對(duì)不同電子供體的電子接受能力不同［24］。微生物會(huì)對(duì)更有利于其生長(zhǎng)的電子供體進(jìn)行優(yōu)先利用，因此提高菌株Cr（VI）還原能力需選擇合適的電子供體［25-26］。本研究根據(jù)菌株BD6在液體培養(yǎng)基中可以通過(guò)添加電子供體來(lái)提升Cr（VI）還原效率的特點(diǎn)，在土壤修復(fù)中也嘗試了相應(yīng)的各種電子供體。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)在土壤中添加丙酮酸鈉作為電子供體效果最好，而在液體培養(yǎng)基中使用丙三醇作為電子供體效果更佳，這可能跟土壤環(huán)境中丙酮酸鈉更易被菌株利用有關(guān)。因此，應(yīng)選用易分散、溶解性較好的物質(zhì)作為微生物還原土壤中Cr（VI）的外源電子供體。但是考慮到修復(fù)成本等原因，本研究在土壤修復(fù)中依舊使用丙三醇作為電子供體。

在土壤修復(fù)中也要考慮外源物質(zhì)添加后對(duì)土壤長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響，特別是對(duì)土著微生物群落的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在Cr（VI）污染土壤中添加菌株BD6的修復(fù)過(guò)程中，若添加丙三醇則會(huì)對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生一定影響，短時(shí)間內(nèi)能提高微生物豐度和多樣性，可能一方面作為電子供體加快了Cr（VI）的還原從而降低土壤毒性，另一方面丙三醇作為外加碳源也能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。同時(shí)，從群落結(jié)構(gòu)角度看，是否添加電子供體也有著較大的影響，在門水平上10 d時(shí)有無(wú)電子供體添加顯示出較大差異，15 d兩者有趨向一致的趨勢(shì)；在屬水平上，96 h兩者群落結(jié)構(gòu)由于BD6作為優(yōu)勢(shì)菌存在，兩者差異不顯著，而當(dāng)10 d后，隨著菌株BD6豐度逐漸減少，是否添加電子供體則對(duì)群落結(jié)構(gòu)有較大影響。由圖4-B可以看出菌株BD6在96 h左右的短期內(nèi)一直是優(yōu)勢(shì)菌群，起到了重要的修復(fù)作用，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)菌株BD6迅速減少變?yōu)榉莾?yōu)勢(shì)菌，通過(guò)qPCR也進(jìn)一步證實(shí)了菌株BD6在土壤中的這種定殖規(guī)律和變化趨勢(shì)，說(shuō)明利用菌BD6修復(fù)土壤并不會(huì)使菌株長(zhǎng)期存活于土壤中并與土著微生物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。

盆栽實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮容^直觀地反映出污染土壤的毒性，本研究以大豆這種常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)作物作為盆栽研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)不同濃度Cr（VI）污染土壤會(huì)對(duì)大豆生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，大豆植株會(huì)將鉻吸收入體內(nèi)，且與土壤的Cr（VI）濃度呈正相關(guān)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［15］得出的結(jié)論相似。本研究將BD6用于土壤污染修復(fù)，最終得到了良好的修復(fù)效果，即植株生長(zhǎng)良好，體內(nèi)吸收鉻的量顯著降低，分析原因應(yīng)該是Cr（VI）被還原為低毒性的Cr（III），Cr（III）更易被沉淀和固化下來(lái)而不易被植物吸收。

4 結(jié)論

菌株Microbacterium sp. BD6修復(fù)Cr（VI）污染土壤可以明顯改善大豆植株生長(zhǎng)情況，且降低植株體內(nèi)鉻含量，能夠提升土壤中微生物多樣性，對(duì)土壤質(zhì)量有明顯的改善作用。菌株BD6數(shù)量在修復(fù)土壤Cr（VI）污染過(guò)程中一直呈下降趨勢(shì)，不會(huì)一直成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)土著微生物群落造成持續(xù)影響。