不同氮源及氮濃度對(duì)海水馴化藻株Asterarcys sp.生長(zhǎng)及生化組成的影響

衛(wèi)華寧 王靈 李濤 王娜 吳華蓮 向文洲

（1. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣州 511458；4. 中國(guó)科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院，廣州510301）

微藻是一類光合自養(yǎng)生物，是生態(tài)系統(tǒng)中初級(jí)生產(chǎn)力的重要組成部分，依靠光合作用吸收太陽(yáng)能，將無機(jī)環(huán)境中的能量同化，維系著整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定［1］。微藻因其富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、蝦青素和類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)，同時(shí)具有分布廣泛、生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)不受季節(jié)影響等優(yōu)勢(shì)，近些年來被廣泛用于水產(chǎn)餌料、保健食品、藥品和化妝品等行業(yè)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。

Asterarcys sp.隸屬綠藻門（Chlorophyta）、綠球藻 綱（Chlorococcales）、 環(huán) 藻 目（Sphaeropleales）、柵藻科（Scenedesmaceae）。Hegewald等（1992）首次在古巴分離發(fā)現(xiàn)該微藻，并于2010年將Asterarcys屬與其他28屬一起歸屬于柵藻科［3］。Hong等［4］對(duì)Asterarcys quadricellulare KNUA020培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，其富含 C18：3 ω3（α-亞麻酸，ALA）。Varshney等［5］研究發(fā)現(xiàn)該藻株可耐受高達(dá)43℃的高溫、高光強(qiáng)、高CO2和NO水平，在高CO2條件下，細(xì)胞干重量的55%-71%由碳水化合物組成，NO和CO2可導(dǎo)致細(xì)胞中脂質(zhì)含量增加為細(xì)胞干重的44%-46%，該藻株具高油脂含量，可用于微藻生物柴油的生產(chǎn)，兼養(yǎng)有利于提高該藻的蛋白質(zhì)含量，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白來源［6］。

氮是構(gòu)成微藻生物體的重要元素之一，是藻細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，微藻可利用多種形式的氮源，主要包括硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)氮，不同形式的氮源和氮濃度影響著藻類的吸收代謝機(jī)制，從而影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)及其生化組成［7］。適宜的氮源，在氮水平充足等有利生長(zhǎng)條件下，微藻可以快速生長(zhǎng)繁殖，獲得較高生物量，細(xì)胞合成的脂質(zhì)主要為用于在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建膜的極性脂質(zhì)（糖脂GLs和磷脂PLs），氮缺乏或限制可以誘導(dǎo)微藻脂質(zhì)和碳水化合物積累，也會(huì)改變細(xì)胞脂肪酸的組成［8-9］。Illman等［10］研究發(fā)現(xiàn)低氮（3 mmol/L）顯著提高小球藻（Chlorella vulgaris）總脂含量，比對(duì)照組提高兩倍（40% DW）。Arumugam等［11］發(fā)現(xiàn)，雙對(duì)柵藻（Scenedesmus bijugatus）可利用多種形式氮源（硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)氮等），在不同氮濃度（0.5、10.0、15.0、20.0 mmol/L）下雙對(duì)柵藻的生長(zhǎng)差異顯著。吳桂秀等［12］研究發(fā)現(xiàn)在氮充足（18 mmol/L）條件下標(biāo)志鏈帶藻（Desmodesmus insignis）可積累占干重55.33%的淀粉，而在氮缺乏（3 mmol/L）條件下，其藻細(xì)胞總脂含量上升，淀粉含量下降至干重41.56%。因此，不同氮源及氮濃度是影響微藻生長(zhǎng)及生化組成的重要因素。

海水富含各種無機(jī)鹽，且我國(guó)海水資源豐富，利用海水培養(yǎng)微藻既能緩解緊張的淡水資源，又可以大幅度減少養(yǎng)殖肥料的使用而降低生產(chǎn)成本，還可提高微藻產(chǎn)量及品質(zhì)［13］。目前國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的Asterarcys sp.藻株均為淡水藻株，尚未發(fā)現(xiàn)該藻株海水馴化培養(yǎng)的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)室于室外高堿性環(huán)境培養(yǎng)的藍(lán)藻Plectonema sp.開放池中分離純化出一株污染雜藻Asterarcys sp.。前期研究發(fā)現(xiàn)，該藻具有生長(zhǎng)速率快、能適應(yīng)高pH環(huán)境并富含多種高附加值產(chǎn)品，具有較高的開發(fā)潛力。經(jīng)過長(zhǎng)期海水馴化，獲得該藻株全海水馴化株，其可在鹽度為30 ‰的天然海水環(huán)境下正常生長(zhǎng)（結(jié)果未發(fā)表）。本研究以Asterarcys sp.SCSIO-44020海水馴化藻株為研究對(duì)象，通過測(cè)定硝酸鈉、尿素、碳酸氫銨3種氮源不同氮濃度下的生物質(zhì)濃度、總糖、總蛋白質(zhì)、總脂含量、脂類分級(jí)、脂肪酸組成等指標(biāo)，研究其生長(zhǎng)及生化組成分布規(guī)律，旨為高值化開發(fā)海水馴化藻株Asterarcys sp.SCSIO-44020提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)藻株是中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所微藻資源與生物技術(shù)課題組在室外高堿性環(huán)境培養(yǎng)的藍(lán)藻Plectonema sp.開放池中分離的一株污染雜藻，經(jīng)分離純化及18S rDNA測(cè)序，初步確定為Asterarcys sp.，將其進(jìn)行海水馴化后保藏于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所海藻資源與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，藻種編號(hào)為Asterarcys sp.SCSIO-44020。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 以鹽度為30‰的海水改良1-ZSNT培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基［14］，設(shè)置硝酸鈉、尿素、碳酸氫銨3種氮源，每種氮源設(shè)3個(gè)氮濃度（換算成N濃度相同），分別為3 mmol/L、6 mmol/L及18 mmol/L，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

將藻種接入改良ZSNT培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)種培養(yǎng)，待藻細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期（8 d左右），離心收集藻細(xì)胞，用無氮的改良ZSNT培養(yǎng)基反復(fù)沖洗3次，然后重懸浮于裝有不同氮源及氮濃度培養(yǎng)基的小型柱式光反應(yīng)器中，有效培養(yǎng)體積為300 mL（? 3.0 cm× 60 cm），初始接種OD680nm約為0.5。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，熒光燈提供單側(cè)光源，24 h持續(xù)光照，光強(qiáng)前 4 d 由 30 μmol photons/（m2·s）逐漸增加至 200 μmol photons/（m2·s），之后保持在 200 μmol photons/（m2·s），連續(xù)鼓入CO2加富的壓縮空氣提供碳源及攪拌作用（CO2∶Air，1∶99）。培養(yǎng)周期為16 d，每2 d測(cè)定生物質(zhì)濃度，培養(yǎng)周期結(jié)束后離心收集藻細(xì)胞，經(jīng)冷凍干燥后測(cè)定總糖、總脂、總蛋白含量及脂肪酸和色素組成。

1.2.2 生物質(zhì)濃度的測(cè)定 采用干重法進(jìn)行測(cè)定，取3-10 mL藻液（0-4 d、6-10 d、12-16 d采樣量分別為10、5、3 mL），用已在80℃下烘干至恒重的水系混合纖維濾膜（Φ50 mm，0.45 μm）抽濾，去離子水沖洗藻細(xì)胞3次，再置于烘箱中80℃下烘干至恒重，差減法得藻細(xì)胞干重（DW，g/L）。

1.2.3 總脂測(cè)定與分級(jí) 采用改良的Khozin-Goldberg 法提取總脂并測(cè)定含量［15］；總脂分級(jí)采用Christie的方法［16］，依次以氯仿、丙酮和甲醇作為流動(dòng)相，用硅膠柱純化油脂，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑Q重分別得到中性脂、糖脂和磷脂重量，計(jì)算其相對(duì)含量。

1.2.4 總蛋白質(zhì)測(cè)定 采用凱氏定氮法［17］測(cè)定總蛋白質(zhì)含量，以蛋白質(zhì)的F值為 6.25 計(jì)算。

1.2.5 總糖測(cè)定 稱取10 mg凍干藻粉加入5 mL 0.5 mol/L硫酸，80℃水浴攪拌提取1 h，室溫下5 000 r/min離心10 min，收集上清至50 mL容量瓶中。反復(fù)抽提 3 次，合并上清，定容即得到總糖提取液；采用苯酚硫酸法，以D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定總糖含量［18］。

1.2.6 脂肪酸測(cè)定 稱取25 mg凍干藻粉于10 mL螺口玻璃離心管中，加入2 mL 2%H2SO4無水甲醇:甲苯（90∶10，V/V），充氮?dú)夂螅?0℃水浴加熱攪拌1.5 h，后分別加入1 mL去離子水和1 mL 正己烷，震蕩后，3 000 r/min離心 10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，N2吹干，再加入1 mL 正己烷（含有C17 標(biāo)準(zhǔn)品）并用孔徑為0.22 μm 的濾膜過濾轉(zhuǎn)移至1.5 mL棕色小瓶密封，利用氣相色譜（GC）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 色素測(cè)定 稱取10 mg藻粉，置于10 mL玻璃離心管中，加入5 mL丙酮，避光冰浴攪拌提取1-2 d，直至藻渣變白，離心收集上清得到色素提取液。采用分光光度法測(cè)定總?cè)~綠素、總類胡蘿卜素含量［19］、HPLC 法［14］測(cè)定色素組成。

1.2.8 產(chǎn)量計(jì)算 總脂產(chǎn)量（g/L）=M1×L1；總糖產(chǎn)量（g/L）=M1×L2；總蛋白質(zhì)產(chǎn)量（g/L）=M1×L3；總類胡蘿卜素產(chǎn)量（mg/L）=M1×L4×1 000。M1為收藻時(shí)微藻的生物質(zhì)濃度（g/L），L1、L2、L3、L4為相對(duì)應(yīng)的總脂、總糖、總蛋白質(zhì)、總類胡蘿卜素含量（% DW）。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 使用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA）和 t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水平 = 0.05，P ＜ 0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源及濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，經(jīng)過 0-4 d的生長(zhǎng)延滯期，從第4天開始，實(shí)驗(yàn)藻細(xì)胞在3種不同氮源中均開始迅速增長(zhǎng)，第14天后，藻細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。在同一氮源不同濃度培養(yǎng)基中藻細(xì)胞生長(zhǎng)差異顯著（P ＜0.05），均表現(xiàn)出隨著氮濃度的升高藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率也隨之升高。0-8 d相同氮濃度不同氮源培養(yǎng)基中藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率表現(xiàn)為尿素最大，硝酸鈉次之，碳酸氫銨最小，但8 d后，以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中獲得最高生長(zhǎng)速率。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在以硝酸鈉為氮源培養(yǎng)基中，3.0 mmol/L、6.0 mmol/L和18.0 mmol/L 三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為3.35 g/L、5.02 g/L和7.78 g/L；在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，3.0 mmol/L、6.0 mmol/L 和 18.0 mmol/L 三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為 3.63 g/L、5.13 g/L 和 6.61g/L。在以碳酸氫銨為氮源的培養(yǎng)基中，3.0 mmol/L、6.0 mmol/L 和18.0 mmol/L 三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為1.95 g/L、2.90 g/L和5.33 g/L。由上述分析可知，以硝酸鈉為氮源，濃度為18.0 mmol/L 時(shí)，Asterarcys sp.取得了高于其他氮源和氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度（7.78 g/L）。

圖1 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the growth of Asterarcys sp. SCSIO-44020

2.2 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂含量的影響

2.2.1 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂積累的影響 對(duì)不同氮源及氮濃度條件下藻細(xì)胞進(jìn)行油脂提取和分析發(fā)現(xiàn)，在以硝酸鈉和尿素為氮源的培養(yǎng)基組中，氮濃度3.0 mmol/L組與6.0 mmol/L組藻細(xì)胞總脂含量無顯著差異（P＞0.05），而低氮組（3.0 mmol/L、6.0 mmol/L）均與高氮組（18.0 mmol/L）總脂含量存在顯著性差異（P＜0.05），一定程度的氮限制有利于Asterarcys sp.積累油脂（圖2）。但以碳酸氫銨為氮源的培養(yǎng)基中，3種濃度氮源對(duì)藻細(xì)胞總脂含量無顯著差異（P＞0.05），藻細(xì)胞在以3.0 mmol/L碳酸氫銨為氮源培養(yǎng)基中獲得最高總脂含量（46.78% DW）（圖2）。

圖2 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂含量的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen sources and concentrations on total lipid content of Asterarcys sp. SCSIO-44020

2.2.2 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020脂類組分的影響 按照總脂分級(jí)方法，對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020的總脂進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果如圖3所示，該藻株中性脂比例較高，所有實(shí)驗(yàn)組均高于總脂的80%，3種氮源條件下，3.0 mmol/L處理組的中性脂比例顯著高于18.0 mmol/L處理組（P＜0.05），然而與6.0 mmol/L處理組相比無明顯差異（P＞0.05），硝酸鈉、尿素和碳酸氫銨在3.0 mmol/L條件下的中性脂比例分別占總脂的89.38%、91.17%和93.57%，而在18.0 mmol/L條件下中性脂的比例均未超過83%。

圖3 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂組分的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the lipid components of Asterarcys sp.SCSIO-44020

2.3 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總糖積累的影響

不同氮源和氮濃度培養(yǎng)下，Asterarcys sp.SCSIO-44020的總糖含量變化如圖4所示。在以硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)，總糖的含量與氮濃度呈負(fù)相關(guān)，總糖含量隨著氮濃度的增加而顯著下降（P＜0.05），當(dāng)?shù)獫舛葹?.0 mmol/L時(shí)，碳總糖含量最高分別為28.98% DW和29.70% DW；在以碳酸氫銨為氮源時(shí)，總糖含量隨氮濃度無明顯變化規(guī)律，在6.0 mmol/L時(shí)獲得該氮源最高含糖量（27.54% DW）。

圖4 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總糖含量的影響Fig. 4 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the carbohydrates content of Asterarcys sp.SCSIO-44020

2.4 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020粗蛋白含量的影響

利用凱式定氮法對(duì)實(shí)驗(yàn)藻株的粗蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，在3種不同氮源培養(yǎng)基中，總蛋白質(zhì)含量隨著初始氮濃度的增加而顯著增加（P＜0.05），均在18.0 mmol/L 的初始氮濃度條件下達(dá)到最高，在3.0 mmol/L初始氮濃度條件下總蛋白質(zhì)含量最低。在以尿素為氮源，18 mmol/L條件下藻細(xì)胞獲得最高蛋白質(zhì)含量（17.61% DW）。

圖5 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020粗蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the protein content of Asterarcys sp. SCSIO-44020

2.5 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020脂肪酸組成的影響

Asterarcys sp.脂肪酸組成如表1顯示，其脂肪酸主要包括：C16：0（棕櫚酸）和C18：0（硬脂酸）兩種飽和脂肪酸，C16：1（棕櫚油酸）和C18：1（油酸）兩種單不飽和脂肪酸以及C18：2（亞油酸）和C18：3（亞麻酸）兩種多不飽和脂肪酸，其中C18：1的含量遠(yuǎn)高于其它脂肪酸。在以硝酸鈉和尿素為氮源組中，隨著氮濃度的升高，藻細(xì)胞中C16：0、C18：1和 C18：3的含量顯著下降（P＜0.05），C18：2的含量顯著上升（P＜0.05）；而在以碳酸氫銨為氮源的處理組中，隨著氮濃度的升高，藻細(xì)胞中C18：0和C18：1的含量升高，C16：1和C18：3的含量降低。在以碳酸氫銨為氮源18.0 mmol/L條件下C18：1的含量最高為38.75% TFA；在以尿素為氮源18.0 mmol/L條件下C18：2含量最高為17.79% TFA，3.0 mmol/L條件下C18：3含量最高為10.87% TFA。

表1 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020脂肪酸組成的影響Table 1 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the fatty acid composition of Asterarcys sp. SCSIO-44020

2.6 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020色素組成的影響

通過HPLC法對(duì)培養(yǎng)末期各處理組色素成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Asterarcys sp. SCSIO-44020主要由葉綠素a、葉綠素b、蝦青素、葉黃素、角黃素等色素組成。通過分光光度法對(duì)各處理組色素的總含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6和圖7所示，在3種氮源處理組中，總?cè)~綠素含量均隨著氮濃度的升高而顯著升高（P＜0.05），且同等氮濃度下，硝酸鈉實(shí)驗(yàn)組高于尿素實(shí)驗(yàn)組高于碳酸氫銨實(shí)驗(yàn)組，這與培養(yǎng)過程藻細(xì)胞生物質(zhì)積累趨勢(shì)相符。在以硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)，總類胡蘿卜素的含量與氮濃度呈正相關(guān)（P＜0.05），總類胡蘿卜素含量隨著氮濃度的增加而升高，氮濃度為18.0 mmol/L時(shí)，總類胡蘿卜素含量分別為0.39% DW和0.38% DW；在以碳酸氫銨為氮源氮濃度為18.0 mmol/L時(shí)總類胡蘿卜素含量為0.21% DW。

圖6 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總?cè)~綠素含量的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the chlorophyll content of Asterarcys sp.SCSIO-44020

圖7 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020類胡蘿卜素含量的影響Fig. 7 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the carotenoids content of Asterarcys sp.SCSIO-44020

2.7 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂、總糖、總蛋白質(zhì)和總類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

海水馴化藻株Asterarcys sp. SCSIO-44020在不同氮源及氮濃度處理組培養(yǎng)至16 d，其總脂、總糖、總蛋白質(zhì)及總類胡蘿卜素產(chǎn)量如表2所示，在3種氮源處理組中，受氮濃度對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，其總脂、總糖、總蛋白質(zhì)及總類胡蘿卜素產(chǎn)量均隨著氮濃度的升高而顯著升高（P＜0.05），其總脂、總糖、總蛋白質(zhì)、總類胡蘿卜素產(chǎn)量均在氮源為硝酸鈉氮濃度為18 mmol/L時(shí)獲得最高產(chǎn)率分別為2.79 g/L、1.71 g/L、1.22 g/L和30.29 mg/L。

表2 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020總脂、總糖、總蛋白質(zhì)和總類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the total lipid，carbohydrates，protein and carotenoids yields of Asterarcys sp.SCSIO-44020

3 討論

3.1 不同氮源及氮濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020生長(zhǎng)的影響

氮是微藻生長(zhǎng)和繁殖所必需的大量元素之一，是藻細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸形成的基本元素，氮元素還是細(xì)胞中所有結(jié)構(gòu)和功能蛋白的重要組成部分，在藻類的生長(zhǎng)代謝中起著重要的作用［20］。一般認(rèn)為單細(xì)胞藻類對(duì)還原態(tài)銨鹽的利用能力優(yōu)于氧化態(tài)硝酸鹽，這主要是由于氧化態(tài)硝酸鹽進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)，還需要經(jīng)硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶還原成氨后才能被利用，這樣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)需要更多的還原壓力，會(huì)消耗掉更多能量［21］。不同的藻對(duì)不同形態(tài)的氮利用能力不同，且對(duì)氮濃度的要求也不同，硝態(tài)氮（硝酸鈉）是紫球藻（Porphyridium purpareum）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）生長(zhǎng)最適氮源［22］，真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）在以銨態(tài)氮（碳酸氫銨）為氮源，可獲得最大生物量［23］，而熱帶海洋微藻（Demodesmus sp. WC08）在以有機(jī)銨態(tài)氮（尿素）為氮源的培養(yǎng)基中可獲得最大生物量，在以銨態(tài)氮（氯化銨）為氮源時(shí)無法正常生長(zhǎng)［24］。

本研究設(shè)置硝酸鈉、尿素、碳酸氫銨3種氮源以及3、6、18 mmol/L三種氮濃度，研究結(jié)果顯示，3種氮源中生物質(zhì)濃度均隨著氮濃度的升高而升高，在以硝酸鈉為氮源，18 mmol/L條件下實(shí)驗(yàn)藻株生物質(zhì)濃度最大，而在以碳酸氫銨為氮源實(shí)驗(yàn)組中微藻生長(zhǎng)受到抑制，相同氮濃度下生物質(zhì)濃度遠(yuǎn)低于硝酸鈉和尿素組，這可能是過多銨離子無法迅速轉(zhuǎn)移到氨基酸合成中去，從而引起藻細(xì)胞銨中毒，進(jìn)而影響微藻的生長(zhǎng)［25］。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，較低氮濃度（3、6 mmol/L）時(shí)藻細(xì)胞生物質(zhì)濃度與同氮濃度下硝酸鈉組無顯著差異，而在高氮濃度（18 mmol/L）時(shí)，其生物質(zhì)濃度顯著低于硝酸鈉組，這可能與尿素提供氮源時(shí)先水解為銨離子后才能被藻細(xì)胞吸收利用，而過高的銨離子會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。

3.2 不同氮源及濃度對(duì)Asterarcys sp. SCSIO-44020代謝產(chǎn)物的影響

不同的氮源及氮濃度不僅影響微藻的生長(zhǎng)和繁殖，還會(huì)影響藻細(xì)胞的合成代謝進(jìn)而影響其生化組分［26］。營(yíng)養(yǎng)缺乏（特別是氮源缺乏）是誘導(dǎo)微藻合成次生代謝物的常用方法。低氮脅迫會(huì)使微藻部分類囊體膜降解、?；饷富钚越档蛷亩鴮?dǎo)致磷脂水解作用減弱，而此時(shí)二酰甘油?；D(zhuǎn)化酶活性增強(qiáng)，從而促使?；o酶A形成三酰甘油，積累油脂，特別是中性脂［2］。劉金麗等［27］研究表明氮脅迫條件下產(chǎn)油柵藻（Scenedesmus dimorphus）油脂含量由22.4%DW 提高到36.3%DW；趙萍［28］對(duì)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）培養(yǎng)條件優(yōu)化，經(jīng)缺氮誘導(dǎo)產(chǎn)油，油脂含量由22.19%DW升高至31.02%DW；本研究中，在以硝酸鈉和尿素為氮源低氮脅迫（3、6 mmol/L）下，總脂含量由32% DW提高到44% DW，該現(xiàn)象與這些文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符，可籍此大幅改善其油脂開發(fā)潛力。以碳酸氫銨為氮源時(shí)，3個(gè)濃度組總脂含量變化不大，均高達(dá)42%-46% DW，主要原因可能是以碳酸氫銨為氮源時(shí)，微藻生長(zhǎng)受到抑制，其它代謝也受抑制，且抑制程度隨著氮濃度的增加而增加，從而使其在高氮培養(yǎng)中繼續(xù)積累油脂。

在以硝酸鈉和尿素為氮源低氮條件下，Asterarcys sp.總糖含量較氮源充足條件下可提高38%，低氮條件下該藻同時(shí)積累大量油脂和多糖，二者總含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的72.15%，油脂和糖都是細(xì)胞內(nèi)重要的能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)，其含量是衡量微藻生物能源化的重要指標(biāo)。

本研究3種氮源高氮條件下藻細(xì)胞均促進(jìn)葉綠素、總類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)積累，這與已有文獻(xiàn)研究結(jié)果一致［20，24，28］，同時(shí)也與對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用相一致，說明在氮源充足下，有利細(xì)胞功能蛋白（酶）的積累，促進(jìn)葉綠素和初生類胡蘿卜素的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，提高生物質(zhì)產(chǎn)量。3種氮源之間的差異說明銨離子可能對(duì)Asterarcys sp.的色素和蛋白合成具有一定的抑制作用，從而抑制生長(zhǎng)，最終顯著降低各種產(chǎn)物的產(chǎn)量。

由于在18 mmol/L硝酸鈉濃度下Asterarcys sp. 的生物質(zhì)濃度最高，因此，無論其單一產(chǎn)物的含量是否在這一濃度下達(dá)到最高，本研究所有評(píng)價(jià)的產(chǎn)物（蛋白、多糖、油脂、色素）在該濃度下均達(dá)到所有實(shí)驗(yàn)組中的最高產(chǎn)量。因此，以該藻種生產(chǎn)這些產(chǎn)物的效率和成本綜合考慮，確定硝酸鈉為Asterarcys sp.培養(yǎng)的最佳氮源，18 mmol/L氮濃度為其最適氮濃度。

3.3 Asterarcys sp. SCSIO-44020的海水馴化及潛在價(jià)值

我國(guó)擁有豐富的海水資源，海洋可利用空間廣闊，且海水中富含各種營(yíng)養(yǎng)鹽，利用海水大規(guī)模培養(yǎng)微藻既能緩解緊張的淡水資源，又可以大幅度減少養(yǎng)殖肥料的使用而降低生產(chǎn)成本，海水馴化養(yǎng)殖微藻因具有規(guī)?；?、經(jīng)濟(jì)化等優(yōu)勢(shì)一直受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注［13］。郝宗娣等［29］通過一次性培養(yǎng)對(duì)網(wǎng)狀空星藻及柵藻進(jìn)行短期海水馴化，最終獲得可在25‰海鹽中生長(zhǎng)的馴化藻株，但目前成功由淡水藻株馴化成穩(wěn)定適應(yīng)海水環(huán)境并保持藻株優(yōu)良特性的案例不多，只見螺旋藻等極少數(shù)藻類有相關(guān)報(bào)道［30］。本研究所用藻株是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的天然海水逐級(jí)馴化培養(yǎng)，并經(jīng)過單株分離篩選，從而獲得生長(zhǎng)良好、性狀穩(wěn)定的全海水馴化藻株，其可在鹽度為30‰的天然海水中正常生長(zhǎng)。

海水馴化藻株Asterarcys sp. SCSIO-44020在以硝酸鈉為氮源氮濃度為18 mmol/L條件下可獲得7.78 g/L生物質(zhì)濃度。低氮脅迫下藻細(xì)胞可積累大量油脂（圖2），且中性脂比例升高（圖3），流動(dòng)性好，在生物能源及食品油脂等行業(yè)具有極大的開發(fā)利用前景。高氮條件下有利于藻細(xì)胞積累蛋白質(zhì)及總類胡蘿卜素，Singh等［31］在優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，認(rèn)為該藻可作為生產(chǎn)類胡蘿卜素的新來源，在本研究中類胡蘿卜素含量隨著氮濃度的升高而顯著增加，以硝酸鈉為氮源氮濃度18 mmol/L時(shí)獲得最大總類胡蘿卜素產(chǎn)量為30.29 mg/L，類胡蘿卜素在天然著色劑、抗氧化劑、中和劑和藥物等方面具有重要的作用，該海水馴化藻株有潛力成為工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的藻株。本研究還顯示海水藻株Asterarcys sp.脂肪酸主要由 C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2和18：3等組成，為生物柴油中最常見的脂肪酸組分，且由于該藻的脂肪酸主要為中性脂組分，因此，該藻適宜開發(fā)生物柴油。研究表明，油酸是動(dòng)物食物中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素，具有降血糖、血脂等作用，還可減輕危重癥病人的氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)［2］。本研究顯示該藻能夠積累相對(duì)含量達(dá)38%以上的油酸，可作為油酸的一種新型來源。此外，該藻富含亞油酸（17.79%TFA）和α-亞麻酸（10.87%TFA）等多不飽和脂肪酸，因此該藻在醫(yī)藥保健、飼料等行業(yè)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

低氮（3.0、6.0 mmol/L）條件下Asterarcys sp.SCSIO-44020積累儲(chǔ)能物質(zhì)（油脂、糖），以硝酸鈉為氮源更有利于該藻生長(zhǎng)和積累油脂和多糖；高氮（18.0 mmol/L）有利于誘導(dǎo)Asterarcys sp.蛋白質(zhì)、亞油酸及類胡蘿卜素的積累，并且以硝酸鈉為氮源18.0 mmol/L氮濃度下可獲得較高產(chǎn)量的總脂、總糖、總蛋白質(zhì)及總類胡蘿卜素。最終，以該藻種積累不同的高值化產(chǎn)品成本等綜合考慮，以硝酸鈉為氮源氮濃度18 mmol/L時(shí)培養(yǎng)海水馴化藻株Asterarcys sp.SCSIO-44020最優(yōu)。