藏藥藍(lán)花荊芥的抑菌活性

馬鈺潔，高生英，葉 菊*

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810007；3.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海西寧 810007）

藏藥“辛木頭勤”為唇形科荊芥屬植物藍(lán)花荊芥（Nepeta coerulescens Maxim.）的干燥全草，生長(zhǎng)于海拔2 000～4 800 m 的山坡、河灘、灌叢及林緣，為多年生草本，分布于西藏、青海、甘肅、四川等地。其味苦、微甘，性涼；功效為清瘡熱，清肝熱、生肌、止血；常用于肝炎、牙周炎等的治療[1]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯相和正丁醇相具有顯著的抑菌作用，進(jìn)一步從上述活性部位分離得到槲皮素、丹皮酚、N?反式阿魏酰酪胺、沒(méi)食子酸、鞣花酸、對(duì)羥基苯甲酸、齊墩果酸、β?谷甾醇等14 個(gè)單體成分[2]。洪志偉等[3]研究了槲皮素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及作用機(jī)制。黑育榮等[4]發(fā)現(xiàn)齊墩果酸對(duì)多種植物病原菌有抑制作用。閆莉等[5]研究了鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性及作用機(jī)制。文獻(xiàn)記載藍(lán)花荊芥具有治瘡瘍、濕疹、皮膚潰爛、出血等癥的作用，上述研究結(jié)果亦從藥理學(xué)方面證實(shí)了藍(lán)花荊芥有顯著的抑菌活性。然而筆者未見(jiàn)相關(guān)藍(lán)花荊芥抑菌成分及其藥效的研究報(bào)道。本研究采用醇提法、萃取法、柱層析法制備了10 種單體化合物，以紙片法[6]檢測(cè)以上成分對(duì)常見(jiàn)11 種細(xì)菌和3 種真菌的抑菌效果，為藍(lán)花荊芥在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考，為研制低毒、高效、優(yōu)質(zhì)的天然抑菌藥物提供依據(jù)。

1 材料、儀器和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原藥材于2018 年7 月采自青海省平安縣夏宗寺，由青海民族大學(xué)藥學(xué)院吉守祥教授鑒定為唇形科荊芥屬藍(lán)花荊芥。陰干，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌株均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（China Medical Culture Collection，CMCC）。1～11號(hào)為細(xì)菌，12～14號(hào)為真菌，詳見(jiàn)表1。

表1 供試病原菌

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

PL202?L型電子天平（上海梅特勒?托利多儀器有限公司），SHB?Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），N?1100V?W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SW?CJ?2FD型超潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），MJX?160B?Z型霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SPX?250B?Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

齊墩果酸、熊果酸、槲皮素、鞣花酸、沒(méi)食子酸、β?谷甾醇、木犀草素、對(duì)羥基苯甲酸、丹皮酚、蘆丁（自制，純度≥98%）；兩性霉素、慶大霉素、氨芐青霉素鈉（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、改良馬丁氏培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇（分析純，天津市紅巖試劑化工廠）；高純水（青藏高原植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試樣品制備

取藍(lán)花荊芥藥材9 kg，粉碎，95%乙醇水浴溫?zé)峤?4 h，過(guò)濾，減壓濃縮制膏。取浸膏適量，加水溶散，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同極性部位。采用柱層析法從乙酸乙酯相和正丁醇相分離純化得到10 個(gè)單體化合物。稱取各單體化合物0.20 mg，分別用100μL DMSO溶解，備用。

2.2 菌、孢子懸液及混菌平板制備

將細(xì)菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。將真菌菌種接種到改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。

將細(xì)菌培養(yǎng)物移至100 mL、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，制成濃度為108 cfu/mL 的菌懸液。將真菌培養(yǎng)物移至5 mL、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（含0.05%(V/V)吐溫80），并洗脫孢子。用移液槍吸取孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，加入100 mL、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（含0.05%(V/V)吐溫80）中，制成濃度為108 cfu/mL的孢子懸液。

取無(wú)菌培養(yǎng)皿，注入培養(yǎng)基20 mL，放置水平臺(tái)面上使其凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱至48～50 ℃（芽孢可至60 ℃），加入菌懸液或孢子懸液2 mL，搖勻。每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入5 mL 上述培養(yǎng)菌，使其在底層上均勻攤布，作為菌層，放置在水平臺(tái)上冷卻。作為陰性對(duì)照，備用。

2.3 活性測(cè)試

2.3.1 抑菌活性的初篩

取無(wú)菌培養(yǎng)皿，注入培養(yǎng)基20 mL，凝固。取供試細(xì)菌懸液和真菌孢子懸液各2 mL，分別移至150 mL培養(yǎng)基中，混合均勻，吸取5 mL 至培養(yǎng)皿中，待其凝固，制得混菌平板。

無(wú)菌條件下，取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液潤(rùn)濕后的濾紙片，放至混菌平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d，記錄藥物的抗菌活性。

2.3.2 抑菌活性的復(fù)篩

按照“2.3.1”項(xiàng)同樣方式制備混菌平板。

取陽(yáng)性對(duì)照藥品兩性霉素B、氨芐青霉素鈉、硫酸慶大霉素適量，加入DMSO，分別制成2 .00 g/L 溶液。無(wú)菌條件下，取上述對(duì)照溶液及復(fù)篩試驗(yàn)樣品溶液潤(rùn)濕后的濾紙片，放至混菌平板上，供試細(xì)菌35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，供試真菌20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，計(jì)算相對(duì)抑菌率。相對(duì)抑菌率=（樣品平均抑菌直徑?陰性對(duì)照平均抑菌直徑）/陽(yáng)性對(duì)照平均抑菌直徑×100%。

2.3.3 最小抑菌濃度的確定（MIC）

按照“2.3.1”項(xiàng)同樣方式制備混菌平板。

取復(fù)篩藥物適量配制成2.0、1.0、0.5、0.25 g/L 濃度梯度的溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)同種方式制備混菌平板。取上述濃度復(fù)篩藥物溶液潤(rùn)濕后的濾紙片置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，并確定最小抑菌濃度。

3 結(jié)果

3.1 抑菌活性初篩結(jié)果

對(duì)藍(lán)花荊芥極性部位分離純化后的單體化合物抑菌活性進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藍(lán)花荊芥單體化合物抑菌活性初篩結(jié)果

如表2 所示，槲皮素、鞣花酸、對(duì)羥基苯甲酸、丹皮酚、沒(méi)食子酸對(duì)釀酒酵母菌有較強(qiáng)的抑菌作用；齊墩果酸對(duì)蠟狀芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用。β?谷甾醇、熊果酸、蘆丁、木犀草素對(duì)供試菌并無(wú)抑制作用。其中鞣花酸對(duì)甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌都有顯著的抑菌活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)許多多酚類化合物具有廣譜的抑菌效果。C.Zongo 等[7]發(fā)現(xiàn)大黃多酚對(duì)葡萄菌屬具抑菌活性，并測(cè)定了最小抑菌濃度。陳孝娟等[8]發(fā)現(xiàn)石榴皮總多酚有一定的體外抑菌作用。黃素臻[9]發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚對(duì)大腸桿菌等3個(gè)菌種有抑菌效果并測(cè)定了其最小抑菌濃度。申凱等[10]發(fā)現(xiàn)菱莖多酚對(duì)金黃色葡萄球菌等5個(gè)菌種有抑菌活性，對(duì)腐敗希瓦氏菌及釀酒酵母菌較為敏感。鞣花酸作為一種多酚二內(nèi)酯成分，其抑菌效果可以更進(jìn)一步進(jìn)行研究。故將鞣花酸作為復(fù)篩化合物，對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)[11]。

3.2 抑菌活性復(fù)篩

根據(jù)初篩，鞣花酸有顯著抑菌效果，具有代表性。因此，分別以氨芐青霉素鈉、慶大霉素和兩性霉素B 作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。對(duì)照結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 鞣花酸抑菌活性復(fù)篩結(jié)果

如表3 所示，以氨芐青霉素鈉為陽(yáng)性對(duì)照，鞣花酸對(duì)甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為45.63%、56.11%；以慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照，鞣花酸對(duì)甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抑菌率分別為40.18%、52.09%、39.57%、43.57%、59.26%；以兩性霉素B為陽(yáng)性對(duì)照，鞣花酸對(duì)釀酒酵母菌的抑菌率為63.03%。故鞣花酸對(duì)釀酒酵母菌、甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌都有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)細(xì)菌大腸埃希菌和真菌釀酒酵母菌有較顯著的抑菌作用。根據(jù)上述復(fù)篩結(jié)果，測(cè)定鞣花酸對(duì)于上述6種供試菌的最小抑菌濃度，明確鞣花酸的抑菌效果。

3.3 最小抑菌濃度MIC的測(cè)定

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，為了進(jìn)一步明確鞣花酸對(duì)上述6種供試菌株的抑菌效果，對(duì)其進(jìn)行了最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度鞣花酸對(duì)不同菌種抑菌活性結(jié)果

如圖1 所示，隨著鞣花酸濃度的降低，對(duì)于不同供試菌的抑菌活性逐漸下降，濃度高于1.00 g/L 時(shí)均具有顯著抑菌活性。對(duì)于金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌，4 個(gè)濃度下抑菌活性均具有顯著性差異，濃度為0.25 g/L 時(shí)，無(wú)抑菌活性，可確定其最小抑菌濃度均為0.5 g/L；對(duì)于甲型副傷寒沙門菌，0.50 g/L 和0.25 g/L 濃度下的抑菌活性無(wú)顯著差異。然而0.50 g/L 濃度下具有抑菌活性，可確定其最小抑菌濃度為0.50 g/L。故鞣花酸對(duì)于以上4 種菌種敏感度較高，最小抑菌濃度均為0.50 g/L。對(duì)于大腸埃希菌和釀酒酵母菌，濃度為2.00、1.00、0.50 g/L 時(shí)，抑菌活性均具有顯著差異，濃度為0.50 和0.25 g/L 時(shí)不具抑菌活性，故鞣花酸對(duì)以上2 種菌種敏感度較低，最小抑菌濃度為1.00 g/L，較低濃度時(shí)無(wú)抑菌活性，只有較高濃度的樣品才能發(fā)揮抑菌作用。

4 討論

從正丁醇相分離純化的齊墩果酸、槲皮素、鞣花酸、對(duì)羥基苯甲酸、丹皮酚、乙酸乙酯相分離的沒(méi)食子酸具有較強(qiáng)的抑菌活性。正丁醇相分離的熊果酸、蘆丁、木犀草素、乙酸乙酯相分離的β?谷甾醇對(duì)供試菌并無(wú)抑制作用。鞣花酸純品對(duì)釀酒酵母菌、甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌均有顯著的抑制作用。以鞣花酸作為復(fù)篩藥物，對(duì)其抑菌活性進(jìn)行復(fù)篩，通過(guò)陽(yáng)性藥品對(duì)照，計(jì)算對(duì)6種菌種的抑菌率，并確定對(duì)甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌的MIC為0.50 g/L，而對(duì)大腸埃希菌和釀酒酵母菌敏感度較低，MIC為1.00 g/L。

藍(lán)花荊芥作為一種傳統(tǒng)藏藥，具有低毒、無(wú)污染、高效等特點(diǎn)，藏醫(yī)常用于治療瘡瘍、濕疹、皮膚潰爛等癥。馬凱琪等[12]從藍(lán)花荊芥中篩選得到了7 種抗單純皰疹1型病毒的提取物，但其相關(guān)抑菌活性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從藍(lán)花荊芥中分離得到的鞣花酸、齊墩果酸、槲皮素、丹皮酚、沒(méi)食子酸等均具有顯著的抑菌效果。張溪桐[13]發(fā)現(xiàn)丹皮酚對(duì)幽門螺旋桿菌有較好的抑菌活性且高劑量時(shí)抑菌率達(dá)82.90%。謝三都等[14]發(fā)現(xiàn)蓮蓬醇提物對(duì)沙門氏菌等3個(gè)菌種具有抑菌活性，且與槲皮素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。吳悠等[15]發(fā)現(xiàn)低濃度齊墩果酸和二甲亞砜聯(lián)合可有效抑制單一生物膜中糞腸球菌生長(zhǎng)。張錫嬌等[16]研究了沒(méi)食子酸對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌的抑菌作用及其作用機(jī)制。上述現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果和藏醫(yī)應(yīng)用證明藍(lán)花荊芥是一種優(yōu)良的抗菌抗病毒藏藥。眾所周知，銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，水體、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有該菌存在，是多種疾病感染的主要病原菌，而現(xiàn)用抗生素都對(duì)其有耐藥性，本研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)花荊芥富含的鞣花酸對(duì)于銅綠假單胞菌具有較好的抑菌效果，而且較為敏感，最小抑菌濃度為0.50 g/L。因此，將鞣花酸開(kāi)發(fā)成抗銅綠假單胞菌藥物是一種新的科研思路，也為從天然藥物中尋找新型抗菌先導(dǎo)化合物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。